核桃粕發酵乳菌種篩選及發酵條件優化研究

張洪禮，徐素云，彭邦遠，丁筑紅*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550000）

核桃粕發酵乳菌種篩選及發酵條件優化研究

張洪禮，徐素云，彭邦遠，丁筑紅*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550000）

該試驗對乳酸菌發酵核桃粕乳的不同菌株進行篩選，通過pH值、酸度及感官評定分析，從9株乳酸菌中篩選出嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）兩株優良菌種。研究兩株乳酸菌的復配比例，并與傳統發酵劑發酵的核桃粕乳進行品質對比。結果表明，以嗜酸乳桿菌：植物乳桿菌（1∶1）接種發酵后得到的發酵核桃粕發酵乳綜合品質最佳，其感官評分90分，氨基酸態氮含量57.0 mg/L，活菌總數7.35×107CFU/mL，經發酵后的營養價值明顯優于傳統發酵劑發酵的核桃粕乳。

發酵劑；核桃粕乳；嗜酸乳桿菌；植物乳桿菌

核桃（Juglans regialL.）是傳統經濟作物，我國核桃種植面積與產量均居世界首位，主要分布在云南、貴州、河北等地區，其中最具代表性的品種有貴州鐵核桃、河北核桃、山西汾陽核桃等［1］。核桃具有豐富的營養物質，核桃仁中蛋白質含量15%左右，脂肪含量約63%，且核桃油中的不飽和脂肪酸大多是人體必需的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、亞麻酸和花生烯酸占核桃油總量的90%［2］。核桃仁具有藥食同源的特性，有極高的營養保健和藥理作用，且其營養易于吸收，對哮喘病人十分有利，因此核桃被歷代養生學家和醫學家視為益壽精品［3］。

核桃粕是核桃榨油后的副產物，蛋白質含量豐富，可達到53.89%左右［4］，含18種氨基酸且人體必需的8種氨基酸配比合理，接近聯合國糧農組織（food and agriculture organization，FAO）和世界衛生組織（worldhealthorganization，WHO）規定的標準，加之脂肪含量低，完全符合老年人對食品“四足四低”的要求。目前核桃粕的開發主要用于提取生物活性肽，具有調節高血壓、增強抗氧化能力、緩解疲勞等功能［5-8］。在產品開發方面，其主要用于生產高蛋白核桃粉直接飲用或作為半成品添加在面包、蛋糕等各類糕點中，或生產低脂核桃乳或復合類低脂核桃乳，發酵乳有報道采用植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌等菌種進行發酵［9-11］。本研究多株食用乳酸菌種中篩選出最適菌種發酵，以期提高核桃粕發酵乳的營養及風味品質，以滿足市場各類人群的需要。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

核桃粕：市售飽滿、無損壞變質核桃，經壓榨去油后制得；RB-高脂乳花生奶穩定劑：上海健鷹食品科技研究所；無水乙醚、乙醇、丙酮、異辛烷：天津市賦予精細化工有限公司；氯化鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀：成都金山化學試劑有限公司；硫酸、鹽酸、硼酸：重慶聯瑞化工有限公司；千里香酚藍、冰乙酸：成都科龍化工試劑廠；淀粉：徐州人和居食品廠。所用試劑均為分析純。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）、雙發酵乳桿菌（Double fermentationofLactobacillus）、短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pedicoccus acidilacticii）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、德氏乳桿菌乳酸亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis）：貴州輕化工中心；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的復合菌株：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

平板計數瓊脂培養基：北京陸橋公司；MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基：實驗室自制。

1.2儀器與設備

HH-S26六孔恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；TU-1810型紫外-可見光分光光度計：北京普析通用儀器公司；MLS-3780MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：杭州亞旭生物科技有限公司；LD4-2型離心機：北京醫用離心機廠；SKD-800半微量凱式定氮儀：上海旦鼎國際貿易有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SHP-250型智能生化培養箱：上海興都儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1發酸乳加工工藝流程與操作要點

核桃粕汁的制備［12］：核桃粕與水以1∶8質量比，85℃浸泡30 min。

磨漿、過濾：采用160目篩網過濾得到核桃粕汁，加入0.2%復合穩定劑后調配均質。

滅菌：121℃恒溫15 min殺菌，冷卻至40℃以下，得到核桃粕汁。

菌株的活化與馴化［13］：將9株菌種進行活化復壯，以3%的接種量（V/V）接種到MRS培養基，培養條件為（37± 1）℃，以24 h內達到對數生長期（活菌數＞106CFU/mL）停止。將活化的9株菌種，分別在核桃乳與MRS培養基體積比0∶10、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、10∶0混合培養基中依次馴化，使菌株在100%樣液中能夠很好的生長（活菌數＞106CFU/mL）。

接種［14］：將馴化好的9株乳酸菌液，以3%的接種量（V/V）接種到裝有核桃粕汁樣液的錐形瓶中，

發酵：在42℃條件下培養發酵，分析發酵品質變化。

單菌株復配的研究：將實驗篩選出的優良菌株復配接種培養，通過理化指標與感官分值比較，篩選最佳復配比。

傳統發酵劑（保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的復合菌株）與實驗復合菌株均在接種量3%、培養溫度42℃、發酵時間6 h的條件下制備發酵核桃乳，比較發酵液的感官指標和理化指標［9］。

1.3.2分析方法

感官品質評定：邀請10名專家及工作人員對發酵核桃粕乳及發酵核桃粕復合乳的感官品質進行分析滿分100分，核桃粕發酵乳感官評定標準見表1。

表1　核桃粕發酵乳感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standard of fermented walnut dregs milk

感官評價模糊數學模型的建立［15］：以色澤、香氣、滋味、體態為因素集，以好、較好、一般、差為評語集，根據感官評定結果，建立4個單因素評價矩陣，用模糊數學評價方法對其進行分析。

（1）建立評判集

對各菌種發酵得到的核桃粕乳樣液分別編號后，根據表1對發酵核桃粕乳的品質要求進行模糊綜合評判，建立評判集。

因素集U=｛色澤u1，香氣u2，滋味u3，組織狀態u4｝；

評語集V=｛好，較好，一般，差｝；

（2）權重的確定

權重集X=｛0.25，0.25，0.30，0.20｝，即色澤25分，香氣25分，滋味30分，組織狀態20分，共100分。

（3）模糊關系綜合評判集

模糊關系綜合評判集Y=X×R，其中X為權重集，R為模糊矩陣。

加權綜合性評分法［16］：取實驗的考察指標為因素，則因素集U=｛U1、U2｝，其各因素隸書函數，如下：

選取評價函數為Di=a1U1i+a2U2i式中a1，a2權重系數。

1.3.3理化及微生物指標的測定

氨基酸態氮含量：電位滴定法；可溶性固形物含量：折光計法；pH值：參照GB/T 9724—2007《化學試劑pH值測定通則》中方法；酸度：參照GB 541334—2010《乳和乳制品酸度的測定》中方法。

菌落總數、大腸菌群、致病菌檢驗：參照GB/T4789.21—2003《食品衛生微生物學檢驗冷凍飲品、飲料檢驗》；乳酸活菌數的測定：參照GB 4789.35—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》。

2　結果與分析

2.1單菌株發酵pH、酸度變化結果分析

圖1　不同菌種發酵核桃粕發酵乳pH值變化曲線Fig.1 pH change curve of fermented walnut dregs milk with different strains

圖2　不同菌種發酵核桃粕發酵乳酸度變化曲線Fig.2 Acidity change curve of fermented walnut dregs milk with different strains

由圖1、圖2可知，不同菌種發酵核桃粕乳的pH值與時間成負相關，其中短乳桿菌的pH變化緩慢，其他8株菌株的pH值降低變化趨勢相似；不同菌種發酵酸度變化與時間大致呈正相關，其中短乳桿菌的產酸能力較差，而嗜酸乳桿菌桿菌在6 h時產酸能力最強，其他7株菌株的產酸能力的增強基本趨于一致。各菌種間pH和酸度差異顯著（P＜0.05）。

2.2不同菌株核桃粕發酵乳感官品質的模糊數學分析結果

2.2.1感官評定結果及建立模糊矩陣

10名評價員對9種不同菌種的核桃粕發酵乳樣液進行感官評定，結果見表2。

表2　單菌發酵核桃粕發酵乳樣液感官評定結果Table 2 Sensory evaluation results of fermented walnut dregs milk with single strain fermentation

由表2可知，以編號為1的發酵核桃粕乳樣液為例，可建立色澤、香氣、滋味和組織狀態，4個單因素的模糊評價矩陣：A色澤=［0.5 0.3 0.2 0.0］，A香氣=［0.5 0.4 0.1 0.0］，A滋味=［0.5 0.5 0.0 0.0］，A組織狀態=［0.4 0.4 0.2 0.0］。把上述對1號樣品的4個單因素評價結果寫成一個模糊矩陣，

同理可得1、2、3、4、5、6、7、8、9樣品的模糊矩陣分別為R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9。

2.2.2確定模糊關系綜合評判集

其中Y11=（0.25∧0.5）∨（0.25∧0.5）∨（0.3∧0.5）∨（0.2∧0.4）=0.25∨0.25∨0.3∨0.2=0.3，經歸一化處理后得Y1=（0.375，0.375，0.25，0.00）同理得：

Y2=（0.300，0.300，0.300，0.100），Y3=（0.273，0.273，0.273，0.182）

基于前文分析，從深層原則與基礎理念看，近代以來西方社會管理的基本要素或基本原則主要有兩個：一是個人主義，二是理性主義。

Y4=（0.273，0.273，0.273，0.182），Y5=（0.316，0.316，0.263，0.500）

Y6=（0.375，0.375，0.250，0.000），Y7=（0.300，0.300，0.300，0.100）

Y8=（0.273，0.273，0.273，0.182），Y9=（0.273，0.273，0.273，0.182）

2.2.3模糊綜合評判總分

設定感官特殊性：好為100分，較好為80分，一般為60分，較差為40分，可建立感官特殊性數集V=（100，80，60，40），則樣品的模糊綜合評判總分為：T=Y×V。得到1號核桃粕乳：T1=（0.375，0.375，0.25，0.00）×（100，80，60，40）=0.375× 100+0.375×8+0.25×60+0.00×40=82.50分；同理得編號為2、3、4、5、6、7、8、9的發酵核桃粕乳樣液模糊綜合評判結果為：T2=80.00分，T3=72.80分，T4=72.80分，T5=76.86分，T6= 82.50分，T7=80.00分，T8=72.80分，T9=72.80分。由此可選出嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌發酵的核桃乳樣總分較高，因此選擇這兩種菌進行復合菌株配比試驗。

2.3復合菌株最佳配結果分析

2.3.1感官評定結果

表3　復合菌發酵核桃粕發酵乳樣液感官評定結果Table 3 Sensory evaluation results of fermented walnut dregs milk with multi-strains fermentation

根據表3數據，分別對10、11、12樣品建立模糊矩陣為R10、R11、R12。

2.3.2確定模糊關系綜合評判集

對其進行歸一化處理后得Y10=（0.500，0.500，0.000，0.000），同理得Y11=（0.316，0.316，0.263，0.105），Y12=（0.300，0.300，0.300，0.100）。

2.3.3模糊綜合評判總分

設定感官特殊性：好為100分，較好為80分，一般為60分，較差為40分，可建立感官特殊性數集V=（100，80，60，40），則樣品的模糊綜合評判總分為：T=Y×V。得到10號核桃粕乳樣液的總分為：T10=（0.500，0.500，0.000，0.000）×（100，80，60，40）=0.500×100+0.500×80+0.000×60+0.000×40=90.00

同理得編號為11、12核桃粕乳樣液模糊綜合評判結果為：T11=76.86分，T12=76.00分。綜合以上模糊綜合評判結果可知，單一菌種嗜酸乳桿菌T1=82.50分，植物乳桿菌T6= 82.50分，得到嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌的單一菌種和復合菌種發酵的核桃粕乳樣液的感官質量優劣順序為：T10＞T1=T6＞T11＞T12。

2.3.4發酵核桃粕乳的理化指標

表4　復合菌發酵核桃粕發酵乳的理化指標Table 4 Physicochemical indexes of fermented walnut dregs milk with multi-strains

由表4可知，在相同發酵條件下，嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌接種比例為1∶1情況下，發酵品質較好，可溶性固形物為7.6%，酸度為80°T，氨基酸態氮含量為57.0 mg/L。通過發酵核桃粕乳驗證實驗，結果得出產品的感官評分最高為90分。

2.4不同發酵劑菌種發酵產品比較

根據感官評定結果并結合模糊數學分析方法最終得出：傳統發酵核桃乳的感官評分為85.80分，本研究開發的發酵核桃乳的感官評分為90分，即本研究開發的核桃粕乳在感官程度上優于傳統發酵劑發酵核桃粕乳；由表5可知，本研究開發的核桃粕乳的可溶性固形物含量為7.6%、氨基酸態氮含量為57.0mg/L、活菌總數為7.35×107CFU/mL，均優于傳統發酵劑發酵核桃粕乳；表明本研究篩選的發酵菌株組合設計有更強的生長活力，菌落總數、可溶性固形物、氨基酸態氮、膳食纖維等物質含量得到提高。

表5　傳統發酵和試驗核桃粕發酵乳的理化指標比較Table 5 Physicochemical indexes comparison of fermented walnut dregs milk by traditional and experimental fermentation

3　結論

通過對9株乳酸菌及復合菌株的發酵特性進行分析和篩選。結果表明：發酵核桃粕乳最佳復合發酵菌株為嗜酸乳桿菌/植物乳桿菌（1∶1），接種量3%本研究開發的核桃粕發酵乳感官評分90分，可溶性固形物含量7.6%，酸度80°T，氨基酸態氮57.0 mg/L，活菌總數7.35×107CFU/mL，膳食纖維含量5.43%。通過對核桃粕發酵乳的最佳發酵劑進行篩選優化，獲得新型核桃粕乳發酵產品，可進一步提高核桃的綜合開發利用水平，提高核桃粕的食用價值，滿足現階段人們對營養高品質蛋白產品的需求。

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Strains screening and fermentation condition optimization for fermented walnut dregs milk

ZHANG Hongli，XU Suyun，PENG Bangyuan，DING Zhuhong*
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000，China）

The paper focused on screening lactic acid bacteria for walnut dregs milk fermentation.According to pH and acid determination and sensory evaluation analysis，Lactobacillus acidophilusandLactobacillus plantarumwere the optimal strains among the nine lactic acid bacteria.The compound proportion of the two strains of lactic acid bacteria was studied and the quality of walnut dregs milk was compared with the one fermented by traditional fermentation starter.The results showed thatL.acidophilusandL.plantarumratio 1∶1 exhibited optimal comprehensive quality for fermented walnut dregs milk，the sensory evaluation score was 90，amino acid nitrogen was 57.0 mg/L，bacteria count was 7.35×107CFU/ml，and the nutritional value of the multi-strains fermented milk was superior to those fermented with traditional fermentation starter.

fermentation starter；walnut dregs milk；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus plantarum

TS201.3

0254-5071（2016）09-0180-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.041

2016-04-15

黔科合重大專項（［2011］6011號）

張洪禮（1991-），男，碩士研究生，研究方向為食品加工。

丁筑紅（1966-），女，教授，碩士，研究方向為農產品貯藏加工與綜合利用。