細胞微環境成像新方法與腦分區穩態的發現

韓鴻賓

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專家論壇

細胞微環境成像新方法與腦分區穩態的發現

韓鴻賓

腦細胞微環境；腦淋巴系統；磁示蹤法；磁共振成像；腦分區穩態

腦內因缺少淋巴系統，其組織液的引流依靠細胞間隙內物質轉運來實現，這是維系腦微環境穩態的保證。以往腦細胞間隙(extracellular space, ECS)的測量主要依賴電化學法、光學示蹤法。由于兩類方法只能顯示腦淺表區域或者兩點間距離小于200 μm的細胞間隙結構或功能信息，因此腦深部廣闊區域組織通道與細胞間隙的結構與功能尚未知。為了研究腦深部廣闊區域細胞間隙結構及其內物質轉運的規律，筆者研究團隊發明了一種新型磁示蹤成像方法，成功成像顯示了腦深部組織液的引流，并可同步獲取納米級的細胞間隙結構的特征性參數指標。由于新發明的磁示蹤法在探測深度等技術性能指標方面的進步，筆者研究團隊發現了腦組織液(interstitial fluid, ISF)引流系統內存在屏障結構，并因屏障結構的存在而發現腦內新的解剖學分區系統，即ISF引流分區系統。還使用光學顯微鏡和磁共振張量成像技術，確定了組織液引流屏障為穿行于組織間的致密排列的髓鞘纖維束。因此，筆者提出腦分區穩態假說。由此認為，腦器官除擁有血腦屏障對由循環系統而來的潛在危害進行屏障保護外，在腦內也存在組織液引流的分區屏障，從而可維系腦內不同分區的穩態。以此為基礎與起點，腦科學與腦病治療有望進入一個全新的發展階段。

1　概　　況

百十年來，基于細胞學說的腦科學一直圍繞“神經元學說”展開系列研究，在腦細胞的認識上學術成績斐然。然而，從臨床角度來看，腦病治療沒有取得實質性的突破和進展，卒中、阿爾茲海默病等依舊摧殘著人類的健康與尊嚴；認知、記憶依然是未解之謎[1]。回顧歷史，究其原因，可以發現腦科學研究體系尚存解剖結構和認識的盲區：腦細胞微環境。

腦細胞微環境，也稱ECS，或稱腦組織通道，是直徑為20～60 nm的微觀結構，其占據活體腦容積的15%～20%，是維系腦細胞生存內環境穩態結構的基本功能單元。現有關于活體細胞間隙的知識基本來源于美國紐約大學Charles Nicholson教授在20世紀90年代發明的兩類測量方法：電化學法與光學示蹤法[2]。由于原理和技術性能的限制，上述方法只能采集到組織淺表(約200 μm)或小范圍(50～200 μm)的ECS信息。近來，隨著精準醫學、組織工程、干細胞移植、認知、睡眠等新興學科的快速發展，現有ECS測量方法已無法滿足上述前沿領域的研究需求，對生物體深部廣闊未知區域ECS的信息獲取、處理分析與成像顯示已成為亟需解決的關鍵性技術瓶頸與難題[3]。同時，也因為以往探測手段的技術限度，ECS在認知及腦病發生發展中的作用與機制遠未被充分認識和闡明。這種認識的局限性已經直接或間接導致了全世界耗資數千億美元、經傳統血管途徑的腦病藥物研發項目面臨整體失敗[4]。20世紀末，美軍方開始探索經ECS途徑給藥以突破血腦屏障對藥物入腦的限制[5]。然而，正是因為對腦微環境結構信息認識的不足，通過ECS途徑將藥物導入腦內后，藥物分布、清除等關鍵指標均無法精準計算。

上述生命科學前沿領域、腦研究與新型腦病藥物治療領域所存在的諸多難題與困境的源頭，均指向了以往ECS微觀結構測量方法的技術局限性，開發可探及腦深部廣闊區域細胞間隙的新型定量分析方法成為必要。

為獲取生物體深部廣闊區域細胞微環境的結構與功能信息，筆者從2003年開始對上述測量技術的限度進行系統研究，提出了基于磁標記示蹤原理的新型測量方法。經過十多年潛心研究，建立了細胞間隙磁示蹤成像分析法，成功采集到深部組織細胞間隙信號，并實現了結構與功能參數信息的同步分析與成像顯示，該方法于2013年獲國家發明專利(ZL 200980126605.2)。磁示蹤法以磁共振成像儀(magnetic resonance imaging，MRI)為信號采集平臺，采用鑭系金屬離子螯合物及其衍生物作為分子探針，對細胞間隙內水分子進行特異性的標記，從而實現ECS的信號采集、信息處理分析與成像顯示[6]。具體而言，在高磁場環境下，導入到ECS內的Gd離子可作用于距離其2.41～2.44 ?的水分子中的氫原子核，加快氫核的進動頻率，縮短其縱向弛豫時間，使其在磁體環境下被“激活”，在MRI圖像上表現為高信號。采用調整射頻激發角的快速小角度激發序列實現了像素內探針濃度的實時定量分析。在此基礎上，利用對流擴散方程對細胞間隙微觀結構特征信息進行解析求解，最終可同步獲得細胞間隙結構與功能特征參數。應用圖像配準與矯正技術，可對細胞間隙內組織液在全腦范圍內的動態分布與清除過程進行動態觀察與成像顯示[7](圖1)。

圖1利用MRI示蹤系統測量腦內ECS的步驟(上圖)，以及被MRI示蹤劑釓噴酸葡胺(gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acidm，Gd-DTPA)標記的水分子(左下圖)

步驟A：通過對小鼠的MRI預掃描獲得造影前的成像；步驟B：向小鼠腦實質內注射Gd-DTPA以增強ECS中的水分子的MRI信號強度；步驟C：利用后處理成像減去造影前成像得到MRI示蹤劑的濃度分布；步驟D：分析示蹤劑的分布并計算ECS參數。小鼠的MR掃描圖像顯示腦ECS內MRI示蹤劑的分布，揭示了腦內存在生理分區系統(右下圖)

正是由于磁示蹤法在原理與技術性能指標上的進步，使得對腦內組織間隙這一未知結構有了新的認識上的突破：(1)發現腦內存在新的分區系統，如ISF引流分區系統；(2)發現調控不同腦區內組織液流速的方法；(3)闡明腦內分區系統產生機制；(4)提出腦分區穩態學說為切入點的細胞微環境學說。

2　腦內組織間隙認識突破

2.1腦ECS內ISF引流分區系統的發現應用磁示蹤法，筆者發現大鼠腦內存在不同的組織間隙分區系統。盡管尾狀核與丘腦彼此鄰近，但其內部的細胞間隙內組織液無法在兩個腦區內相互溝通，并且丘腦和尾狀核兩個腦區內組織液的流動速度、分布范圍，以及其內部細胞間隙的微觀結構特征均不相同[7]。換言之，筆者發現了腦內可阻止ISF流動和其內物質轉運的屏障結構(圖2)。

圖2　注射Gd- DTPA前后的冠狀位鼠腦MRI表現

強化開始出現于注藥后 0.5 h， 不同部位強化范圍不同， 并且信號強度隨時間衰減。A-尾狀核;B-丘腦;C-皮層；D- 中腦黑質

2.2發現調控不同腦區內組織液流速的方法細胞微環境是腦細胞生存的直接環境，因此，細胞微環境不僅對細胞活動、代謝起到支持作用，也將隨著腦細胞興奮活動而發生變化，并需要在一定時間內恢復原有狀態，以保持局部穩態，并為一下次的神經興奮活動提供基礎條件。由于以往技術的限度，神經興奮與ISF流動的關系一直是迷。近來，筆者應用磁示蹤法，利用大鼠電刺激模型激活丘腦區神經元興奮，觀察到丘腦區內組織液隨神經元興奮發生了延遲的流速下降，該流速的下降持續數小時，且不伴有局部間隙結構的改變。這種神經興奮導致的局部組織液流速下降不僅可解釋腦疲勞與睡眠，并且也為藥物在腦內分布、代謝與清除過程提供了一種完全無創的調控手段，對于腦病藥學研究以及經腦間質途徑的局部給藥腦病治療具有重要價值[8]。

圖3　痛覺刺激后，痛覺相關腦區-丘腦ECS內示蹤劑轉運速率明顯減慢

Ts為丘腦3 mA電流刺激組； Tc組為丘腦無痛覺刺激組。A行顯示Ts組示蹤劑清除減慢過程，其完全清除需要6 h，半衰期為(1.49±0.13) h。B行顯示Tc組ECS內物質轉運比Ts組迅速，示蹤劑完全清除僅需3 h，半衰期為(0.81±0.03) h。圖表C紅色及藍色曲線分別顯示Ts和Tc組示蹤劑濃度單指數衰減過程。

對于繼發于體表刺激的丘腦區組織液流動速度調控，筆者提出了兩個可能的機制：一是生物化學機制，即神經興奮伴隨著一系列化學活動，離子交換，神經遞質釋放，改變了局部的電位，影響負載電荷的分子探針在ECS內的運動速度改變[9]；二是生物力學機制，即神經興奮可導致星形細胞的暫時性腫脹，ECS容積下降高達30%。丘腦區膠質細胞的數量遠遠大于神經元，腫脹細胞導致局部ECS的變形，并阻礙分子探針的運動。

2.3ISF引流分區系統產生的機制ECS中的物質轉運和ISF流動是一個非常復雜的過程，由ECS的幾何機構和ISF中物質的擴散特性所決定。細胞膜和細胞外基質構成了腦ISF流體場的邊界狀態。因為腦內不存在淋巴系統，神經元、星形細胞等細胞膜與細胞外基質均直接暴露于細胞間隙或組織通道內[10]。同樣，由少突膠質的細胞膜或髓鞘也直接暴露在ECS空間內，形成了ECS的邊界，尤其在白質區。對ISF流動起到完全阻擋作用的是纖維束高度密集的區域，比如尾狀核與丘腦之間的內囊，而在相對疏松的纖維束內，如放射冠區域，物質可以自由轉運。因此，腦ECS中的物質轉運不僅僅由局部ECS迂曲度決定，也由穿行髓鞘纖維的走行、完整性和致密性決定。更重要的是，筆者發現，皮質內組織液也部分來源于腦深部。

同時，筆者還發現，髓鞘纖維的走形和分布不能解釋所有的腦ECS分區。嗅葉、下丘腦等分區與鄰近腦組織之間沒有明顯的髓鞘纖維束分隔，其大面積暴露于腦脊液(cerebro-spinal fluid, CSF)中，導致ISF與CSF之間高效的物質交換和這個腦區中示蹤劑的快速清除，由此導致功能分區或單位的形成。因此，腦ECS分區形成的機制可能是復雜不同的。進一步探索機制應充分考慮ECS內擴散特性，ISF引流途徑，每個分區內以及周圍的纖維束等。

髓鞘在腦生長、成熟和衰老的整個生命進程中不斷變化，這種變化與腦ECS的幾何結構及ISF流動均有關。作為腦ECS的邊界和引導ISF流動，髓鞘纖維束也與神經元遷移、星形細胞瘤的播散、神經元分化、突觸形成、大腦退化過程、組成和重組有關。髓鞘纖維束作為腦內轉運屏障的新功能，為理解脫髓鞘疾病及伴隨髓鞘完整性脫失的其他疾病(如精神分裂癥)的病理提供了全新視角[11]。髓鞘形成損傷不僅可以降低軸突傳導及神經元間信息交互的效率，還破壞腦ISF的引流和局部腦穩態。進一步的研究應當說明髓鞘脫失可在多大程度上損傷局部腦穩態，以及產生影響的確切關系和這些疾病最終的癥狀。轉運分區被發現和區域性腦穩態的假說可能給當前腦結構、功能、發育、衰老、腦疾病和腦病的治療方法的理解帶來巨大的沖擊。

2.4經細胞間隙途徑的新型腦病藥物治療方法學的建立本研究發現的ISF流動的位置依賴特性對腦病外科手術，乃至中樞神經系統(central nervous system, CNS)新藥研發都將產生深遠影響。過去幾十年中，以西方藥廠為主力的各類腦病藥物研發面臨整體失敗。磁示蹤法對全ISF引流的認識進步將為這些宣布失敗的藥物的復活帶來希望。

盡管血管僅占全腦容積的3%～5%，幾乎所有以往的藥物研發和臨床試驗均將其作為治療腦病的唯一路徑[12]。治療腦缺血性中風的神經保護藥物是上述失敗中的典型代表：通過傳統的口服或靜脈內注射途徑，神經保護藥物要到已經完全沒有缺血沒有血供，或者已經持續一定時間低灌注的缺血區域，且由于血腦屏障的存在，藥物的通過效率本身就很低。即使部分藥物通過血腦屏障，藥物也要經過在腦ECS內轉運的過程，才能由血管床到達受損的神經細胞。比較而言，ECS占全腦容積的15%～20%。即使是在缺血性損傷導致細胞毒水腫的情況下，體積縮小的ECS仍占全腦容積的3%～5%， 仍與正常腦內血管所占的容積相當[2]。與常規經血液途徑的藥物治療，經腦ECS的腦局部直接給藥擁有諸多優勢，比如繞過血腦屏障、低毒性、高效等。根據我們目前的研究結果，任何CNS藥物的研究和開發應考慮到腦ECS分區，因為藥物的分布和清除過程取決于不同分區。在腦局部給藥時，也需要考慮從導入點到靶區共有多少分區的存在。

根據上述原理，基于鼠腦內大腦中動脈供血區域內的ECS分區的定量分析，筆者建立一種經ECS途徑的腦病治療新方法“簡單擴散給藥法”[13]，較美軍所擁有專利技術的“對流增強給藥法”更加高效、低毒且無創。在2011年，筆者已經證實通過腦ECS給予很少劑量的胞磷膽堿即可防止神經元缺血性損傷[14]，而傳統給藥途徑已經宣布了這一藥物無效。此外，如前述及，我們最近證實了丘腦的物質轉運可由體表疼痛刺激后通過局部神經元興奮進行調節[8]，這一發現有望使藥物在腦內的分布得以安全控制。

總之，筆者研究團隊在過去的十年中，發明了可探及腦深部組織細胞間隙和組織液引流的磁示蹤法，借此技術的先進性，發現了腦ECS內存在組織液引流的分區系統，從而提出腦分區穩態的假說。這些均有助于引起人們對內環境的重視，細胞學說需要細胞微環境學說作為補充，同等重視腦細胞微環境的腦科學將有望由此進入新的發展階段。

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(2015-12-21收稿2016-02-11修回)

(責任編輯梁秋野)

國家自然科學基金(81471633,61450004)；北京大學第三醫院臨床學科重點項目(bysy201301)

韓鴻賓，博士導師，主任醫師。

100191，北京大學第三醫院放射科 磁共振成像設備與技術北京市重點實驗室

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