沙塵天氣氣載耐甲氧西林葡萄球菌監測及其REP-PCR指紋圖譜分析

邱玉玉，崔南南，李曉霞，王　芳，劉玉可心

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沙塵天氣氣載耐甲氧西林葡萄球菌監測及其REP-PCR指紋圖譜分析

邱玉玉1，崔南南1，李曉霞1，王芳2，劉玉可心1

目的了解沙塵天氣時空氣中葡萄球菌濃度及氣載MRSA的遺傳多樣性，為臨床葡萄球菌病的防控提供科學依據。方法用LWC-1型離心式空氣微生物采樣器采集火車站、學校、公園、廣場等場所空氣并分離鑒定其中的葡萄球菌，采用REP-PCR擴增不同源MRSA的基因組DNA形成聚類圖譜，分析不同源MRSA的相似性。結果氣載金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌濃度沙塵天氣時濃度均明顯增高，與正常天氣時的濃度差異有統計學意義(P<0.05)；在火車站中最高，濃度分別為116.7 CFU/m3和162.0 CFU/m3。從空氣中共分離得到金黃色葡萄球菌111株，其中MRSA20株；凝固酶陰性葡萄球菌179 株，其中MRCNS共11株。20株氣載MRSA圖譜顯示菌株相似性在48%～100%之間；氣載MRSA與醫院臨床MRSA分離株之間的相似性在50%～100%之間；與動物源MRSA之間的相似性在40%～100%之間。結論沙塵天氣空氣中存在著多種葡萄球菌，而且空氣中的部分MRSA株與醫院臨床分離株及動物源的MRSA有著較高的遺傳相似性，應加強空氣中葡萄球菌尤其是耐藥葡萄球菌的監測及防控。

沙塵天氣；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；凝固酶陰性葡萄球菌；基因外重復回文序列PCR(REP-PCR)

沙塵天氣特別是沙塵暴的肆虐在傳染性疾患的傳播中扮演著重要角色，對人類健康帶來極大的危害[1]。沙塵天氣時吸入顆粒物增加，多種有害病原微生物與顆粒物(塵埃)相連接在空氣中懸浮就形成微生物氣溶膠，導致傳染病傳播的機會大大增加。研究證明與人類有關的許多重要傳染病如肺結核、流感、軍團菌病、麻疹、天花、風疹等其它多種急性呼吸道傳染病可以通過氣溶膠傳播[2]。因此致病性微生物氣溶膠一直是人類和動物健康的一大危害，也是全球各個國家疾病預防控制部門的一大挑戰。加上2002—2003年SARS及近幾年來高致病性禽流感、甲型H1N1流感的暴發流行，警示人們應重視與人類健康密切相關微生物氣溶膠的研究[3-4]。

葡萄球菌是一群革蘭陽性球菌，其種類繁多，分布廣泛，多數為非致病菌，少數可導致疾病，對人類和動物的健康造成危害[5]。由于激素、免疫制劑的大量使用以及廣譜抗生素的濫用，葡萄球菌的耐藥性日趨嚴重而復雜，尤其是多重耐藥耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的出現，給臨床防治帶來巨大挑戰。 有報道認為MRSA已經成為最經常分離到的氣載微生物之一，氣源傳播在MRSA引起呼吸道感染及創面感染中起著重要作用[6-7]。凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negativeStaphylococci，CNS or CoNS)主要引起院內感染，是臨床微生物實驗室分離的最常見細菌之一，此類細菌引起的感染也日益增多[8]。 因此保護健康人群及病人不被氣溶膠中存在的病原微生物感染十分必要。

與國外大量的研究相比，國內對于公共場所氣載致病性微生物的監測及傳播的研究剛剛起步，尤其對于MRS的研究僅限于臨床住院患者標本、醫護人員及社區人群手及鼻腔中MRSA 的分離鑒定、耐藥性及耐藥基因等的研究。而對于氣載葡萄球菌，尤其沙塵天氣氣載MRS的相關研究甚少。因此本研究通過采集沙塵天氣不同公共場所的空氣樣品，研究不同場所氣載葡萄球菌的分布情況，進而采用REP-PCR技術對不同源MRSA進行指紋圖譜分析，通過監測空氣病原微生物成分來實現疾病的預防與干預，為今后的氣源傳播疾病的預防與控制提供科學依據和參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑綿羊血瓊脂基礎、 Baird-park(B-P)瓊脂培養基、高鹽甘露醇培養基、頭孢西丁紙片(30 μg/片)及葡萄球菌屬細菌生化鑒定管均購自杭州天和微生物試劑有限公司；NaCl 高鹽肉湯、亞碲酸卵黃增菌液、過氧化氫、兔血漿均為青島海博生物有限公司產品；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DL2000 Marker、Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2等PCR試劑均購自大連寶生物公司。6株動物分離株MRSA(D1-D6)為本實驗室保存，其中D1-D3是從病雞分離得到，D4-D6是從病牛分離得到；8株臨床分離株MRSA(L1-L8)由本實驗室保存，從醫院臨床送檢的痰液、分泌物及胸腹水等標本分離得到，由泰山醫學院附屬教學醫院檢驗科友情提供。

1.2儀器與設備LWC-1型離心式空氣微生物采樣器購自遼寧省遼陽市康潔儀器研究所，AG22331 Hamburg型 PCR 儀購自德國Eppendorf公司，PowerPac Basic型電泳儀購自法國BIORAD公司，自動凝膠圖像分析儀購自法國Vilber公司。

1.3方法

1.3.1空氣樣品采集選取泰安市人群聚集的公共場所火車站、廣場、校園、公園室外的空地為采樣地點，在2015年3月-5月沙塵天氣(包括浮塵、揚沙和沙塵暴，以天氣預報為主)和正常天氣(氣象記錄為晴或多云、無降水天氣、明顯沙塵天氣、和霧霾等天氣)時采集空氣樣品。同時采用兩臺LWC-1離心式采樣器(Reuter Centrifugal Sampler，Biotest，Frankfurt)，空氣流量是40 L/min，采集時間在0.5～8 min之間。 采樣時，選用綿羊血瓊脂基礎和Bair-park瓊脂培養基為采樣介質。每個采樣點在每次沙塵天氣采樣3次，采樣時間點根據當時具體天氣條件分別設在上午8時-10時、下午14時-16時；在沙塵天氣共進行3次采樣。同時在正常天氣時在相同地點相同時間點采樣作為對照，每個采樣點采樣3次。為了避免人員活動對采樣結果的影響，采樣時采樣器周圍無人員活動。

1.3.2葡萄球菌分離與鑒定將采集到的瓊紙條樣品放于37 ℃溫箱中需氧培養24～48 h。所有的菌落經革蘭染色后，鏡檢選取革蘭染色陽性呈葡萄串狀，成雙或單個排列的球菌，同時接觸酶陽性的歸為葡萄球菌及相關菌屬進一步鑒定。進一步參照杭州市天和微生物試劑有限公司生產的葡萄球菌屬生化鑒定編碼冊(TH-16S)進行分類鑒定。

依據上述葡萄球菌及金黃色葡萄球菌鑒定結果統計各瓊脂平板上的菌落數量。根據以下公式計算每立方米空氣中的金黃色葡萄球菌及CoNS的氣溶膠粒子含量：

(Q1: 瓊脂條上菌落數量總和 t：采樣時間(min))

樣品培養后計算細菌總數，因為空氣微生物數據的非正態分布，氣載細菌濃度采用了中間值(Median)表示，這種統計方法尤其適用于數量較少且數值浮動較大的樣品統計，同時用最大值與最小值反映樣品間數值的波動范圍[17]。中間值計算公式：

1.3.3耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的鑒定采用PCR方法和凝固酶實驗進一步鑒定金黃色葡萄球菌[9]；MRS按Murakami等的方法擴增mecA基因和頭孢西丁紙片擴散法來確認[9]；結果依據CLSI標準進行判讀[10]。實驗中以金黃色葡萄球菌ATCC25923作質控。

1.3.4REP-PCR指紋圖譜的構建及聚類分析取1 mL保存的MRSA菌株過夜混合物至離心管，12 000 r/min離心30 s，去上清液，沉淀按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。抽提好的DNA在Eppendorf核酸測定儀測定其 DNA含量。

參考Versalovic等(1991)[11]已發表的引物序列并交由上海生物工程公司合成，序列如下，REP1:5′-ATGTAAGCTC CTGGGATTCAC-3′和REP2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。反應體系: 總體積為25 μL，其中10×DNA buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物各1.5 μL，MgCl21.5 μL，Taq DNA聚合酶5U，DNA模板1.5 μL，ddH2O 14 μL。反應參數：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃ 7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應產物，電泳結果在自動凝膠圖像分析儀上照相。

REP-DNA指紋圖輸入凝膠成像分析系統，經計算機處理，采用非加權對數算術平均法(Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA)，利用NTSYS-pc 2.10軟件構建聚類樹狀圖。為了減少誤差，把所有分離到的菌株在同一個反應條件下一次完成，而且電泳也是在同一塊凝膠中一次完成。

2　結　果

2.1沙塵天氣及正常天氣時不同公共場所空氣中萄萄球菌的濃度共采集空氣樣品48份，其中沙塵天氣36份，正常天氣12份。

正常天氣時，氣載金黃色葡萄球菌濃度的中間值在火車站中最高，為87.5 CFU/m3，其次在校園、廣場和公園；4個場所之間濃度均值差異無統計學意義(P>0.05)。氣載凝固酶陰性葡萄球菌的濃度由高到低依次為火車站(125.0 CFU/m3)、公園(118.8 CFU/m3)、校園(112.5 CFU/m3)、廣場(106.2 CFU/m3)；4個場所之葡萄球菌濃度均值也無統計學意義(P>0.05)。葡萄球菌總均值濃度在火車站最高為201.4 CFU/m3，其次在校園為185.4 CFU/m3，公園為179.9 CFU/m3，廣場為176.4 CFU/m3(P>0.05)。

從表1可以看出沙塵天氣時，氣載金黃色葡萄球菌濃度的中間值在火車站中最高為116.7 CFU/m3，其次在廣場為108.3 CFU/m3，校園為107.4 CFU/m3，公園為104.6 CFU/m3；濃度均值之間也無統計學差異(P>0.05)。氣載凝固酶陰性葡萄球菌的濃度由高到低依次為火車站(162.0 CFU/m3)、校園(159.3 CFU/m3)、廣場(157.4 CFU/m3)、公園(156.5 CFU/m3)，4個場所之間葡萄球菌濃度均值也無統計學差異(P>0.05)。葡萄球菌總均值濃度在火車站最高為281.2 CFU/m3，其次在校園為266.7 CFU/m3，廣場為265.7 CFU/m3，公園為261.7 CFU/m3(P>0.05)。

沙塵天氣與正常天氣金黃色葡萄球菌氣溶膠的平均濃度比值在每個場所依次為；火車站為1.43 (119.2/83.3)、廣場為1.57(108.3/68.8)、校園為1.52(107.4/70.8)、公園為1.58(104.6/66.0)；凝固酶陰性葡萄球菌氣溶膠的平均濃度比值在每個場所依次為：火車站為1.37(162.0/118.1)，廣場為1.46(157.4/107.6)，校園為1.39(159.3/114.6)，公園為1.37(156.5/113.9)(表1)。

在不同公共場所氣載金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌濃度在沙塵天氣均明顯增高，與正常天氣濃度差異有統計學意義(P<0.05)。葡萄球菌氣溶膠的平均濃度比值火車站為1.40 (281.2/201.4)、廣場為1.51(265.7/176.4)、校園為1.44(266.7/185.4)、公園為1.45(261.7/179.9)。

表1不同采樣點空氣中金黃色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌的含量

Tab.1Concentrations of airborne S. aureus and CNS in the different sampling sites

火車站Railwaystation廣場Square校園Campus公園ParkAirborneS.aureusconcentration(CFU/m3)正常天氣Max.100.087.593.7581.3Min.62.543.837.543.8Median87.568.875.062.5Mean83.3a★68.8a70.8a66.0a沙塵天氣Max.131.6150.0133.3116.7Min.108.383.375.083.3Median116.7108.3125.0100.0Mean119.2b108.3b107.4b104.6bAirborneCNSconcentration(CFU/m3)正常天氣Max.131.25125.0116.61118.8Min.93.75100.042.4093.8Median125.0106.2112.5118.8Mean118.1a107.6a114.6a113.9a沙塵天氣Max.183.3191.7175.0166.7Min.133.3125.0125.0133.3Median158.3150.0158.3158.3Mean162.0b157.4b159.3b156.5b

★沙塵天氣與正常天氣相同的字母(a，b)表示差異沒有統計學意義(P>0.05)，不同字母表示差異有統計學意義(P<0.05)。

Note: ★a，b means that averaged values of sand and dust weather and normal weather followed by the same letter are not significantly different (P>0.05).

2.2氣載耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌的分離沙塵天氣共采集空氣樣品36份，共分離得到金黃色葡萄球菌74株，其中MRSA 16株；凝固酶陰性葡萄球菌122株，其中MRCNS 9株；正常天氣共采集空氣樣品9份，共分離得到金黃色葡萄球菌37株；其中MRSA 4株；CNS 57株，其中MRCNS 2株。

在分離鑒定出的290株葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌111株占檢出總葡萄球菌的38.3%，MRSA20株，占檢出金黃色葡萄球菌的18.0%；凝固酶陰性葡萄球菌179株占檢出總葡萄球菌的61.7%，其中表皮葡萄球菌35 株(19.6%)，溶血葡萄球菌 26株(14.5)，松鼠葡萄球菌26株(14.5%)腐生葡萄球菌22株(12.3%)，人葡萄球菌占18株(10.1%)，木糖葡萄球菌17株(9.5%)，產色葡萄球菌占12 株(6.7%)，其他11株(6.1%)；其中MRCNS中表皮葡萄球菌4株，株號為N3，N6，N7，N11；溶血葡萄球菌3株，株號為 N1，N8，N10；木糖葡萄球菌2株，株號為N2，N5；腐生葡萄球菌1株，株號為N4；人葡萄球菌1株，株號為N9。

2.3氣載耐甲氧西林金黃色葡萄球菌REP-PCR指紋圖譜的構建及聚類分析空氣中分離的20株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(株號見表2)、8 株臨床分離株(L1-L8 )及6株動物分離株(D1-D6 )進行用REP-PCR擴增，根據電泳譜帶繪制的UPGMA遺傳進化樹見圖1。MRSA的 REP-PCR指紋圖譜相似性在48%～100%之間。其中L8株與H6株，L5株與L3株，X2與L1株，H2株與D2株以及H2株與H3株兩兩之間相似性均為100%，即由同一株細菌分裂繁殖而來[12]。G1株與P3株以及H1株與H5株兩兩之間相似性>90%，也為同一分離株。

表2空氣中葡萄球菌及耐甲氧西林葡萄球菌的分離情況

Tab.2Distribution of airborne MRSA and MRCNS isolates

地點Samplingsites時間Samplingtime金黃色葡萄球菌S.aureus(strains)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA株數Strains陽性率Positiverate(%)株號Numbers凝固酶陰性葡萄球菌(strains)耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌MRCNS株數Strains陽性率Positiverate(%)株號Numbers火車站沙塵28725.0H1-H73425.9N1-N2正常9222.2H8-H91400.0/廣 場沙塵13215.4G1-G22314.3N3正常800.0/1417.1N4校 園沙塵17423.5X1-X429310.3N5-N7正常1119.1X51600.0/公 園沙塵16318.8P1-P33638.3N8-N10正常9111.1P41317.7N11總 計沙塵741621.6/12297.4/正常37410.8/5723.5/Total1112018.0/179116.1/

圖1　不同來源MRSA基于REP-PCR遺傳關系聚類樹狀圖Fig.1　Dendrogram of MRSA strains originated from different sources based on REP-PCR analysis

3　討　論

沙塵天氣是沙塵暴、揚沙和浮塵天氣的統稱，它是一種由大風將地面沙塵吹(卷)起、或被高空氣流帶到下游地區而造成的一種大氣混濁現象，是我國北方冬春季節較常出現的天氣。研究表明沙塵可攜帶細菌、真菌、放線菌及病毒等多種微生物，不僅具有極其重要的生態功能，同時還可提高生物氣溶膠的濃度導致空氣污染，威脅人體健康[13-14]。近幾年國內對沙塵暴發源地區的微生物研究相對較多，但其在遷移至下風區后的相關研究較少，但國外一些國家特別是同處于下風區的日本、韓國等國家對于沙塵天氣微生物的相關研究較多[1,14-16]。因此，研究沙塵天氣微生物的構成、濃度及分布對保護當地居民健康具有重要意義。鑒于葡萄球菌分布的廣泛性和重要的臨床意義，本研究選取金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌為研究對象研究沙塵天氣中微生物氣溶膠濃度、分布及耐藥性的傳播。有報道指出沙塵天氣可提高空氣中可培養細菌、真菌等的濃度[17]。本研究結果表明沙塵天氣時不同公共場所葡萄球菌氣溶膠的平均濃度比正常天氣時平均濃度提高了1.40～1.51倍(表1)。

CoNS已成為院內感染的重要病原菌，而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見,因此凝固酶陰性葡萄球菌感染不容忽視。2013年中國CHINET細菌耐藥監測結果MRCoNS檢出率平均為73.5%，大于MRSA的45.2%[18]。在醫院感染患者的各種臨床標本中分離出耐藥性致病菌的報道較多，已經對醫療機構環境、醫務工作者及患者造成了嚴重的威脅。因此，本研究不僅監測了空氣中的金黃色葡萄球菌，同時監測了凝固酶陰性葡萄球菌，結果表明沙塵天氣氣載金黃色葡萄球菌在火車站廣場濃度最高為119.2 CFU/m3，與正常天氣的濃度比為1.43，氣載CoNS濃度高達162.0 CFU/m3，與正常天氣的濃度比為1.37，說明空氣中CoNS比金黃色葡萄球菌濃度高，無論正常天氣還是沙塵天天均應引起足夠的重視。

本研究MRSA占檢出金黃色葡萄球菌的18.0%；MRCNS占檢出金黃色葡萄球菌的6.1%，這遠遠低于臨床標本的檢出率[18-19]，這可能與空氣的條件不利于菌株存活或耐藥基因丟失有關，具體原因需要進一步研究。

同時本研究結果表明空氣中凝固酶陰性葡萄球菌種類多樣，其中以表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和松鼠葡萄球菌等較常見；MRCNS包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌和人葡萄球菌。李俐等(2012)在醫療環境檢出MRCNS也以表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌較多[19]。張敏等(2012)對新鄉市各大醫院 2001-2010年，臨床分離的CoNS藥性監測結果表明CoNS中以表皮葡萄球菌、中間葡萄球菌、溶血葡萄球菌、木糖葡萄球菌為主，MRCNS的比例逐年升高，2006年最高值84.9%；2010年有所下降仍有56.3%[20]。陳孝進等(2013)從分泌物中分離的177株CNS 檢出97株MRCNS，檢出率為54.8%[21]。以上結果均表明CNS的耐藥性呈快速上升的狀態，給臨床醫師使用抗菌藥物控制其感染帶來相當大的難度。本研究從空氣中不僅檢測到MRSA也檢測到MRCNS，更增加了臨床防治的難度。

REP-PCR廣泛應用于不同種、型細菌菌株的同源性或相似性鑒定，具有穩定的重復性和高度的鑒別力，已經被很多研究者作為一種病原學或分子流行性病學調查的研究方法[22-23]。為了闡明空氣中的葡萄球菌特別是耐藥性葡萄球菌的來源，本研究采用REP-PCR擴增氣載MRSA及醫院臨床分離的及動物源的MRSA的基因組DNA，進行聚類分析，探討不同源MRSA分離株的遺傳相似性，對MRSA進行追蹤、聚類分析。結果表明不同來源MRSA的 REP-PCR指紋圖譜相似性在48%～100%之間。其中有一株臨床分離株(L8株)與空氣分離株(H6株)，一株動物源分離株(D2株)與空氣分離株(H2株)之間相似性均為100%，即表明他們分別由同一株細菌分裂繁殖而來[12]，說明人及動物身上的MRSA可以擴散到空氣中并傳播。由于空氣中微生物氣溶膠的生成、組成及濃度處于一種動態變化，受到溫度、濕度、氣流速度等氣象因素及人員活動等因素的影響，為了更全面闡明氣載病原菌的來源及傳播，應在不同季節，不同氣象條件下增多采樣點，增大采樣量，使采集樣更具代表性。

氣源性傳染病控制難度大，一旦疫情發生擴散迅速，這無疑給臨床及公共衛生工作者提出了挑戰。本研究結果為下一步葡萄球菌尤其是耐藥性葡萄球菌的氣源性傳播機制的研究提供了參考，提示我們今后應加強不同環境條件下公共場所致病性微生物氣溶膠的監測，為環境衛生質量控制和合理使用抗菌藥物提供科學依據。

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Surveillance and analysis of REP-PCR fingerprints of airborne Methicillin-resistant staphylococci in the sand and dust weather

QIU Yu-yu1，CUI Nan-nan1，LI Xiao-xia1，WANG Fang2，LIU Yu-ke-xin1

(DepartmentofBasicalMedicine，TaishanMedicalUniversity，Tai’an271000，China)

We evaluated the diversity of airborne staphylococci in the sand and dust weather and trace the source for analysis of genetic similarities of the airborne methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)，and then provide a practical basis for preventing and controlling infectious diseases. The air samples were collected from outdoor air by LWC-1 type centrifugal sampler at railway station，university，park and square in the sand and dust weather and in the normal weather. Airborne staphylococci and MRSA were isolated and identified from the air samples. The homology of MRSA isolated from air，clinical samples and animal samples was determined by repetitive extragenic palindromic elements-PCR (REP-PCR). Median concentrations ofS.aureusand coagulase-negative staphylococci aerosol were significantly increased and there was significant difference between that in the sand and dust weather and normal weather (P<0.05)，and was the highest in railway station，which was 116.7 CFU/m3and 162.0 CFU/m3，respectively. The 111 strains ofS.aureuswere obtained，which included 20 strains of MRSA. The 179 strains of coagulase-negative staphylococci were obtained，which included 11 strains of MRCNS. The fingerprints and the phylogenetic tree based on REP-PCR indicated that the genetic similarity index of 20 strains of MRSA was 48%-100%; airborne MRSA was 50%-100% similar to clinical strains and airborne MRSA was 40%-100% similar to animal strains. The air in the sand and dust weather was contaminated by many kinds of staphylococci aerosol and airborne MRSA expressed a closer relationship to the clinical strains and animal strains and the monitoring and prevention of airborne pathogen measures should be strengthened in the air.

sand and dust weather; Methicillin-resistantStaphylococcusaureus; coagulase-negative staphylococci; repetitive extragenic palindromic elements-PCR (REP-PCR)

Li Xiao-xia，Email: lxxia1978@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.001

李曉霞，Email：lxxia1978@163.com

1.泰山醫學院基礎醫學院，泰安271000；2.泰山醫學院公共衛生學院，泰安271000

R122.2

A

1002-2694(2016)09-0765-07

2016-01-21；

2016-07-27

國家自然科學基金資助項目(No.81101307)； 山東省自然科學基金(No.ZR2014HL089)；泰安市科技發展計劃(No.201440774-20，201440774-01)；泰山醫學院大學生課題(No.5112010469)；邱玉玉和崔南南有同等貢獻。

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81101307)，the Natural Science Foundation of Shandong province (No.ZR2014HL089)，the Science and Technology Development Project of Taian City (Nos.201440774-20 & 201440774-01)，and the College Students' Science and Technology Development Project of Taishan Medical University (No.5112010469)