MALDI-TOF-MS鑒定布魯氏菌方法建立和評價

湯　旭，肖　迪，張慧芳，陳經雕，毛玲玲，崔步云，張建中，姜　海

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MALDI-TOF-MS鑒定布魯氏菌方法建立和評價

湯旭1，肖迪2，張慧芳2，陳經雕3，毛玲玲4，崔步云2，張建中2，姜海2

目的為了快速、準確、便捷的檢測和鑒定布魯氏菌，本研究擬建立鑒定布魯氏菌屬的MALDI-TOF-MS方法，利用現場分離菌株對該方法進行特異性和敏感性評價。方法收集布魯氏菌標準菌株和地方流行株，應用MALDI-TOF-MS采集圖譜，獲取獨特的蛋白質指紋圖譜，匯總成標準圖譜，建立布魯氏菌鑒定數據庫。并用39株布魯氏菌菌株，對建立的數據庫進行驗證。結果經數據庫鑒定，39株布魯氏菌菌株與數據庫中布魯氏菌的匹配分數全部大于2.300，均報告為布魯氏菌，表明鑒定結果的可信度很高。 聚類分型結果表明，在蛋白質水平，MALDI-TOF-MS將測試的布魯氏菌分成3大類。結論MALDI-TOF-MS對布魯氏菌進行鑒定，具有快速、準確、靈敏等優點，可以實現對布魯氏菌屬的準確鑒定，對布魯氏菌病的臨床診斷具有較高的使用價值。

布魯氏菌；MALDI-TOF-MS; 鑒定

布魯氏菌病(brucellosis、簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的人畜共患的傳染—變態反應性疾病[1-2]。布病在《中華人民共和國傳染病防治法》中被列為乙類傳染病，由于其較高的感染率，它會給流行地區和國家造成巨大的經濟損失并且嚴重危害人類健康[3]。人布病也稱馬耳他熱，主要通過皮膚黏膜、消化道和呼吸道感染，主要臨床表現是長期發熱、伴有多汗、關節痛及肝脾腫大等，但往往又缺乏特異性[4-5]，一般在臨床易被誤診為其他疾病，如果治療不及時可導致機體多個系統發生病變。布魯氏菌是經典的生物戰劑，被列入《國際禁止生物武器公約》核查清單，也是美國反生物恐怖襲擊中的生物劑之一[6]。

布魯氏菌屬于兼性胞內寄生的革蘭陰性菌，無芽胞、無鞭毛；營養條件要求高，生長緩慢，生長最適溫度為37 ℃，個別菌種初代生長需一定濃度的CO2[7-8]。布魯氏菌在布氏瓊脂培養基上生長的菌落呈無色透明、圓形、表面光滑、稍隆起、均質樣，在菌落中央常帶有很小的顆粒，最初為透明狀，以后逐漸渾濁。布魯氏菌傳統的分類方法是根據宿主傾向性，將其分為6個經典的種。根據培養和生物學特性的不同，又將6個經典種分為19個生物型，包括羊種布魯氏菌(Brucellamelitensis)3個生物型，牛種布魯氏菌(Brucellaabortus)8個生物型，豬種布魯氏菌(Brucellasuis)5個生物型，沙林鼠種布魯氏菌(Brucellaneotomae)，綿羊附睪種布魯氏菌(Brucellaovis)和犬種布魯氏菌(BrucellaCanis)各有1個生物型。后來又分離到3個新的種型，分別被稱為田鼠型(B.microti)，鰭型(B.pinnipediae)和鯨型(B.cetacea或B.ceti)布魯氏菌[9-11]。引起我國目前布魯氏菌病疫情的是羊種、牛種和豬種布魯氏菌，而在實驗動物或寵物犬中經常能分離到犬種布魯氏菌。傳統的表型鑒定分類方法主要從菌株的形態學、生理生化反應特征以及免疫學特性加以鑒定分型的，這些傳統經典分型方法是國際公認的，并且經過多年的實踐證明其對流行病學和布魯氏菌病的防治具有重要的意義。但是，在實際工作中約有10%～30%是用傳統方法無法鑒定的非典型菌株[12]，而且這些傳統的鑒定方法檢測周期長、判讀結果繁瑣、不能提供同一血清型中不同菌株之間的親緣關系，而且還存在實驗室生物安全隱患[13]。因此，尋找更加安全、可靠、快速的鑒定方法對布病的溯源工作、流行病學調查和預防控制都具有重要的意義。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近幾年發展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的技術，已越來越多地用于微生物的檢測與鑒定。其基本原理為：樣品與基質在靶盤上形成共結晶，利用激光作為能量來源輻射共結晶體，基質分子吸收能量與樣品解吸附并使其電離，經過飛行時間檢測器，將不同質荷比(m/z) 的離子分開，形成細菌特異性的質譜圖[14-15]。用許多種已知標準菌株或來源分型明確的菌株建立參考細菌質譜圖庫，將待測細菌的質譜圖與已有的質譜圖進行比較，即可確定細菌種屬[16]。由于其具有快速、靈敏、準確、高通量等優點，MALDI-TOF-MS 已經逐漸成為臨床診斷、食品生產、環境監測以及軍事領域研究的一種有力手段。本研究通過MALDI-TOF-MS采集布魯氏菌特征性指紋圖譜，創建布魯氏菌鑒定質譜圖數據庫，實現對布魯氏菌的快速準確鑒定，從而可以為布魯氏菌病疫情的暴發和溯源提供技術支持。

1　材　料

1.1實驗菌株選取20株(1-20)布魯氏菌菌株用于建立MALDI-TOF-MS鑒定數據庫。使用39株(21-58)布魯氏菌分離菌株(見表1)用于評價所建立數據庫的鑒定可信度。所用實驗菌株均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布魯氏菌病室保存和提供。

1.2菌株鑒定59株受試菌株均按照傳統方法進行生化反應鑒定。

2　布魯氏菌MALDI-TOF-MS鑒定數據庫的建立

2.1樣品處理與點樣

2.1.1取適量(5～10 mg)布魯氏菌新鮮培養物，加入300 μL去離子水,仔細混勻，再加入900 μL無水乙醇混勻。如不馬上測定可放置在-20 ℃保存。微生物中的核糖體蛋白在該環境下很穩定可以保存幾個星期甚至幾個月。

2.1.2高速(10 000-16 000 r/min)離心2 min，棄去上清(必要時，再離心一次盡量去除乙醇和水)。

2.1.3加入50 μL 70%甲酸，混勻,再加入50 μL乙腈，混勻，高速離心2 min,吸出上清置于一新的離心管中。

2.1.4取1 μL上清液置于MALDI-TOF-MS樣品靶盤上，晾干后用2 μL基質溶液覆蓋，在空氣中晾干。

2.1.5分別取等體積的標準肽溶液與基質溶液混合后，取2 μL混合液置于MALDI-TOF-MS樣品靶盤上，在空氣中晾干，待完全干燥后進行MALDI-TOF-MS檢測。每個樣品和標準肽各做3個平行孔。

表1用于建立和評價布魯氏菌MALDI-TOF-MS數據庫的菌株信息

Tab.1Strain information of Brucella for MALDI-TOF-MS database establishment and evaluation

序號No.菌株編號No.ofstrains來源Source種Species備注Remark序號No.菌株編號No.ofstrains來源Source種Species備注Remark158002內蒙羊地方株3086010廣西豬地方株261010廣西羊地方株312008034陜西羊地方株363015河南羊地方株322008038浙江羊地方株479077寧夏羊地方株332009005河北羊地方株579104寧夏羊地方株342009053福建羊地方株686030青海羊地方株352010060貴州羊地方株788041青海羊地方株362010063山東羊地方株82009069遼寧羊地方株372010079湖北羊地方株92011055唐山牛地方株382011036北京犬地方株102011057吉林牛地方株392011048云南牛地方株112012002黑龍江羊地方株402011083山西牛地方株1216MICDC羊標準株412011163新疆牛地方株136319ICDC羊標準株422012031浙江犬地方株141330SICDC豬標準株432012053江西羊地方株1540ICDC豬標準株442012054江蘇羊地方株16544AICDC牛標準株452012056江蘇羊地方株17TulyaICDC牛標準株462012058江蘇羊地方株18870ICDC牛標準株472012059江蘇羊地方株19RM6-66ICDC犬標準株482012060江蘇羊地方株205k33ICDC鼠標準株492012061江蘇羊地方株2157055通遼羊地方株502012062江蘇羊地方株2264001廣西豬地方株512012063云南羊地方株2372007河南羊地方株522012064云南羊地方株2478049河南羊地方株532012065云南羊地方株2579059寧夏羊地方株54B3196ICDC牛標準株2679077寧夏羊地方株5563/75ICDC牛標準株2779087寧夏羊地方株56V68ICDC牛標準株2879099寧夏羊地方株57EtherICDC羊標準株2979120寧夏羊地方株58513ICDC豬標準株

2.2數據采集將上樣的樣品板小心置于板孔中，加有樣品一面朝上，蓋上蓋子，抽真空。打開儀器控制軟件FlexControl，調好儀器參數，校準儀器。采集標準品及樣品的質譜圖。對采集的數據進行保存，每次試驗前都要在采集數據的質量范圍內使用標準肽蛋白進行校準，校準后進行質譜數據采集，通過Biotyper軟件進行分析鑒定。

2.3建立數據庫的方法按2.2.1的方法進行樣品處理與點樣，每個平行樣品重復點2個樣品孔。每株菌共點l0個樣品孔。按2.2.2的方法校準儀器后，點擊樣品孔采集數據，每個樣品孔點擊10次，采集2個質譜圖。使用BioTyper軟件，分別調入所采集的每株布魯氏菌的質譜圖，將此質譜圖匯總生成整合圖譜，對所得的圖譜進行分析統一化，該圖譜便作為布魯氏菌質譜圖數據庫的標準圖譜。

2.4對布魯氏菌質譜數據庫的驗證采用39株常規和PCR方法已經鑒定為布魯氏菌菌株對所建立的數據庫進行驗證。

2.5結果判斷應用MALDI-TOF-MS BioTyper分析軟件進行細菌檢測時，將待測細菌的檢測結果通過軟件在細菌庫中檢索，判定標準是待檢樣品與細菌庫里標準菌株的圖譜的符合度，這種符合度用分數表示，0.000～1.699之間，顏色顯示為紅色，則無法判定，標記為(-)；在1.700～1.999之間,顏色顯示為黃色,判定為該種細菌的概率極低,標記為(+);得分在2.000～2.299之間,顏色顯示為綠色,判定為該種細菌的概率很高,標記為(++);得分在2.300～3.000之間,顏色顯示為綠色,判定為該菌種,標記為(+++)。

3　結　果

3.1布魯氏菌MALDI-TOF-MS鑒定數據庫的建立對20株布魯氏菌菌株全部進行了圖譜的采集與匯總，建立標準圖譜，最終建成包含20株布魯氏菌信息的獨立的鑒定數據庫。這20株布魯氏菌菌株的主要離子峰一致，峰譜穩定。以羊種布魯氏菌標準菌株(16M)為例，如圖1所示，經MALDI-TOF-MS分析，羊種布魯氏菌(16M)主要離子峰為：m/z3675.991、4536.143、5167.895、6672.614、7356.699、9075.223、9789.003。

圖1　MALDI-TOF-MS分析布魯氏菌(16M)的主要離子峰圖譜Fig.1　The main spectra of Brucella (16M) obtained from MALDI-TOF-MS

3.2對布魯氏菌MALDI-TOF-MS鑒定數據庫的驗證

3.2.1通過Biotyper分析軟件對樣品進行判定打開Biotyper分析軟件，調入選中樣品數據進行分析,圖2左側是編號為2008034菌株的指紋圖譜和細菌庫中編號為2009069菌株的對照圖，橫線以上是樣品的指紋圖，由多條豎線組成，若樣品指紋圖與標準圖成鏡像關系,說明樣品在此處的圖譜與標準菌株完全一樣，以綠色表示。若樣品在某處的指紋圖與標準圖不同，則以紅色表示。綠色豎線越多說明判定為該菌株的概率越大。圖2右側是鑒定結果，得分由高到低,第一行是得分最高的，細菌也由得分最高的進行判定。圖2-2中最高得分為2.748，在2.3～3之間，判定為布魯氏菌。

圖2　編號為2008034的菌株，得分為2.748的質譜鑒定結果

3.2.2MALDI-TOF-MS對39株布魯氏菌菌株的鑒定結果將39株布魯氏菌菌株(見表2)分別進行MALDI-TOF-MS鑒定，分析在布魯氏菌數據庫中的匹配結果。經鑒定，39株布魯氏菌菌株的匹配分數全部大于2.300，均報告為布魯氏菌，表明鑒定結果的可信度很高。

表239株布魯氏菌菌株MALDI-TOF-MS的鑒定結果

Tab.2Identification results of 39 Brucella strains with MALDI-TOF-MS

SampleOrganism(bestmatch)ScorevalueSampleOrganism(bestmatch)ScoreValue64001-1B.melitensis630152.4682012063-1B.melitensis20120022.62378049-1B.melitensis610102.4722012064-1B.melitensis20120022.5322011036-1B.suis402.5262012065-1B.melitensis790772.42012053-1B.melitensis20120022.41779099-1B.melitensis610102.4222012054-1B.melitensis790772.512niu3-1B.abortusTulya2.7952012056-1B.abortus20110572.508niu5-1B.abortus8702.3632012058-1B.melitensis20120022.512niu9-1B.abortus8702.3412012059-1B.melitensis791042.423yang3-1B.suis402.4092012060-1B.abortus20110572.486zhu5-1B.abortus20110572.2542012061-1B.melitensis20120022.33610079-1B.melitensis20090692.6492012062-1B.melitensis791042.42008034-1B.melitensis20090692.7482008038-1B.abortus20110572.6172007-1B.melitensis610102.6772009005-1B.melitensis20120022.49979059-1B.melitensis20090692.4042009053-1B.abortus20110572.51479087-1B.suis1330S2.4022010060-1B.abortus20110572.61979099-10B.melitensis610102.6862010063-1B.melitensis20090692.61479120-1B.abortus20110552.452011048-1B.abortus20110552.51986010-1B.canisRM6-662.3762011083-1B.abortus20110572.608niu7-1B.abortus8702.3382012031-1B.canisRM6-662.35357055-1B.melitensis20090692.508

3.359株布魯氏菌MALDI-TOF-MS聚類分型結果本研究通過模式匹配計算59株布魯氏菌主要譜圖的相似性，采用相似分值構建系統樹，對59株菌株進行了聚類分型分析。59株布魯氏菌聚類分型樹狀圖如圖3所示。參與分析的菌株被分成3個主要的類別，并用不同的顏色標示，其中綠色的類別中以羊種布魯氏菌為主，藍色的類別中以牛種布魯氏菌為主，紅色的類別中以豬種布魯氏菌為主。

4　討　論

MALDI-TOF-MS是近幾年發展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的生物質譜技術，它利用不同細菌間特異的質荷比作為生物標志分子鑒定細菌，具有快速、準確、高通量等優點。雖然傳統的布魯氏菌鑒定方法準確、可靠，是目前公認的鑒定方法，但缺點是步驟繁瑣，檢測周期長，而且對有些生化特性不典型的布魯氏菌難以鑒定。基于細菌全蛋白分析的MALDI-TOF-MS方法對布魯氏菌進行鑒定與分型豐富或彌補了現有方法的不足，其原理、操作程序均與現在慣用方法不同，無需提取DNA，僅在樣品處理時滴加少量基質，即可上機測定，大容量樣品板一次可測定100多份樣品，1 h內即可獲得結果，可以連續測定，結果以直觀的圖譜形式表達，數據便于統計學分析，實現了目前任何一種檢測儀器或方法所無法比擬的高通量和高效率。但在應用MALDI-TOF-MS分析全細菌時，應當考慮到可能影響全細菌圖譜質量和重復性的實驗因素。目前對儀器參數和樣品制備的調查結果顯示，細菌的培養和樣品的制備是兩個重要影響因素[17]。培養條件(培養基種類和培養時間)能影響生物標記分子的出現，從而引起圖譜的變化[18]。其次，所用的基質、酸的種類和濃度的不同也導致不同實驗室對同一菌株的分析結果出現偏差[19]，但通過將分析程序標準化即可解決上述問題[20]。

圖3　59株布魯氏菌MALDI-TOF-MS聚類分型樹狀圖Fig.3　Cluster analysis of 59 Brucella strains according to the results of MALDI-TOF-MS

本研究通過采集不同時間不同地點分離的20株布魯氏菌菌株的數據，獲得了特征指紋圖譜，創建了鑒定布魯氏菌的質譜圖數據庫。并通過39株布魯氏菌菌株對建立的數據庫進行驗證，結果顯示，布魯氏菌菌株的匹配分數均大于2.300，MALDI-TOF-MS能夠實現對布魯氏菌的準確鑒定。本研究在建立布魯氏菌質譜鑒定數據庫的同時，還根據不同菌株的譜圖特點對所研究的59株布魯氏菌進行了聚類分型。結果表明，質譜聚類分型的結果一方面與傳統分型的類別比較吻合，另一方面也說明傳統的經驗分型方法存在不足，而質譜分型基于不同菌株的蛋白圖譜特征，更精確地體現了不同菌株的生物學特點，是一種更為科學可靠的分型方法。從而可以為布魯氏菌疫情的暴發和流行的預防和溯源提供技術支撐。

MALDI-TOF-MS對未知細菌分型鑒定必須建立在含有足夠多的已知菌株的譜庫中進行檢索，方可實現最匹配且真實可靠的菌株鑒定結果，本實驗所用儀器軟件支持用戶自定義數據庫。因此，后續研究可按統一的建庫標準擴大檢測數據庫，提高對細菌的分型鑒定能力。相信隨著數據庫的不斷補充與應用軟件的完善，MALDI-TOF-MS不僅在微生物的鑒定中體現其快速、準確、靈敏的特點，還可能成為直接在分子層次上揭示菌體活動的有力工具，用于病原菌溯源性研究、生物武器鑒別、微生物的致病性和毒力特征描述等方面。

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Establishment and evaluation of identification ofBrucellaby MALDI-TOF-MS

TANG Xu1，XIAO Di2，ZHANG Hui-fang2，CHEN Jing-diao3，MAO Ling-ling4，CUI Bu-yun2，ZHANG Jian-zhong2，JIANG Hai2

(1.HaidianCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing100094，China;2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl，CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases，NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，China;3.GuangdongProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention，Guangzhou511430，China;4.LiaoningProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention，Shenyang110005，China)

Fast，accurate and convenient detection and identification ofBrucella，MALDI-TOF-MS was established. The sensibility and specificity of the method was evaluated too. MALDI-TOF-MS database was established by collecting the unique protein fingerprint of 20Brucella

trains and endemic strains and was evaluated by 39Brucellaisolates. On the basis of database information，59Brucellastrains were grouped into 3 clusters. Mass spectra database ofBrucellaidentification was created through the acquisition of theBrucellacharacteristic fingerprint.Brucellaisolates were selected to verify established database. Match scores between 39 strains and reference strains in database were all greater than 2.300 and results are reported asBrucella. This revealed that degree of confidence was very high. Clustering results indicated thatBrucellawas divided into three categories at the protein level by MALDI-TOF-MS. MALDI-TOF-MS was used to identifyBrucellaat protein levels. The method is fast，accurate，sensitive and has higher value on clinical diagnosis of brucellosis.

Brucella; MALDI-TOF-MS; identification

Jiang Hai，Email: jianghai@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.002

姜海，Email：jianghai@icdc.cn

1. 北京市海淀區疾病預防控制中心，北京100094；

2. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制圍家重點實驗室，感染性疾病協同診治協同創新中心，北京102206；

R378.5

A

1002-2694(2016)09-0772-07

2016-06-01；

2016-07-25

國家自然科學基金 (No.81271900)

3. 廣東省疾病預防控制中心，廣州511430；

4. 遼寧省疾病預防控制中心，沈陽110005

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271900)