粉塵螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表達、純化鑒定及生物信息學分析

梁志林，劉志剛，鄔玉蘭，陳思敏，楊平常，劉曉宇

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粉塵螨13.8 kDa溶菌酶的克隆表達、純化鑒定及生物信息學分析

梁志林，劉志剛，鄔玉蘭，陳思敏，楊平常，劉曉宇

目的克隆表達粉塵螨13.8 kDa 溶菌酶(Bac)基因, 純化鑒定蛋白的過敏原性, 并進行生物信息學分析。方法

粉塵螨；13.8 kDa 溶菌酶(Bac)；原核表達；免疫原性鑒定；生物信息學分析

在已知的數十種塵螨中,與人類過敏性疾病關系最密切的主要有屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus, Der p)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae, Der f)，可誘發I型變態反應, 從而引起哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮炎和蕁麻疹等多種過敏性疾病[1-2],是最重要的過敏原[3]。目前, 利用塵螨的主要過敏原來檢測塵螨過敏和進行免疫治療是非常重要的手段。我國學者首次對粉塵螨基因組學和轉錄組學進行研究，并對Der f1-24進行報道[4-5]，極大地豐富了塵螨過敏原基礎研究。本文利用基因工程技術克隆粉塵螨Bac基因，并利用pET-44a原核表達系統進行表達及分析，獲得具有IgE結合活性的重組過敏原13.8 kDa 溶菌酶(Bac)，并對免疫學特性進行鑒定；同時，用生物信息學方法對其結構和功能進行分析，為進一步研究粉塵螨Bac過敏原的結構和功能提供理論依據。

1　材料和方法

1.1主要試劑和材料

1.1.1菌株和動物粉塵螨(Der f)由深圳大學過敏反應與免疫學研究所標準化純培養并提供，大腸桿菌E.coliTop10F’和E.coliBL21 (DE3) 為本實驗室保存。

1.1.2質粒和試劑原核表達載體p ET-44a為本研究室保存。限制性內切酶EcoR I和XhoI、T4 連接酶、AMV 反轉錄酶、Taq DNA 聚合酶等購自Ta KaRa 公司。高保真Pfu DNA 聚合酶購自Fermentas公司。RNA提取試劑盒、DNA 片段純化試劑盒購自Qiagen 公司。Ni2N TA resin及柱子購自Amer sham Pharmacia公司。

1.1.3血清取自廣州醫科大學第一附屬醫院變態反應科，臨床上選擇經粉塵螨皮試陽性的過敏性哮喘和過敏性鼻炎患者18例和粉塵螨皮試陰性的健康人10例。分別采集靜脈血各5 mL，經37 ℃靜置4 h，然后5 000 × g離心5 min 收集上層血清,再選用法瑪西亞CAP 過敏原自動監測系統,收集粉塵螨特異性IgE陽性且反應達3 級或3 級以上的患者血清10 例進行混合,作為陽性血清; 另取10 例粉塵螨特異性IgE 陰性的健康人血清10 例進行混合,作為陰性血清,二者分裝后-80 ℃低溫保存備用。

1.2方法

1.2.1RT-PCR擴增及其產物的克隆以提取的總RNA為模板，逆轉錄cDNA，進行PCR 擴增反應。反應體系如下(50 μL)：10 × Ex Taq Buffer 5 μL；TaKaRa ExTaq 0.25 μL；dNTP Mixture，4 μL；上下游引物各2 μL，cDNA 為模板1 μL；加去離子水至50 μL。 PCR反應條件：94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min；35 個循環，PCR 產物經1% 瓊脂糖電泳驗證并拍照。將上述PCR 產物與pMD-18T 連接后，熱轉化至E.coliTop10 中，涂布于含氨卞霉素( 100 mg/L)的LB 平板上，37 ℃培養過夜，從LB 平板上挑選白色菌落放入含氨卞霉素的LB 培養液中擴大培養，提取質粒。 用BamHI酶切鑒定，重組質粒，委托華大基因工程(深圳)有限公司進行序列。

1.2.2Bac蛋白的誘導表達將上述鑒定的pET44a-Bac轉化至感受態大腸桿菌BL21 ( DE3)，待細菌生長處于對數生長期( A600nm=0.6～0.9) 時, 加入20 μL 1 mol/L的IPTG, 誘導蛋白表達。誘導4 h后取1 mL 菌液，離心棄上清液, 加100 μL去離子水后重懸菌體，加20～25 μL 10×SDS-PAGE 上樣緩沖液混合, 沸水浴10 min，按照5 μL，10 μL，20 μL上樣，進行SDS-PAGE 電泳分析, 以檢測重組蛋白表達情況。誘導表達的重組蛋白，經裂解、溶菌、超聲，將上清液以2 mL/min 的速度上樣于已平衡好的Ni-NTA 柱。然后用平衡液充分洗柱，再分別用含40、300 mmol/L 咪唑平衡緩沖液進行洗脫，收集各次洗脫液進行SDS-PAGE 分析。

1.2.3重組Bac蛋白的過敏原性鑒定將重組Bac蛋白以不同的濃度梯度包被微孔板，以對粉塵螨過敏的患者的血清作為一抗、以HRP抗人IgE為二抗建立了間接ELISA法進行特異性檢測分析。

1.2.4重組Bac蛋白的生物信息學分析

1.2.4.1測定Bac的基因序列以及Bac基因的同源性分析基因序列的測定送由深圳市華大基因有限公司進行完成，Bac基因的同源性分析用NCBI 網站在線軟件分析其ORF，用Translate Tool 推導其氨基酸序列，用clustalw2進行同源性分析。在NCBI數據庫，BLAST比對出與Bac蛋白序列相關性最強的10個蛋白質序列，用MEGA5 工具包來構建系統進化樹。

1.2.4.2Bac蛋白的理化性質用PmtParam對塵螨Bac蛋白的理化性質進行預測。

1.2.4.3Bac的蛋白質結構及T細胞、B細胞表位預測用PSIPRED預測其二級結構,用SWISS-MODEL預測其三級結構；選取與人類哮喘相關的等位基因，利用網絡服務器 IEDB內相關軟件、Preprod在線預測工具對Bac蛋白T細胞抗原表位進行預測；采用DNAStar軟件提供的Protean模塊對Bac的B細胞抗原表位進行預測。

2　結　果

2.1RT-PCR 擴增Bac片段，表達載體pET44a-Bac 的構建以純培養的活粉塵螨提取的總RNA為模板，進行設計的特異性引物為上下游引物，再以反轉錄所得到的cDNA為模板擴增得到約為400 bp的片段，大小與預期相符(圖1)。將Bac目的基因經EcoRI和XhoI雙酶切并克隆到pET-44a表達載體上得到重組質粒pET44a-Bac。

M: DNA相對分子質量標準；1:擴增的Bac基因M: DNA marker; 1: PCR prouct from Bac.圖1　目的基因的RT-PCR產物Fig.1　PCR product of ferritin from Bac

2.2重組蛋白的表達和純化含有pET44a-Bac的表達菌株經終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導4 h，表達蛋白進行SDS-PAGE 電泳,考馬斯亮藍染色, 結果顯示陽性克隆菌株在相對分子質量(Mr) 約14 kD處有外源蛋白表達的條帶出現, 其Mr與預計值相符(圖2)。

M: Protein Marker；1:純化的重組Bac蛋白M: Protein marker；1: Purification protein.圖2　重組Bac蛋白在大腸桿菌中的誘導表達Fig.2　SDS-PAGE of protein which had been purified

2.3重組Bac蛋白ELISA免疫原性鑒定選用粉塵螨過敏患者陽性血清作為一抗，以HRP抗人IgE為二抗，采用間接ELISA方法進行檢測，鑒定結果顯示重組Bac與塵螨過敏患者陽性血清的IgE特異性結合活性明顯高于正常對照者血清的IgE結合活性(t=43.970,P<0.01)(圖3)。

A：粉塵螨過敏患者陽性血清；B：正常對照組血清A: Positive serum; B: Normal serum.圖3　Bac蛋白ELISA免疫原性鑒定結果Fig.3　Immunogenicity appraisal result of ELSIA

2.4粉塵螨Bac蛋白生物信息學分析

2.4.1測定Bac的基因序列以及Bac基因的同源性分析測得的13.8 kDa溶菌酶(Bac)的基因序列為“atggatggttcacatattgtaaaggcagcacgatcacaaattgg tgtaccatattcatggggtggtggtggtattcatggtaaatccaaaggta ttggtgaaggtgcaaatatcgttggatttgattgttctggattggcacaa

tattccatttatcagggaacacataaaacaattgctcgtacagctgcagc

acaatataatgataaccattgtcatcatgttgcatacggtagtcatcaacc aggtgatctggtatttttcggtaatccaatctatcatgttggtattgtatc

ggcacatggtcgtatggtcaatgcacctaaacccggtactaaagttcgt gaagaaaatatttggagttatcatatttctcatgttgctcgatgttggtaa”。將推導出的Bac蛋白的氨基酸序列輸入NCBI網站進行Blast比對分析，同源序列以Fasta格式輸出后用MEGA5．1軟件構建分子進化樹(圖4)，結果顯示粉塵螨與屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，gi|540198595|、gb|AGV05390.1|、gi|22595340|、gb|AAN02509.1|AF409109)親緣關系比較近；同時，Bac蛋白在鏈霉菌屬(Streptomyces，gi|917111437|ref|WP 051718149.1|)、南海海洋所菌屬(Sciscionella，gi|521987581|ref|WP 020498852.1|)、綠僵菌屬(Metarhizium，gi|743660388|、gb|KID87636.1|、gi|734664381|、gb|KHO01427.1|)、彎頸霉菌屬(Tolypocladium，gi|908391921|、gb|KND92543.1|)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana，gi|667658361|ref|XP 008601012.1|、gi|400595504|、gb|EJP63299.1|)和蛹蟲草(Cordycepsmilitaris，gi|573987537|ref|XP 006671689.1|)中有類似的表達。

圖4　Bac的系統進化樹分析Fig.4　Phylogenetic relationship of Bac

2.4.2Bac的理化性質用PmtParam對塵螨Bac蛋白的理化性質進行預測，推測該蛋白的分子式為C627H944N188O178S5，原子總數為1 942，分子質量是 14 123.8，理倫等電點9.08；該蛋白含Gly (G) 最多，占14.5%；負電荷氨基酸殘基數為7，正電荷氨基酸殘基數為11，總的平均疏水性為0,320，脂肪指數為70.00，不穩定指數是31.63，按ProtParam定義，不穩定系數分值小于40時，預測蛋白較穩定，故Bac蛋白的性質穩定。

圖5　Bac二、三級結構及T細胞、B細胞表位預測圖

2.4.3Bac的蛋白質結構及T細胞、B細胞表位預測將Bac的氨基酸序列輸入到蛋白質結構預測服務器中(PSIPRED)，對其進行二級結構的預測(圖5A)。用同源模建法，提交序列到SWISS-MODEL服務器進行自動模建，得到其三維結構。其結果與所選取X-衍射得到的模板序列相似性為40.32%(圖5B)。二級結構與三級結構預測都表明Bac主要由無規則卷曲構成。用 網 絡 服 務 器 IEDB 數 據 庫、 Preprod對 Bac蛋白 T細胞抗原表位預測得到 4個肽序列(6-14、38-46、85-99和122-130)。利用DNAStar軟件預測Bac的B細胞表位。蛋白質的親水性、表面可及性、柔韌性等在抗原的形成方面發揮著重要的作用,當親水性>0，抗原指數>0，表面可及性>l時，形成表位的可能性大，綜合其上各參數可推導出該蛋白的抗原區分別為氨基酸的15-30、 26-40、44-59、58-73、95-110和101-116(圖5為Bac蛋白質二三級結構預測圖，T細胞、B細胞表位見圖5。

3　討　論

塵螨普遍存在于人類居住環境中，可引起人體許多過敏反應如過敏性哮喘、過敏性鼻炎等[1]，塵螨是導致過敏性疾病最重要的吸入性變應原(過敏原)，約有70%～80%的哮喘患者對塵螨過敏[2]。屋塵螨(Der p)和粉塵螨(Der f)是我國室內最主要的兩種優勢螨種，目前研究發現塵螨含有Der 1-24種過敏原，其中Der f2和Der p2對過敏性疾病(哮喘)患者免疫診斷陽性率最高[3-4]。Der p2對過敏性疾病(哮喘)患者免疫診斷陽性率為87.8%[6]。近50年來，國內外有關學者在對當地塵螨進行眾多的種類調查、抗原分析純化等工作的基礎上，制備出粉塵螨過敏原浸液用于臨床特異性診斷和免疫治療(脫敏治療)，并取得了較好的療效[7]。塵螨疫苗特異性免疫治療是WHO認可的目前治療塵螨過敏性哮喘唯一的對因治療方法，其主要機制包括調節機體抗原提呈細胞、T細胞和B細胞反應，轉換相關抗體亞型，抑制過敏性炎癥效應細胞(如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞)等[9-10]；即主要通過調節機體特異性免疫應答來發揮對因治療作用[11]。故對塵螨過敏原的深入研究將有助于塵螨過敏診斷和免疫治療。

粉塵螨溶菌酶(Bac)屬于N-乙酰胞壁質聚糖水解酶家族，Childs M和Erban T等研究發現，塵螨可利用其溶菌酶消化芽孢桿菌，作為自身的食物來吸取養分[10-11]。本研究克隆粉塵螨Bac的DNA基因序列全長為396 bp，可編碼131個氨基酸。分子進化遺傳分析(molecular evolutionary geneticsanalysis，MEGA)工具包結果顯示粉塵螨與屋塵螨的親緣關系最近，粉塵螨Bac基因與屋塵螨中的LytFM基因(gb|KF113885.1|)同源性高達96%。利用間接ELISA法，證實粉塵螨Bac蛋白與塵螨過敏患者血清IgE具有特異性結合的能力。

生物信息學(Bioinformatics)是研究生物信息的采集、處理、存儲、傳播，分析和解釋等各方面的學科，是通過基因序列可預測其相應蛋白質結構和功能的重要工具[12]。本文通過運用生物信息學方法對粉塵螨Bac的理化性質、蛋白結構及T細胞、B細胞表位進行預測。結果顯示Bac蛋白含Gly (G) 最多，占14.5%，蛋白較穩定。二級結構與三級結構預測都表明Bac要由無規則卷曲構成。抗原表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，包括B細胞表位和T細胞表位。T細胞表位為可被 T細胞表面受體或抗體特異性識別并相互結合的片段，重疊肽法或酸洗脫法是傳統的確定T細胞表位的方法，但這兩種方法耗費畢竟大。利用生物信息學技術進行 T細胞表位預測能大幅度提高工作效率，可以有效節約研究成本，本文用網絡服務器IEDB數據庫、Preprod對粉塵螨Bac蛋白的T細胞抗原表位預測得到4個肽序列；可被B細胞表面受體或抗體特異性識別并相互結合的片段為B細胞表位；利用DNAStar軟件進行Bac蛋白的B細胞表位預測得到6個肽序列。本研究為進一步研究粉塵螨過敏原的結構和功能提供理論依據。

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Cloning and expressing theDermatophagoidesfarinae13.8 kDa lysozyme (Bac) gene, purifying and identifying the protein allergenicity and analysis of the Bac protein

LIANG Zhi-lin, LIU Zhi-gang, WU Yu-lan, CHEN Si-min, YANG Ping-chang, LIU Xiao-yu

(InstituteofAllergyandImmunology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

The aim for this study is cloning and expressing theDermatophagoidesfarinae13.8 kDa lysozyme (Bac) gene, purifying and identifying the protein allergenicity and conducting bioinformatics analysis of the Bac protein. Total RNA was extracted from cultured dust mites. The primers designed according to sequences was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pMD32-T vector, and then subcloned into pET-44a vector by restriction endonucleaseEcoR I andXhoI. The recombinant plasmid pET44a-Bac was transformed intoE.coliBL21 and was induced with IPTG. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was used to test the allergen of Bac and the clustalw2 was used to conducted homology analysis and MEGA5 to construct phylogenetic tree of Bac. ProtParam tools were used to predict its physical and chemical properties. PSIPRED and SWISS-MODEL were used to predict its secondary structure and tertiary structure. IEDB and Preprod was used to analyze the T cell antigen epitope. DNAStar was used to analyze the B cell antigen epitope of Bac. After sequencing, we have successfully cloned the Bac gene, and the open reading frame was 396 bp, encoding 131 amino acid group.The Bac gene was transferred intoE.coliBL21 (DE3). After induction with IPTG, Bac protein was largely expressed. The protein mainly existed in soluble form; protein molecular weight was about 14 kDa. The indirect ELISA method results showed that Bac could bind with dust mite allergic patients serum IgE. Comparing the clonedDerfBac amino acid sequence with other mites, we found that its homology with NCBI accession number KF113885.1 was 96%. The molecular evolutionary tree analysis showed that Bac had a close relationship withDermatophagoidespteronyssinus. The physical and chemical properties prediction showed Bac protein was stable. The prediction of the secondary and tertiary structure indicated that Bac mainly consisted of random coil. Bioinformatics analysis predicted four peptides (6-14, 38-46, 85-99, 122-130) as the T cell epitopes and six peptides (15-30, 26-40, 44-59, 58-73, 95-110, 101-116) as the B cell epitopes. We have successfully cloned and expressed the Bac, and confirmed that the recombinant Bac protein has good immunogenicity. The study provides a basis for further study of composition and physicochemical properties of house dust mite allergen.

Dermatophagoidesfarina; 13.8 kDa lysozyme (Bac); expression; immune identification; bioinformatics

Liu Xiao-yu, Email: lxy0901@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.003

劉曉宇，Email：lxy0901@163.com

深圳大學過敏反應和免疫學研究所，深圳 518060

R392.8

A

1002-2694(2016)09-0779-05

2015-10-31;

2016-02-06

國家自然科學基金(No.91442118、No.31400786)、廣東省科技計劃社會發展項目(No.2013B03180002)、廣東省對外科技合作項目(No.2013B051000088)、廣東省公益研究與能力建設專項資金(No.2013B031800023)、深圳市科技計劃國際科技合作項目(No.GJHZ20130408174112021)和深圳市科技計劃基礎研究項目(No.JCYJ20140828163633992)聯合資助

挑取經純培養的粉塵螨，提取總RNA，根據已知基因序列設計引物，經RT-PCR擴增Bac基因片段，產物連入pMD-32T載體中。擴增后，利用限制性內切酶EcoRI和XhoI雙酶切將目的基因片段連接到Pet-44a表達載體上，轉化到大腸桿菌BL21( DE3)中經IPTG誘導表達；間接ELISA法檢驗重組Bac蛋白特異性過敏原性；clustalw2進行同源性分析，MEGA5工具包來構建系統進化樹，ProtParam Tools 預測其理化性質，PSIPRED預測其二級結構，SWISS-MODEL預測其三級結構。利用網絡服務器 IEDB內相關軟件和Preprod，對Bac蛋白T細胞抗原表位進行預測。用DNAStar對Bac的B細胞抗原表位進行預測。結果經測序鑒定，本研究成功克隆出了粉塵螨Bac基因，其開放閱讀框396 bp，編碼131組氨基酸。將Bac基因導入大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)，經IPTG誘導后高效表達Bac重組蛋白。該蛋白主要以可溶性形式存在，蛋白分子量約14 kDa。間接ELISA法證明Bac能與粉塵螨過敏患者血清IgE結合。測序發現本實驗室克隆的粉塵螨Bac基因與GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性為96%。系統進化樹結果顯示粉塵螨與屋塵螨親緣關系比較近。理化性質預測顯示Bac蛋白質較穩定。二級結構及三級結構預測結果顯示Bac的結構主要以無規則卷曲組成。T細胞抗原表位預測得到 4個肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130)。B細胞抗原表位預測得到6個肽序列(15-30、26-40、44-59、58-73、95-110、101-116)。結論成功克隆并表達了粉塵螨Bac，并證實重組Bac蛋白具有良好的免疫原性，為進一步研究塵螨過敏原的結構成分及其理化性質奠定理論基礎。

Supported by the Natural Science Foundation of China (Nos. 91442118 & 31400786), the Science and Technology Social Development Project Plan of Guangdong Province (No. 2013B03180002), the Science and Technology Cooperation Project of Guangdong Province (No. 2013B051000088), the Public Welfare Research and Capacity Construction in Guangdong Province Special Funds (No. 2013B031800023), the Science and Technology Plan of International Technology Cooperation Projects of Shenzhen (No. GJHZ20130408174112021), the Science and Technology Plan of Basic Research Project of Shenzhen (No. JCYJ20140828163633992)