戊型肝炎病毒衣殼蛋白及其中和表位的結構研究進展

鄭明華，王凱航，李　瓊，張　曉，李少偉,，夏寧邵,

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戊型肝炎病毒衣殼蛋白及其中和表位的結構研究進展

鄭明華1，王凱航1，李瓊1，張曉2，李少偉1,2，夏寧邵1,2

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的病毒性肝炎，被證實為人獸共患病，該病癥對免疫力低下人群和已有基礎性肝病的患者的危害更為顯著。戊肝病毒主要通過糞口途徑傳播，豬是其主要的天然宿主。近年來，關于戊肝病毒的衣殼蛋白及其表位結構的研究取得了重要的進展，對于戊肝病毒的病毒學研究和戊肝疫苗的機制探討起著重要的指導意義。本文將綜述HEV病毒衣殼蛋白的結構研究和中和表位的結構基礎，著重說明戊肝病毒中和表位存在型特異性和型交叉兩種特征，提示型交叉表位與人獸共患現(xiàn)象的關系。

戊型肝炎病毒；人獸共患；結構；中和表位

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的病毒性肝炎。截至2005年，戊型肝炎已在全球9個地區(qū)的人群中發(fā)生大規(guī)模流行。2012年WHO的最新報道指出，全世界范圍內(nèi)，每年約有1 400萬例臨床戊肝患者，死亡人數(shù)高達30萬，并造成5 200例胎兒死亡。戊型肝炎病例死亡率約0.2%～4%，孕婦、老年人等免疫力低下人群和已有基礎性肝病的患者更易發(fā)生感染，而孕婦感染癥狀尤甚，死亡率高達20%[1]。更多的調(diào)查也表明，在豬、牛、羊、雞、魚等非靈長類動物中也發(fā)生過戊型肝炎病毒的感染[2-8]。

戊型肝炎病毒是一種無包膜的單鏈正義RNA病毒[9]，主要有4種基因型，基因I型和II型只感染人類，基因III型和IV型多引起人畜共患病[2，10]。病毒基因組全長7.2～7.5 kb，包含3個開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)[11]。其中，ORF1編碼的是非結構蛋白，ORF3與病毒的組裝和釋放有關[12]，ORF2段則編碼了戊型肝炎病毒單一的結構蛋白[13]，即衣殼蛋白。衣殼蛋白決定了病毒的宿主嗜性及吸附、入胞機制，其中的抗原中和表位是起始病毒感染、決定病毒宿主類型和激發(fā)機體產(chǎn)生免疫保護的重要結構區(qū)域。因此，深入研究HEV結構及其抗原表位的結構對HEV的病毒學和免疫學的研究具有重大意義。目前，有多個研究小組利用X射線晶體學和低溫電鏡三維結構重建技術解析了HEV衣殼蛋白及其免疫復合物的三維結構，揭示了衣殼蛋白的組裝機制，中和表位區(qū)域以及型特異性和交叉性等的結構基礎，本文將綜述這些研究進展。

1　戊型肝炎病毒結構研究

1.1HEV天然病毒粒子的結構1983年，病毒學家利用免疫電鏡(Immune Electron Microscopy，IEM)在肝炎病人的糞便樣品中觀測到戊肝病毒的球形顆粒[9]。顆粒直徑約27-34 nm，顆粒表面呈現(xiàn)明顯的凸起和缺刻結構，經(jīng)觀察病毒顆粒存在實心顆粒與空心顆粒兩種形式，其中實心顆粒為完整的天然戊肝病毒粒子，約占總數(shù)的2/3；而空心顆粒被認為是有缺陷的病毒粒子，約占病毒顆粒總數(shù)的1/3。這是人類首次獲得戊肝病毒顆粒的結構信息，從而開啟了戊肝病毒的基礎和相關的應用研究，特別是重組疫苗的研究。

1.2HEV衣殼蛋白二聚體結構研究研究表明，HEV衣殼蛋白可形成同源二聚體，主要的免疫中和表位與二聚體的形成相關，決定了病毒的宿主嗜性以及感染入胞機制。Li等于2009年成功解析了基因I型HEV衣殼蛋白結構域E2s(aa 459-606)的晶體結構。對應于顆粒結構中每個單體的P(P2)結構域，分辨率可達2.0。兩個E2s單體形成緊密的同源二聚體，二聚體之間主要依靠疏水相互作用維持，其中每個單體的Val503、Trp548、Thr552、Ala555、Tyr557、Tyr561、Val598和Val600參與形成疏水簇；另外由8個殘基Arg542、Lys544、Ser546、Thr552、Thr553、Asn562、Thr564和Ser566參與形成的氫鍵相互作用也參與了二聚體的形成。E2s二聚體中每個單體上都存在一個凹槽區(qū)，該區(qū)是病毒與宿主相互作用的關鍵區(qū)域，并且是免疫優(yōu)勢中和單抗8C11的結合區(qū)域；而二聚體內(nèi)單體相互作用界面附近則是另一個免疫優(yōu)勢中和抗體8G12的結合區(qū)。此外，富含疏水性氨基酸的肽段aa 597-602也位于結構蛋白形成的同源二聚體的結構界面。氨基酸位點Tyr557、Tyr564、Val598、Ala599、Leu601和Ala602對二聚體的形成和維持起到了至關重要的作用[14]。后續(xù)Tang等解析了基因IV型E2s的晶體結構。發(fā)現(xiàn)基因IV型E2s同樣形成緊密的二聚體。基因I型和IV型E2s結構疊加結果表明，二者全部的Cα原子疊加時RMSD值為0.7，說明兩種基因型別的E2s空間結構高度相似[15](圖1)，這為解釋不同基因型的HEV具有同一種血清型提供了結構基礎。

圖1　基因I型、IV型戊型肝炎病毒E2s結構域晶體結構解析Fig.1　Structures presentation of E2s dimer of genotype I and IV hepatitis E virus

1.3HEV類病毒顆粒的結構戊型肝炎病毒基因組ORF2編碼單一的結構蛋白，利用基因工程在不同的宿主細胞中表達不同長度的截短形式可以組裝成為大小不同的類病毒顆粒(圖2)。

1.3.1T=1的類病毒顆粒ORF2編碼的結構蛋白(protein encoded by ORF2，pORF2)N端缺失111個氨基酸、C端缺失53個氨基酸時，所產(chǎn)生的截短蛋白在表達、純化后可在體外自發(fā)地組裝形成T=1的正二十面體對稱結構。研究者們在桿狀病毒表達系統(tǒng)中(baculovirus exoression vector system，BEVS)利用昆蟲細胞Tn5表達了ORF2片段(aa112-660)，并獲得病毒顆粒。其中，Xing等首次借助低溫電鏡三維重構技術獲得了分辨率為22 ?的T=1類病毒顆粒三維結構，位于顆粒外表面的突出部分以二聚體的形式存在，外表面上有30個重復的二聚體單位，即T=1的類病毒顆粒由60個單體構成[16]。中山大學和北京大學的研究人員則解析了分辨率為9.8 ?的基因IV型T=1的類病毒顆粒結構。顆粒結構大致可以分為S和P兩個結構域，每個二倍軸頂點有兩個單體形成二聚體并向外延伸形成突起結構，由于P結構域沒有參與三倍軸部分的結構形成而導致了一定的結構凹陷，在五倍軸部分由單體的延伸密度形成了五葉花狀的構造。由此可知，T=1類病毒顆粒的結構域分割大致與諾瓦克病毒類似[17]。目前由BEVS獲得的基因I、III、IV型T=1類病毒顆粒的晶體結構已經(jīng)得到解析。

圖2　戊型肝炎病毒類病毒顆Fig.2　Structures presentation of T=1 and T=3 hepatitis E virus-like particles with different genotypes

最早解析的是基因III型T=1類病毒顆粒的結構。由ORF2段aa 112-608在昆蟲細胞(Sf9)中成功獲得表達。每個單體分子可分為3個不同的結構域：S區(qū)(aa 129-319)、P區(qū)(aa 320-455)、M區(qū)(aa 456-606)。S區(qū)主要構成整個顆粒的內(nèi)殼，包含8個反平行果凍卷樣的β折疊和4個短的α螺旋，實驗證實Tyr288在5倍軸的形成過程中起到了非常關鍵的作用，并且位于S區(qū)的芳香族氨基酸是非常保守的。M區(qū)包含了4個扭曲的β折疊和4個短的α螺旋，其與S區(qū)緊密地相互作用，位于空間對稱的三倍軸位置。M區(qū)與P區(qū)通過一段富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)連接，P區(qū)主要包含扭曲的反平行β折疊，該區(qū)域以二聚體的形式存在，位于空間對稱的二倍軸位置[18]。

Guu等人于2009年解析獲得了基因IV型T=1類病毒顆粒的晶體結構，由ORF2(aa 118-608)在昆蟲細胞(Sf9)中表達獲得。研究者同樣將每個單體分為3個結構域：S區(qū)(aa 118-313)、P1區(qū)(aa 314-453)和P2區(qū)(aa 454-608)。每個結構域的空間構象與基因III型T=1類病毒顆粒的空間構象一致。該研究進一步探究了影響P2區(qū)二聚體形成的關鍵氨基酸為Ala597，Val598，Ala599，Leu601和Ala602。研究還發(fā)現(xiàn)在P1區(qū)和P2區(qū)分別存在一個潛在的糖基化位點，這2個位點可能與病毒粒子和細胞受體的結合有關，糖分子與P1區(qū)的結合可能會導致衣殼蛋白的解聚和入胞[19]。

Xing等人利用昆蟲細胞Tn5表達獲得了基因I型的蛋白片段aa 112-606，并且可以自組裝為T=1的類病毒顆粒，通過解析獲得的晶體結構分辨率為3.8 ?，同樣每個單體被分為S區(qū)(aa 118-317)、P區(qū)(aa 318-451)和M區(qū)(aa 452-606)。S區(qū)內(nèi)部的各亞基之間的相互作用用以穩(wěn)定整個殼體。通過對三種基因型的序列進行比對發(fā)現(xiàn)S區(qū)的序列是最為保守的，但在完整序列的N末端也存在一定的變異度，aa 118-129在T=3的類病毒顆粒中起到了橋接N末端和S區(qū)的作用[20]。

1.3.2T=3的類病毒顆粒Xing等人借助BEVS表達ORF2片段aa 14-608，自組裝類病毒顆粒，利用低溫電鏡三維重構技術對視野中直徑相對較大的顆粒進行圖像采集和三維重構，獲得分辨率為10.6 ?的T=3類病毒顆粒的空間結構。分析發(fā)現(xiàn)顆粒表面存在90個突觸，即顆粒由180個單體組成，這與T=3的病毒粒子構成形式一致。構成顆粒的所有單體被分為3種類型(A、B、C)，在5倍軸位置形成A-B型二聚體，在二倍軸位置形成C-C型二聚體。A-B二聚體的N末端沒有結合核酸并且構象更加彎曲，相反地C-C二聚體的構象則相對平緩，并且將富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)擠壓到M區(qū)所形成的裂縫外，因此C-C二聚體相對于A-B二聚體來說具有更大的柔性[20]。

1.3.3嵌合病毒粒子的結構解析Wang等利用基因融合技術構建了戊肝病毒ORF3編碼的一段多肽(aa 70-123)與ORF2編碼的衣殼蛋白(aa 112-608)的融合蛋白。研究者們用晶體結構解析及低溫電鏡三維結構重建技術獲得分辨率為8.3 ?的融合蛋白晶體結構和分辨率為24 ?的嵌合病毒粒子的空間結構。該嵌合顆粒由60個蛋白單體構成類似于T=1的顆粒形式[21]。Xing等利用基因融合的方式將一段含有11個氨基酸的B細胞標簽融合到戊肝病毒衣殼蛋白單體的C末端，經(jīng)過多種方式檢測，多肽的融合并未影響到戊肝病毒類病毒顆粒的組裝，而結構的解析也表明，將外源多肽融合在C末端并未影響顆粒的組裝以及每個結構域在空間的排布形式[22]。

類病毒顆粒三維空間結構的解析，對于進一步理解病毒顆粒的組裝機制和疫苗的研發(fā)具有重要的指導意義；而嵌合病毒粒子的研究則為將戊肝類病毒顆粒開發(fā)成為顆粒載體奠定了基礎。

2　基于結構生物學的戊型肝炎病毒抗原表位的研究

ORF2編碼的抗原表位是戊肝病毒的主要抗原表位。免疫優(yōu)勢表位區(qū)域集中在aa458-607，aa394-606段，該區(qū)多肽所形成的蛋白二聚體形式是維持正確表位構象所必需的[23-24]。目前為止，已公開發(fā)表的戊肝病毒表位有：構象表位8C11、8G12、8H3、Fab224、MAB1323和MAB272以及線性表位HEV#4、HEV#31、12A10和16D7。其中，8C11、8G12和Fab224是基于結構生物學的方法來進行精確定位的。

圖3　E2s-8C11Fab晶體結構與8C11的基因型特異性Fig.3　Crystal structure of E2s-8C11Fab and genotype specificity determinants for virus neutralization

2.1型特異性抗體8C11所識別的表位結構Zhang等人通過雜交瘤技術篩選獲得了一株高親和力的中和抗體8C11，該抗體能夠有效地捕獲并中和病毒，目前已被成功運用于戊肝疫苗質(zhì)量控制體系中[7，25]。Tang等利用晶體培養(yǎng)及X射線衍射的方法探究了8C11的結合位點，通過晶體培養(yǎng)優(yōu)化、X射線衍射和分子置換相位解析的方法獲得了高分辨率的E2s-8C11Fab抗原抗體復合物(1.90 ?)和基因IV型HEV E2s蛋白(1.79 ?)晶體結構。結構表明，1個E2s結合兩個8C11Fab分子(圖3，A)，8C11識別HEV構象型表位位于Asp496-Thr499、Val510-Leu514和Asn573-Arg578 3個非連續(xù)區(qū)段，進一步研究表明Glu479、Ser97、Arg512、His577、Arg57和Lys534是8C11的結合位點，其中，Arg512是參與抗原抗體相互作用最為關鍵的氨基酸，同時也是HEV與宿主細胞相互作用的關鍵位點。

為了探討8C11的型特異性，Tang等將E2s(IV)的結構與E2s-8C11Fab復合物結構進行疊加，得到E2s(IV)-8C11Fab的復合物模型，并對HEV基因I、IV型的2個復合物結構進行對比，從而分析這2個基因型在識別8C11時的型特異性(圖3，B)。8C11與基因I、IV型的結合位點中有2個不同的氨基酸，分別為497位點和575位點，其中基因I型為Ser497(I)和Ala575(I)，而基因IV型為Thr497(IV)和Pro575(IV)。在HEV (I)型 E2s-8C11 Fab復合物中，Ser497(I)和8C11 Fab的Gly93有一個氫鍵相互作用，同時也和E2s的Arg512(I)形成氫鍵。然而，在E2s(IV)-8C11Fab復合物中，Thr497(IV)與8C11之間有空間位阻，且其產(chǎn)生的范德華斥力導致Arg512(IV)側鏈位置難以滿足3個氫鍵的形成，這使得Thr497(IV)與Arg512(IV)之間無相互作用(圖3，B)。這些結果提示aa497在區(qū)別HEV基因I、IV型時起到關鍵作用[22]。該項研究首次鑒定了HEV的型特異性中和表位結構，并闡明HEV ORF2的497位點決定了HEV基因I型和基因IV型的分子差異，為不同型別戊肝病毒的宿主選擇、受體差異等現(xiàn)象的解釋提供結構信息。2.2HEV病毒基因型間交叉中和抗體8G12所識別的表位結構HEV基因型間交叉中和抗體8G12對4種型別的戊肝病毒均能識別。Gu等人利用X射線晶體衍射方法解析了HEV交叉中和抗體8G12所識別的表位結構，獲得了分辨率為2.3 ?的E2s(IV)-8G12Fab復合物晶體結構和分辨率為4 ?的E2s(I)-8G12Fab復合物晶體結構。

晶體結構分析表明，在復合物中一個E2s二聚體結合2個8G12Fab分子(圖4，A,B)，抗原與抗體之間主要通過氫鍵發(fā)生相互作用，8G12Fab結合在E2s二聚體的交界面附近。Fab分子由重鏈與抗原分子發(fā)生相互作用。一個Fab分子與二聚體中的一個單體發(fā)生主要的相互作用，而與另一個單體也存在較弱的相互作用。對相互作用界面的分析表明，Glu479、Arg542、Glu549、Thr553、Lys554、Thr564、Thr586、Gly589、Ala590(I)/Ser590(IV)、Gly591、Pro592位點參與了抗原與抗體的相互作用。對比2種復合物的結構發(fā)現(xiàn)，上述11個位點中除590位點外其余的位點在兩種型別的E2s中是完全一致的。序列比對表明，除590位點之外的10個位點在不同的基因型毒株中高度保守。經(jīng)Western Blotting、酶聯(lián)免疫吸附實驗以及分析超離等實驗驗證，8G12識別的關鍵位點是E549、K554、G591，而G591、P592、T553位點識別作用減弱(圖4，C)。利用血清阻斷與細胞吸附試驗則證實，中和抗體8G12識別的表位是優(yōu)勢中和表位，且該表位在p239顆粒吸附進入細胞的過程中起到關鍵作用[26]。

這項研究闡明了不同基因型共有一種血清型的結構基礎，有力地推動了戊型肝炎病毒基礎生物學的相關研究，同時為研制不受病毒型別限制的普適性疫苗提供了堅實的理論依據(jù)；除此之外，型交叉優(yōu)勢中和表位的研究有利于戊肝疫苗質(zhì)量控制體系的完善，依據(jù)表位信息和抗體的型交叉反應能力可監(jiān)測戊肝病毒的逃逸株，從而為疫苗的有效性提供支持和保障。

圖4　E2s-8G12Fab復合物晶體結構與表位展示[26]Fig.4　Crystal structure of E2s-8G12Fab and 8G12 epitope

2.3Fab224所識別的表位研究另一個基于結構生物學方法獲得的HEV表位結構信息是Fab224識別的表位。Xing等利用低溫電鏡三維重構技術解析獲得了該表位結構信息，共采集了615張圖片的信息用于三維結構的重建，通過分析最終確定Fab224的結合位點為：Glu479、Asp481、Thr484、Ser487、Tyr532、Ser533[27]。

3　總結與展望

本文綜述了戊型肝炎病毒衣殼蛋白在結構生物學的研究進展，闡述了衣殼蛋白的亞單位結構、類病毒顆粒結構以及免疫復合物結構等的特征和相應功能，對于理解HEV的病毒學和免疫學提供了重要的信息，特別是對于HEV的衣殼組裝、免疫表位和病毒細胞的相互作用的研究奠定了良好的結構基礎。結構信息對于理解HEV的診斷、疫苗機制和人獸共患疾病特征等具有重要的指導作用。由廈門大學為主研制的戊肝疫苗益可寧已于2012年在我國成功上市，其中的抗原p239為截短顆粒的HEV ORF2蛋白可自發(fā)形成類病毒顆粒，結構上包含部分的P1結構域和整個P2結構域(即突出結構域E2s)。在大規(guī)模臨床實驗中證實具有良好的安全性和戊肝保護性。今后應加強HEV的受體研究，解析衣殼蛋白和受體的復合物結構，為詮釋HEV的感染過程和免疫反應及其與宿主選擇和疾病的相關性等重要科學問題提供全新的視角，并在戊肝的防控中起到重要的作用。

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Structure studies on hepatitis E virus capsid protein and its underlying neutralization epitope

ZHENG Ming-hua1，WHANG Kai-hang1，LI Qiong1，ZHANG Xiao2，LI Shao-wei1,2，XIA Ning-shao1,2

(1.SchoolofLifeScience，XiamenUniversity，Xiamen361102，China;2.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectiousDiseases，XiamenUniversity，Xiamen361102，China)

Hepatitis E virus (HEV) is a causative pathogen of hepatitis E，one of the major acute infectious diseases，which has been recently proved as a zoonosis with main virus reservoir in domestic pigs. The virus is mainly spread by fecal-oral route and it’s more likely to infect the immunocompromised population and those who have suffered from liver disease. To date，there are numbers progress on the structure of hepatitis E virus capsid proteins and their immune complex with neutralizing monoclonal antibodies. These knowledge advances our understanding on the virology and immunology of hepatitis E virus，and subsequently benefits for the research and development of hepatitis E vaccine. Here，we review the key points in regard to the structure determination and immunologically functional basis of hepatitis E virus capsid protein. The summarized advances might shed lights on the theoretical basis for genotype specificity，cross-genotype feature and their correlation to zoonotic hepatitis E disease.

hepatitis E virus (HEV); zoonosis; structure; neutralization epitope

Xia Ning-shao，Email: nsxia@xmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.012

夏寧邵，nsxia@xmu.edu.cn

1. 廈門大學生命科學學院/國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門361102；

2. 廈門大學公共衛(wèi)生學院/分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，廈門361102

R373.2

A

1002-2694(2016)09-0825-07

2016-04-01；

2016-06-10