中老邊境地區江城縣登革熱媒介及病毒感染調查

王　劍，謝　呂，謝曉露，董學書，姜進勇，楊　波，李春敏，楊中華，孫曉東,林祖銳，周紅寧

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中老邊境地區江城縣登革熱媒介及病毒感染調查

王劍1，謝呂1，謝曉露2，董學書1，姜進勇1，楊波2，李春敏1，楊中華1，孫曉東1,林祖銳1，周紅寧1

目的了解中老邊境江城縣登革熱媒介的種群密度、孳生習性以及登革病毒自然感染情況，為邊境登革熱的防控提供參考。方法2015年6-10月在中老邊境江城縣選擇3個自然村作為固定監測點，采用人誘捕法誘捕白天成蚊，同時在監測點居民區進行幼蟲密度和孳生習性調查。捕獲的成蚊用液氮低溫保存帶回實驗室用RT-PCR進行登革病毒檢測。結果白天人誘法共捕獲7屬20種2 247只成蚊，其中白紋伊蚊1 405只，占捕獲總數的62.53%，其次為騷擾阿蚊438只，占捕獲總數的19.49%，未捕到埃及伊蚊，白紋伊蚊成蚊平均密度為16.7只/人工小時；白紋伊蚊幼蟲的平均房屋指數、布雷圖指數、容器指數和千人指數分別為12.0、18.3、2.2和25.4。8、9月是白紋伊蚊孳生和活動的高峰；白蚊伊紋幼蟲以輪胎、罐子和竹筒為主要孳生容器，3種容器占總陽性容器數比例分別為26.3%、23.4%和20.4%；人誘法捕獲成蚊RT-PCR檢測37組蚊蟲，黃病毒屬陽性17組，批陽性率為46.0%，未檢出登革病毒。結論中老邊境江城縣登革熱傳播媒介白紋伊蚊密度較高且分布廣，蚊蟲攜帶黃病毒屬病毒比例高，應加強當地登革熱監測工作。

蚊蟲；白紋伊蚊；登革熱媒介；登革病毒；中老邊境

江城縣位于云南省南部，東南與越南接壤，南與老撾交界，邊境線長達183公里，是云南省唯一與老撾、越南兩國接壤的縣城，地理位置十分特殊和復雜。屬亞熱帶濕潤氣候，特別適合各類蚊媒孳生。云南邊境登革熱疫情形勢嚴重，2009-2014年底云南省共報告登革熱病例2 040例，其中本地感染病例1 579例、輸入病例461例，在輸入病例中，緬甸和老撾輸入病例比例最高(占79.83%)[1]，2013-2014年在中緬邊境的西雙版納州景洪、勐臘和德宏州瑞麗先后出現4起暴發疫情[2-4]。西雙版納州景洪、勐臘兩縣和江城山水相連，國內和國外登革熱疫情嚴重威脅著邊疆各民族的健康。所以該調查在2015年6-10月在中老邊境江城縣建立監測點，旨在進一步弄清中老邊境江城縣登革熱媒介的種群組成、分布、孳生習性以及季節的消長情況，并對蚊蟲登革病毒自然帶毒情況進行初步調查，報告如下。

1　材料與方法

1.1現場選點選擇江城縣鄰近老撾邊境的3個鄉鎮的3個自然村(整董鎮曼嫁村、康平鎮二官村和國慶鄉麻栗樹村)作為固定監測點，3點居民數分別為202人、433人和287人。在2015年6-10月每月在檢測點居民生活區屋內外進行幼蟲密度監測，同時在居民區附近竹林或林區開展人工誘捕成蚊。用GPS紀錄點地理信息和調查地理環境、人口等基本現場調查信息。

1.2蚊蟲調查方法

1.2.1成蚊種群組成及密度調查6-10月每月在以上3個自然村附近的竹林或林區內進行人工誘捕成蚊，誘捕時間在下午16∶00-18∶00蚊蟲活動高峰時間進行，每月每點誘捕1次。誘捕采集的蚊蟲帶回實驗室-20 ℃凍死然后分類鑒定[5]并計數，登記誘捕人工和時間計算密度，成蚊密度計算方法為：捕獲蚊蟲數/人工小時。鑒定后蚊蟲每管50只放入液氮罐保存。

1.2.2幼蟲密度及孳生習性調查6～10月每月在以上3個自然村居民區屋內外進行幼蟲調查，每月每村調查50戶，共150戶。調查時以戶為單位，在每戶屋內外有積水的容器中撈捕幼蟲或蛹，登記積水容器數、積水類型和白紋伊蚊幼蟲或蛹的陽性容器數等信息。白紋伊蚊幼蟲密度用房屋指數(HI)、布雷圖指數(BI)、容器指數(CI)和千人指數表示。

1.3蚊蟲自然帶毒檢測

1.3.1蚊蟲RNA提取隨機將每種蚊種以50只蚊蟲計為1組參照試劑盒說明提取蚊蟲RNA[6]。每個1.5 mLEP管加入600 μL RLplus，加入研磨珠，于組織研磨機(上海凈信科技，JXFSTPRP-24)上60HZ研磨1 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清至另一1.5 mL RNase-Free 離心管中。上述樣品中加500 μL無水乙醇，輕柔混勻15 s。將該液體分2次加入CR3吸附柱中(630 μL/次)，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入700 μL RW1洗液，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入500 μL RW洗柱，室溫靜置2 min，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；重復一次此步驟。原管離心14 000 r/min，1 min，甩干柱子。將柱子置于一個新1.5 mL RNase-Free EP管中，加100 μL RNase-Free H2O，室溫放置2 min，12 000 r/min，離心2 min，收集洗脫后的RNA，立即進行后續試驗或存于-80 ℃冰箱。

1.3.2逆轉錄反應(Reverse Transcription,RT)將1 μL Oligo-(dT)15、1 μL Quant Reverse Transcriptase、2 μL 10×RT Mix、2 μL Super pure dNTPs(2.5 mmol/L each)、3 μL RNase-Free ddH2O及10 μL RNA模板混勻離心后，37 ℃ 60 min，逆轉錄為cDNA(使用TIANGEN(BEIJING)，批號：KR103，Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒)，-20 ℃保存。

1.3．3PCR檢測黃病毒(50 μL體系)用黃病毒通用引物Malm：AAC ATG TTG GGR AAR AGA GAG AA和Rcfm9279-9301：GTG TCC CAK CCK GCK GTR TCA TC各1 μL，2×TaqPCRmasterMix 22.5 μL，ddH2O 23.5 μL及cDNA模板2 μL充分混勻后于PCR儀上94 ℃預變性3 min；94 ℃變性25 s，53 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min進行第一輪PCR，擴增片段大小為260 bp；再用R9102-9123：ATY TGG TWY ATG TGG YTT GGA G和Rcfm9279-9301：GTG TCC CAK CCK GCK GTR TCA TC通用引物各1 μL，2×TaqPCRmasterMix 22.5 μL，ddH2O 23.5 μL及第一輪PCR產物 2 μL充分混勻后于PCR儀上94 ℃預變性3 min；94 ℃變性25 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min進行第2輪PCR，擴增片段大小為200 bp。

1.3.4PCR檢測登革病毒(25 μL體系)黃病毒篩查陽性樣品再用登革病毒特異性引物進行PCR篩查，D1：TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G和D2：TTG CAC CAA CAG TCA ATG TCT TCA GGT TC(10 μmol/L)各1 μL，GoTaq Green Master Mix 2×緩沖液12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL混合后于PCR儀上94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共35個循環；68 ℃延伸10 min進行第一輪PCR，擴增片段大小為511 bp；再用登革熱各血清型特異引物TS1：CGT CTC AGT GAT CCG GGG G，TS2：CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG，TS3：TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C，TS4：CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A，各1 μL；D1：TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G 1 μL；GoTaq Green Master Mix 2×緩沖液12.5 μL，ddH2O6.5 μL，第一輪PCR產物 1 μL混合后于PCR儀上94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共35個循環；68 ℃延伸10 min進行第二輪PCR，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型登革病毒擴增片段大小分別為482 bp、119 bp、290 bp、392 bp。

1.4數據統計分析現場數據輸入Excel表進行密度和構成比統計分析。

公式如下：

HI=合計伊蚊幼蟲或蛹陽性戶數/調查戶數×100

BI=合計伊蚊幼蟲或蛹陽性容器數/調查戶數×100

CI=合計伊蚊幼蟲或蛹陽性容器數/合計容器數×100

千人指數=合計伊蚊幼蟲或蛹陽性容器數/檢查房屋內人數×1 000

2　結　果

2.1成蚊密度及構成共捕獲7屬20種2 247只蚊蟲，分別為伊蚊屬(GeusAedini)6種、阿蚊屬(GenusArmigeres)6種、騷擾蚊屬(GenusOchlerotatus)3種、庫蚊屬(GenusCulex)2種、杵蚊屬(GenusTripteroides)1種、曼蚊屬(GenusMansonia)1種和直腳蚊屬(GenusOrthopodomyia)1種；其中白紋伊蚊(Ae.albopictus)1 405只，占捕獲總數的62.53%，為白天活動優勢蚊種；其次為騷擾阿蚊(Ar.subalbatus)438只，占捕獲總數的19.49%，詳見表1)。6-7月白紋伊蚊密度分別為2.3、13.1、25.4、31.3、11.5只/人工小時，平均密度為16.7只/人工小時；8-9月為該蚊密度高峰。

2.2幼蟲密度及孳生習性共調查積水容器3 221個，其中395個有幼蟲孳生，有幼蟲孳生的陽性容器率為12.3%，月平均積水容器4.3個/戶；白紋伊蚊陽性容器137個，占有幼蟲孳生容器的陽性容器率為34.7%；白蚊伊蚊的孳生容器中以輪胎、罐子和竹筒3種為主要孳生容器，3種容器陽性容器數量和占總陽性容器數比例分別為(36個，26.3%)、(32個，23.4%)和(28個，20.4%)；8-9月為該蚊種幼蟲孳生高峰；白紋伊蚊幼蟲平均HI、BI、CI和千人指數分別為12.0、18.3、2.2和25.4(見表2)。

2.3病毒檢測結果對6-10月監測點人誘法誘捕的成蚊37組(1 850只)進行RT-PCR病毒檢測，共檢測出黃病毒屬陽性17組，黃病毒屬批陽性率為46.0%，其中檢測白紋伊蚊26組(1 300只)有13組陽性、8組騷擾阿蚊(400只)有2組陽性、3組圓斑伊蚊(150只)有2組陽性。所有蚊蟲標本均未檢出登革病毒(圖1)。

A:黃病毒M：標志物；18：黃病毒陽性對照；1-17：黃病毒陽性標本；M:marker;18:flavivirus positive control; 1-17: positive samples of flavivirus;

B：登革病毒M：標志物；36：登革病毒陽性標本；19-35：登革病毒陽性標本;M:marker;36:dengue virus positive control;19-35:negative sample of dengue virus;圖1　黃病毒和登革病毒RT-PCR檢測結果Fig.1　Results of flavivirus and dengue virus detected by RT-PCR

表1江城縣三監測點2015年6-10月份人誘成蚊數量及構成比

Tab.1The amount and composition of captured adult mosquitoes in three surveillance sites of Jiangcheng County from June to October, 2015

蚊蟲種類Mosquitospecies整董鎮曼嫁村ManjiavillageofZhengdongtow康平鎮二官村ErguanvillageofKangpingtow國慶鄉麻栗樹村MalishuvillageofGuoqingtow合計Total捕獲數capturenumber(只)構成比constituentratio(%)捕獲數capturenumber(只)構成比constituentratio(%)捕獲數capturenumber(只)構成比constituentratio(%)捕獲數capturenumber(只)構成比constituentratio(%)白紋伊蚊Ae.albopictus44871.0070659.0825159.62140562.53騷擾阿蚊Ar.subalbatus6910.9429524.697417.5843819.49圓斑伊蚊Ae.annandalei7211.41867.20317.361898.41尖斑伊蚊Ae.craggi233.65342.8592.14662.94達勒姆阿蚊Ar.durhami50.79242.01184.28472.09側白騷擾蚊Oc.albolateralis50.79151.2692.14291.29中點伊蚊Ae.mediopunctatus60.95121.000.000.00180.80偽白紋伊蚊Ae.pseudalbopictus00.0060.50122.85180.80大森騷擾蚊Oc.omorii20.3270.5900.0090.40窄翅伊蚊Ae.lineatopennis00.0050.4220.4870.31白胸杵蚊Tr.pallidothorax00.0000.0040.9540.18常型曼蚊Ma.uniformis00.0010.0820.4830.13白斑阿蚊Ar.inchoatusBarraud00.0030.2500.0030.13勐臘阿蚊Ar.menglaensis00.0000.0030.7130.13哈維騷擾蚊Oc.harveyi00.0000.0020.4820.09褐尾庫蚊Cx.halfuscanus00.0000.0020.4820.09長須阿蚊Ar.longipalpis00.0000.0010.2410.04環須阿蚊Ar.annulipalpis00.0000.0010.2410.04小擬態庫蚊Cx.mimulus00.0010.0800.0010.04類按直腳蚊Or.anophloides10.1600.0000.0010.04合計(7屬20種)total(20speciesof7Genus)631100.001195100.00421100.002247100.00

表2江城縣3個監測點2015年6-10月份白紋伊蚊幼蟲調查結果

Tab.2Results of Ae. aegypti larvae in three surveillance sites of Jiangcheng County from June to October, 2015

月份month整董鎮曼嫁村ManjiavillageofZhengdongtow康平鎮二官村ErguanvillageofKangpingtow國慶鄉麻栗樹村MalishuvillageofGuoqingtowHIBICI千人指數ThousandpersonindexHIBICI千人指數ThousandpersonindexHIBICI千人指數Thousandpersonindex6月441.64.9000.00.0220.53.67月16265.832.7661.06.914182.731.98月20347.341.510208.223.124344.646.99月30487.559.514327.637.026322.769.110月682.89.1441.04.6461.210.9均值meanvalue15.224.05.029.56.812.43.614.314.018.42.332.5

3　討　論

白紋伊蚊在云南省分布廣泛，主要分布在南部和西部的亞熱帶地區[7]，是云南省邊境地區主要優勢蚊蟲種類[8-9]，登革熱的主要媒介與埃及伊蚊和白紋伊蚊密切相關[10-12]，相關文獻也已證實了我國白紋伊蚊在登革熱流行中的重要作用[5,7]。云南白紋伊蚊對登革易感性和傳播率較高, 屬媒介能量較強的蚊種,具有重要的流行病學意義。現場調查和實驗研究確認, 該蚊是云南登革熱的主要傳播媒介[7],本次調查選點中老邊境江城縣，該區域在云南蚊類地理區劃中屬于熱帶雨林季雨林亞區的西雙版納小區[13]，該區屬哀牢山以西瀾滄江流域, 包括西雙版納州、思茅地區南部, 地處北回歸線以南, 屬典型的低山地帶, 河谷盆地海拔在1 000 m以下,年平均氣溫21%左右, 年降雨量1 500 mm以上, 相對濕度 80%左右。河谷邊緣及森林地帶溪溝、山澗、水坑、竹筒、樹穴等各類小型蚊類孳生地甚多, 蚊類屬、種為全省各小區之首，白紋伊蚊等蚊種為其代表種類。本調查在居民區附近竹林或林區共捕獲7屬20種2 247只蚊蟲，蚊蟲種屬豐富，其中白紋伊蚊1 405只，占捕獲總數的62.53%，為白天活動優勢蚊種，該結果和以往云南各地及邊境口岸相關調查的結果相符[7,9,13-14]，相關調查也顯示白紋伊蚊為云南居民區附近竹林和山坡林區的主要蚊種[7]；調查還顯示成蚊平均密度為16.7只/人工小時，和云南中緬邊境的同類調查[15]結果8.1只/人工小時相比，明顯高于該調查，分析其原因，除了和調查地江城邊境適宜的氣候更適宜白紋伊蚊孳生活動外，還可能和孳生環境隨著生產生活方式的不斷改變，居民區周圍有利于蚊蟲孳生的生活廢棄容器不斷增多有關；此外還可能與調查點的選擇代表性不全面和調查工具使用不當有關，例如同時同地的竹林邊緣處和竹林深處蚊蟲密度差別很大，本次在康平鎮二官村竹林調查同片竹林的內部和邊緣處密度相差最多時達5倍，往往竹林內部密度更高；另外捕捉工具也會影響調查結果，如傳統的吸蚊管，對操作者的熟練程度要求高，初次操作者會因為不熟練而人為造成捕獲率低，而電動吸蚊器則更易于掌握。如果不統一捕捉工具或培訓熟練工作人員，以上因素都會影響到我們客觀調查結果的準確性。而本次登革熱的另一主要傳播媒介埃及伊蚊雖未捕獲，但多年全省現場調查也證實該蚊分布區域呈現逐漸擴大的趨勢，自從云南2002年董學書[8]等在云南瑞麗市首次捕獲埃及伊蚊后，2010年后在云南德宏和臨滄的部分縣市也開始發現埃及伊蚊，2013年和江城縣相鄰的西雙版納州勐臘縣和景洪市也陸續監測發現埃及伊蚊的分布[3-4]。在中國和東南亞國家經濟、政治發展大戰略下，中老邊境雙方的人員流動和物資往來都將急劇增加，埃及伊蚊分布的擴大和病人輸入風險也將進一步增大。

幼蟲調查方面，本次白紋伊蚊幼蟲的平均布雷圖指數(BI)為18.3。而密度最高的9月份整董鎮曼嫁村布雷圖指數(BI)更是高達48。布雷圖指數(BI)為登革熱媒介傳播風險的重要指標，大于20的地區就表明對疾病的傳播有較高的風險性，而本次調查的3個固定點平均布雷圖指數(BI)為18.3。密度高峰8、9月份時布雷圖指數(BI)均大于20，顯示了該地在蚊媒高峰期較高的傳播風險。調查還顯示8、9月是該蚊種幼蟲孳生和成蚊活動的密度高峰。結果和云南中緬邊境同類調查結果相符[15]；本次調查的白蚊伊紋的孳生容器中以輪胎、罐子和竹筒等為孳生容器，和董學書[7-9，14]等在云南多地調查結果相符，但本次調查以輪胎為主要孳生容器，而盧云蘭[15]等在云南邊境地區同類調查以竹筒為主要孳生容器，主要孳生容器發生了變化，分析其可能原因為，隨著經濟發展，邊境居民很多生產生活的用品和習慣都在逐漸發生變化，繼而影響到蚊蟲孳生的環境，例如以往邊疆的少數民族主要用竹子來做各種生活生產用具，現在很多工業化的產品如車輛的迅速普及，導致過去很多村寨遍地竹筒的景象已逐漸被成堆的輪胎取代。龔正達[16]等也對人為活動干擾對蚊蟲多樣性的重要影響進行了調查論證。人為活動的干擾導致了幼蟲孳生地的變化和改變，這些變化也對我們的邊境登革熱媒介防控提出了新的挑戰和要求。

本次調查發現當地蚊蟲攜帶黃病毒屬病毒比例高(批陽性率為46.0%)，建議以后進行更深入的病毒屬種調查。雖未在當地的白紋伊蚊體內檢測到登革病毒，但相關研究證實白紋伊蚊對登革病毒具有較高的易感性和傳播性,并從自然界白紋伊蚊中分離到了登革病毒[17-18]；李雪東等[19]和徐普庭等[20]分別從云南白紋伊蚊中分離到登革病毒；江城縣的相鄰州市也從白紋伊蚊和人群體內檢測到了登革病毒[2-4，7，21]；加之云南邊境連續幾年的登革熱暴發流行[2-4]，且本次調查發現白紋伊蚊在當地占有絕對的種群優勢，構成比高達62.53%，叮人密度為16.7只/人工小時；蚊媒高峰的8、9月份幼蟲布雷圖指數(BI)值都大于20。以上調查結果提示中老邊境發生登革熱病例輸入并引起當地暴發流行的風險極高，相關部門應從邊境聯防聯控項目為基礎，進行多國家多部門的登革熱疫情、媒介和邊境居民衛生宣傳等方面的聯合、綜合防控工作。本調查研究可為云南中老邊境登革熱的防控、科研提供參考。

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Dengue vectors and the natural infection in border with Laos, Jiangcheng County,China

WANG Jian1, XIE Lü1, XIE Xiao-lu2, DONG Xue-shu1, JIANG Jin-yong1,YANG Bo2,LI Chun-min1, YANG Zhong-hua1, SUN Xiao-dong1, LIN Zu-rui1, ZHOU Hong-ning1

(1.YunnanProvincialKeyLaboratoryofVector-borneDiseasesControlandResearch,YunnanProvincialCenterofArborvirusResearch,YunnanProvincialCollaborativeInnovationCenterforPublicHealthandDiseasePreventionandControl,YunnanCenterforMalariaResearchofYunnanInstituteofParasiticDisease,Pu’er665000,China;2.JiangchengCenterforDiseaseControlandPrevention,Jiangcheng665900,China)

We investigated the population density, ecological habitats and the natural infection of the dengue vectors in border with Laos in Yunnan Province, so as to provide data for the prevention and control of dengue fever in border area of Yunnan Province. We selected three villages in Jiangcheng County as surveillance sites from June to October，2015. Adult mosquitoes active in the daytime were captured by human-landing catche method. Meantime, the ecological habitats of adults mosquitoes and population density of larvae in the three surveillance sites were also investigated. The captured adult mosquitoes were carried by liquid nitrogen container and dengue virus in mosquitoes was detected by RT-PCR. Results showed that a total of 2 247 adult mosquitoes were captured by human landing catches in the daytime and mosquitoes classification was 20 species in 7 genus with 1 405Ae.albopictus(62.53%) as dominant species and 438Armigeressubalbatus(19.49%) as subordinate species.Ae.aegyptiwere not captured. The average population density ofAe.albopictusadults was 16.7 per person hour. The average house index (HI), breteau index (BI), container index (CI) and thousand-person index ofAe.albopictuswas 12.0, 18.3, 2.2, and 25.4 respectively. The density peaked in August and September. The dominant breeding environment ofAe.albopictuswere used tires, bamboo tubes, jar, and, accounting for 26.3%,23.4% and 20.4% of positive water containers, respectively. RT-PCR detection of 37 groups of mosquitoes from captured,Flavivirus positive 17 groups and the positive rate of group was 46.0%. Dengue virus was not identified. The dengue fever surveillance should be strengthened in Jiangcheng County bordered with Laos due to the wide distribution and high population density ofAe.albopictusin this district.

mosquitoes;Aedesalbopictus; dengue fever vector; dengue virus; border between China and Laos

Zhou Hong-ning, Email: zhn@yipd.org

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.015

周紅寧，Email: zhhn@ yipd.org

1.云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室、云南省蟲媒病毒研究中心、云南公共衛生與疾病防控協同創新中心、云南瘧疾研究中心、云南省寄生蟲病防治所，普洱665000；

2.江城縣疾病預防控制中心，江城665900

R373.3

A

1002-2694(2016)09-0843-07

2016-02-02；

2016-04-14

Supported by the National Natural Science Fund of China (Nos.30660160，30960327，81273138) and the Joint Control Project of Malaria and Dengue in China’s frontier areas adjacent to Laos, Yunnan, China.