大鼠心肌缺血-再灌注損傷miRNA-214介導電針預處理的保護作用

柳培雨,田　毅,鮑縵夕,王　玥,崔　芬

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大鼠心肌缺血-再灌注損傷miRNA-214介導電針預處理的保護作用

柳培雨1,田毅2,鮑縵夕3,王玥1,崔芬1

目的評估miRNA-214介導電針預處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用。方法雄性SD大鼠24只隨機分為四組(n=6)：假手術組(Sham組)、Sham+電針組(sham+EA)、缺血-再灌注組(I/R組)、缺血-再灌注+電針組(I/R+EA組)。Sham+EA組、I/R+EA組在心肌缺血-再灌注損傷實驗前3 d，每天給電針預處理。I/R組及 I/R+EA組行心肌缺血-再灌注造模。監測Sham組、sham+EA組、I/R組及 I/R+EA組大鼠的心功能指標，并測量心肌梗死面積。檢測乳酸脫氫酶、肌酸激酶活性，以及心肌細胞中miRNA-214的表達情況。結果與sham組比較，I/R組心功能指標均降低。I/R+EA組與I/R 組比較心功能指標均有所提高。I/R+EA組心肌梗死面積顯著小于I/R組。而I/R組乳酸脫氫酶、肌酸激酶活性顯著升高并高于I/R+EA組(P<0.05或P<0.01)。Sham組、sham+EA組 I/R組及 I/R+EA組大鼠的miRNA-214的表達分別為1、1.6、1.75和2.82，I/R組miRNA-214的表達高于sham組，電針預處理增加了sham+EA組和I/R+EA組的miRNA-214表達(P<0.01)。結論miRNA-214表達上調機制參與電針預處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的心臟保護作用。

心肌缺血-再灌注損傷； miRNA-214；電針；保護作用

心肌缺血-再灌注損傷性疾病正伴隨社會老齡化加劇而持續增加。自1986年心肌缺血預處理概念首次提出以來，預處理概念在醫學領域廣為應用。國內外已有一些學者進行了電針預處理技術應用于心臟保護的相關研究，并證實了此法的可行性。所謂電針療法是神經電刺激的物理療法與中醫針灸療法相結合而形成的，是指在中醫毫針的基礎上，使用脈沖發生器在針上通以接近人體生物電的微量電流波，以對機體實施持續、穩定、精確、可控的電刺激，產生電生理效應以獲得療效[1]。基礎研究已經證實，單獨“內關”穴電針治療對心肌缺血有顯著療效，然而電針對心臟保護作用的可靠機制尚未明確。微小核糖核酸-214(miRNA-214)是一系列心臟應激的敏感標志物，它在心臟肥大、心肌梗死、心肌缺血-再灌注和心臟衰竭時表達均上調，并發揮抗心肌保護作用。本研究旨在評估電針預處理對心肌缺血-再灌注損傷發揮保護作用，并評估是否有miRNA-214表達增強的機制參與其中。

1　材料與方法

1.1材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(280～300 g，廣州賽業公司提供)24只隨機分為4組，每組6只。假手術組(Sham組)、Sham+電針組(sham+EA)、缺血-再灌注組(I/R組)、缺血-再灌注+電針組(I/R+EA組)。Sham+EA組、I/R+EA組大鼠在心肌缺血-再灌注損傷實驗前3 d，每天給予雙內關穴4/20 Hz， 0.5 ms， 1 mA持續電針刺激30 min。I/R組及 I/R+EA組大鼠麻醉后結扎冠狀動脈左前降支(LAD)制作心肌缺血-再灌注模型，行缺血40 min，再灌注180 min。Sham組接受相同手術，但未行LAD結扎。

1.2心肌缺血-再灌注模型構建SD大鼠以3.5%水合氯醛50 ml/kg腹腔注射麻醉后，取背位固定于手術臺上。頸胸部去毛后皮膚消毒。于頸部正中切開皮膚，鈍性分離肌肉并暴露氣管，于氣管下穿線備用，用眼科剪在氣管上剪一倒T形口，將3.0號氣管導管插入氣管并固定后，連接動物呼吸機機械通氣，呼吸參數為呼吸頻率潮氣量為20 ml/kg，50 次/min，吸呼時比1∶1。逐層縫合頸部肌肉、皮膚。將大頭針刺入四肢皮下并連接心電監護儀。穩定5～10 min后記錄一段正常心電圖作為對照。行股靜脈穿刺，股部切開皮膚，小心分離股靜脈，其下穿線備用。遠心端結扎，在股靜脈上用眼科剪剪一小口，將充有肝素抗凝的穿刺管小心插入股靜脈，隨后收緊結扎線固定穿刺管，之后將切口覆蓋鹽水紗布保護。開胸結扎LAD，于胸骨左側2 mm切開皮膚，鈍性分離肌肉顯現肋骨，在第四肋間隙用眼科剪輕輕向下分離肋間肌，剪斷左側第3、4肋骨后，用拉鉤拉開胸壁，在兩側胸壁肌肉分別穿入一雙線，小心剪開心包膜，在左心耳下緣3～4 mm進針約1.5 mm，斜向右上方肺動脈圓錐方向進針，針距3～4 mm，分別將線兩端穿入小圈內并扎緊。立即觀察心電圖，若出現寬大畸形QRS波即為結扎成功標志，記錄心肌缺血開始時間，40 min后拉松結線，打開血管以實施心肌再灌注，立即觀察心電圖，數分鐘后出現QRS波回落變窄，再灌注180 min。之后獲取大鼠心臟。Sham組僅在LAD位置取同樣大小的針縫針但不打結，其他操作同手術組。

1.3電針預處理將兩支不銹鋼毫針刺入大鼠“內關”穴，即尺、橈骨縫間，距腕關節約3 mm處。兩毫針分別連接G6805-2電針治療儀(上海醫用電子儀器公司)的正、負電極，在心肌缺血-再灌注損傷實驗前3 d，每天給予大鼠持續電針刺激30 min。電針刺激頻率為4/20 Hz，脈沖密度為0.5 ms，強度1 mA，即以大鼠前爪輕顫為度。

1.4監測指標在再灌注180 min時，監測Sham組、sham+EA組 I/R組及 I/R+EA組大鼠的心率(HR)、平均動脈壓(MAP)、左室舒張末壓(LVSP)、最大左室壓上升/下降速率(±dp/dt)max 等心功能指標；采用伊文思藍(EB)/氯化三苯四氮唑(TTC)雙重染色，稱重法測定心肌梗面積；測定血液乳酸脫氫酶 (LDH) 和肌酸激酶 (CK)濃度；miRNA-214定量實時聚合酶鏈反應(qPCR)分析。

2　結　　果

2.1電針預處理后心功能指標得到改善再灌注180 min時，Sham組、sham+EA組 I/R組及 I/R+EA組的HR、MAP、LVSP、±dp/dt max 等心功能指標見表1。結果表明，Sham組與sham+EA組心功能指標差異無統計學意義。與sham 組比較，I/R組上述心功能指標均降低(P<0.05)。而電針預處理組能夠有效緩解心功能損傷。I/R+EA組與I/R 組比較心功能指標均有所提高(P<0.05)。

表1　各組大鼠電針預處理心肌缺血-再灌注損傷后心功能指標比較　(n=6；±s)

注：與sham比較，①P<0.05；與I/R組比較，②P<0.05

2.2電針預處理后心肌梗死面積縮小圖1顯示，心肌I/R損傷后梗死的大小。I/R+EA組心肌梗死面積顯著小于I/R組(P<0.05)。

圖1　I/R組與I/R+EA組大鼠電針預處理使心肌缺血-再灌注損傷后心肌梗死面積的比較與I/R組比較，①P<0.05

2.3電針預處理導致LDH和CK活性升高大鼠血清LDH和CK活性檢測結果顯示，與sham組比較，sham+EA組血清LDH 活性未發生變化，而I/R組LDH 活性顯著升高并高于I/R+EA組(P<0.01)。同樣，I/R組CK活性也顯著升高并高于I/R+EA組(P<0.05)。提示電針預處理能夠有效抑制I/R損傷所導致的LDH和CK活性升高(圖2)。

圖2　各組大鼠電針預處理抑制心肌缺血-再灌注損傷所致LDH和CK活性升高比較

與sham組比較，①P<0.05，②P<0.01；與I/R組比較，③P<0.05，④P<0.01

2.4miRNA-214與電針抗心臟I/R 損傷的心臟保護作用有關如圖3所示，與sham組比較，I/R組miRNA-214的表達增加(P<0.01)。電針預處理增加了sham+EA組和I/R+EA組的miRNA-214表達。

圖3　心肌組織中miRNA-214 表達水平的qPCR分析與sham組比較，①P<0.01；與I/R組比較，②P<0.01

3　討　　論

電針預處理是物理療法與中醫針灸理論相結合的預處理方法。已有多項研究證明，某些種類的電針預處理方法在心、腦等重要臟器的保護方面，具有積極作用。多項基礎實驗結果表明，電針預處理與心肌缺血預處理對于心肌缺血-再灌注損傷具有相似的保護效果。電針預處理心肌保護作用的可能機制研究較多，迄今為止電針預處理心肌保護機制尚未明確。大多數學者認為，電針預處理對心臟的保護作用與心臟釋放內源性心肌保護物質有關。電針預處理在心肌能量代謝方面的研究發現，電針刺激內關等穴位可改善心肌細胞能量代謝，抑制心肌缺血時發生的ATP 減少、ATP/ADP 比值下降、糖酵解增強、乳酸無和機磷含量增加、細胞內PH下降、線粒體膜結構破壞等病理生理反應；與之同時尚可顯著增加心肌糖原、ATP酶和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性，使缺血心肌細胞能量代謝和缺血、缺氧狀態得以相對緩解和改善。同時，有研究發現雙側穴位電針預處理的上述心肌保護作用優于單側[2-4]。

研究顯示，電針預處理可減少心肌缺血-再灌注損傷時，CK、LDH等心肌酶的含量，減低降鈣素基因相關肽、前列素F2、血栓素B2、內皮素-1的含量。使缺血血管內皮生長因子合成增加，使微動脈舒張，繼而增加局部血流量并使血壓下降，從而減輕再灌注時心肌細胞損傷[5,6]。此部分實驗，通過建立大鼠心肌缺血-再灌注模型并觀察到，雙內關穴電針預處理能夠減小心肌梗死面積，保護心功能，以及降低血清LDH和CK活性。

微小核糖核酸(miRNAs)是一類內源性的小核苷酸片段，大約30%的人類基因受miRNAs的調節。其中miRNA-214在缺血性心肌病等心血管疾病的病理生理過程中發揮著重要作用。miRNA-214在缺血-再灌注時損傷時可抑制活性氧和隨后的大量心肌細胞凋亡[7,8]。研究表明，miRNA-214在大鼠缺血心臟的梗死區及邊緣區的表達均有所上調，而且心肌細胞中的活性氧刺激對于miRNA-214過表達來說十分敏感，同時具有濃度依賴性，再灌注時心肌細胞內miRNA-214的表達隨活性氧濃度的增加而逐漸增加[9-13]。miRNA-214表達上調可以有效抑制由活性氧誘導的心肌細胞凋亡，反之當其表達下調時可以增加心肌細胞凋亡率。說明miRNA-214在心肌細胞中對發揮抗活性氧誘導的心肌細胞有凋亡作用[14-17]。

miRNA-214的人類第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)相關機制抗心肌細胞凋亡中的作用的相關研究發現，PTEN 是 miRNA-214 發揮抗活性氧心肌細胞損傷的作用靶點之一，PTEN 通路機制是miRNA-214在心肌缺血-再灌注損傷時發揮心臟保護作用的重要機制之一。同時相關研究發現，miRNA-214的低氧誘導因子1α抑制劑(HIF1AN)機制在心肌缺血-再灌注損傷時具有一定的保護作用。缺氧時低氧誘導因子1(HIF1)的過量生成對缺血-再灌注心肌具有損傷作用。miRNA-214可通過HIF1AN抑制HIF1-α而降低HIF1的DNA結合活性，參與缺血-再灌注損傷時的心臟保護作用[18-20]。

本研究結果表明，在缺血心肌中miRNA-214表達上調時，心臟收縮及舒張功能可得到明顯改善，可使左室收縮壓、壓力最大上升/下降速率的損害相對減少，左室舒張末壓、左室內徑、心率、心室重構受損程度相對較低。與筆者前期相關心肌細胞體外預處理誘導miRNA-214表達上調，可顯著改善缺血-再灌注時的心肌細胞功能的研究結果相似[6]。

綜上所述，本研究通過建立大鼠心肌缺血-再灌注模型來檢測電針預處理對在體及體外缺血-再灌注損傷的作用。研究結果顯示，電針預處理通過上調miRNA-214表達發揮心臟保護作用。

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(2015-04-06收稿2015-09-18修回)

(責任編輯岳建華)

miRNA-214 was involved in cardioprotection by electroacupuncture pretreatment of myocardial ischemia/ reperfusion injury in rats

LIU Peiyu1, TIAN Yi2, BAO Manxi3,WANG Yue1, and CUI Fen1.

1.Department of Anesthiology, 3. Hospital Office, Hainan Municapal Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Haikou 570203, China; 2. Department of Anaesthesiology，Haikou Hospital，Xiangya Medical College，Central South Univercity，Haikou 570208，China

ObjectiveTo evaluate whether miRNA-214 mechanism was involved in the cardioprotection by electroacupuncture pretreatment of myocardial ischemia/ reperfusion injury in rats. Methods24 male SD rats were divided into 4 groups randomly (n=6): control group (sham group), sham + electric acupuncture group (Sham+EA) group, ischemia/reperfusion group (I/R group), ischemia/reperfusion + electric acupuncture group (I/R + EA group). Rats in group sham+EA and I/R+EA received electroacupuncture stimulation 30 min per day for 3 days before myocardial ischemia/reperfusion injury. Rats in group I/R and I/R+EA received left anterior descending (LAD) occlusion for 40min and reperfusion for 180 min. The indices of the cardiac function, myocardial infarct size , LDH and CK activities as well as expression of miRNA-214 were measured. ResultsAll the indices of the cardiac function were not significantly different between the sham and the sham+EA group. Compared with the sham group, all the indices of the cardiac function decreased significantly in I/R group (P<0.05). I/R+EA group showed that all the indices of the cardiac function increased, compared with I/R group. Myocardial infarct size in I/R+EA group significantly decreased, compared with I/R group. The activity of LDH and CK in of I/R group significantly increased, compared with I/R+EA group (P<0.05 orP<0.01). The expression of miRNA-214 in sham, sham+EA, I/R and I/R+EA group were 1, 1.6, 1.75 and 2.82, separately. The expression of miRNA-214 in the I/R group was higher than in sham group. Electroacupuncture pretreatment increased miR - 214 expression in sham + EA group and the I/R + EA group. ConclusionsElectroacupuncture pretreatment can protect the heart against myocardial ischemia/ reperfusion injury and can promote the expression of miRNA-214 in rats.

I/R injury; miRNA-214; electroacupuncture; protective effect

海南省自然基金項目(編號：20158326)

柳培雨，博士，副主任醫師。

570203?？冢渚Ｄ峡傟犪t院:1.麻醉科, 3.院辦； 2.570208?？冢心洗髮W湘雅醫學院附屬?？卺t院麻醉科

田毅，E-mail：tianyi1975@126.com

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