轉染lncRNA Gm15638的小鼠腎小球系膜細胞中FN、Col Ⅰ表達變化

王蘇雨，王敏，姚迪，盧春，陸衛平

(1南京醫科大學附屬淮安第一醫院，江蘇淮安223300；2南京醫科大學)

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·基礎研究·

轉染lncRNA Gm15638的小鼠腎小球系膜細胞中FN、Col Ⅰ表達變化

王蘇雨1，王敏1，姚迪1，盧春2，陸衛平1

(1南京醫科大學附屬淮安第一醫院，江蘇淮安223300；2南京醫科大學)

目的觀察轉染長鏈非編碼RNA(lncRNA)Gm15638的小鼠腎小球系膜細胞SV40-MES13中纖維化標志物纖維連接蛋白(FN)和Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)的表達變化。方法 采用PCR法擴增lncRNA Gm15638片段，并將其插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體，構建重組慢病毒載體pCDH-Gm15638。用轉染試劑將重組目的質粒pCDH-Gm15638與包裝質粒psPAX2和包膜質粒pMD2.G共同轉染293T細胞，收集重組慢病毒懸液，測定病毒滴度。將SV40-MES13細胞分為實驗組和對照組，分別轉染pCDH-Gm15638和慢病毒空載體pCDH-Mock。轉染48 h后采用real-time PCR法檢測Gm15638驗證pCDH-Gm15638轉染情況；提取細胞總蛋白，采用Western blotting法檢測FN、Col Ⅰ。結果 雙酶切鑒定和測序結果顯示，重組慢病毒載體pCDH-Gm15638構建成功。通過三質粒包裝獲得重組慢病毒，測得病毒滴度約6×107efu/mL。實驗組、對照組細胞中Gm15638相對表達量分別為867、1，兩組相比，P<0.05。實驗組細胞中FN、Col Ⅰ相對表達量分別為0.739、1.08，對照組分別為0.48、0.845，兩組相比，P均<0.05。結論 轉染Gm15638的SV40-MES13細胞中纖維化標志物FN、Col Ⅰ表達水平下調。

長鏈非編碼RNA；腎小球系膜細胞；纖維連接蛋白；Ⅰ型膠原蛋白；糖尿病腎病

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中[1～4]。目前研究表明lncRNA參與細胞周期、細胞凋亡、細胞代謝等活動，并廣泛參與機體生理和病理過程，是多種疾病診斷及治療潛在的靶點[5]，但關于lncRNA與糖尿病腎病關系的研究較少。糖尿病腎病是糖尿病的嚴重并發癥，糖尿病腎病早期病理改變為腎臟增大，隨后有系膜細胞增生、系膜基質增多、腎小球基底膜增厚，最后可出現腎小球硬化[6]。糖尿病腎病的發生機制十分復雜[7,8]。本課題組前期通過lncRNA芯片對糖尿病腎病小鼠和正常小鼠的腎組織進行檢查，發現糖尿病腎病小鼠腎組織中lncRNA Gm15638表達明顯下調。為進一步探討Gm15638在糖尿病腎病發生發展過程中的作用，本實驗構建了表達Gm15638的重組慢病毒載體并轉染小鼠腎小球系膜細胞，觀察細胞中纖維化標志物纖維邊接蛋白(FN)和Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)的表達變化，現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料慢病毒表達系統由包裝質粒psPAX2、包膜質粒pMD2.G和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP三種質粒構成，所用的小鼠腎小球系膜細胞SV40-MES13及293T細胞均在5% CO2、37 ℃培養箱中培養，分別生長在含有5%、10%滅活胎牛血清的DMEM中，均加入青霉素和鏈霉素。相關PCR引物由南京銳真科技有限公司合成；PCR酶、限制性內切酶Nhe Ⅰ、BamH Ⅰ與SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；T4連接酶購自南京諾唯贊科技有限公司；質粒小提試劑盒、切膠純化試劑盒購自美國Omega公司；質粒轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；增強化學發光試劑購自美國Cell Signaling Technology公司；抗FN單克隆抗體、抗Col Ⅰ單克隆抗體、抗Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。

1.2重組質粒pCDH-Gm15638的構建及鑒定根據Ensembl的基因序列，分別設計Gm15638序列的上下游引物，PCR擴增出Gm15638序列全長，核酸電泳驗證PCR產物并切膠回收。用限制性內切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和Gm15638的PCR擴增產物，酶切產物經核酸電泳切膠回收，回收產物與載體pCDH連接后轉化入感受態細胞大腸埃希菌DH5α，隨機挑選氨芐西林抗性的單克隆進行大量擴增，提取出重組質粒pCDH-Gm15638進行雙酶切鑒定、基因測序。用LipofectamineTM2000將包裝質粒psPAX2、包膜質粒pMD2.G與目的質粒pCDH-Gm15638共同轉染入293T細胞，同時以慢病毒空載體(pCDH-Mock)作陰性對照。轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察到有大約90%的細胞出現明顯綠色熒光，收集含病毒顆粒的細胞上清液，離心并過濾病毒液。通過熒光計數法測定病毒滴度。

1.3重組質粒pCDH-Gm15638轉染SV40-MES13細胞用pCDH-Gm15638和pCDH-Mock分別轉染SV40-MES13細胞(分別為實驗組與對照組)，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。分別提取RNA并用real-time PCR法檢測Gm15638，以β-actin為內參，反應條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個循環。

1.4SV40-MES13中FN、Col Ⅰ檢測分別提取實驗組和對照組細胞總蛋白，采用Western blotting法檢測FN、Col Ⅰ，以Tubulin蛋白為內參。用Image J圖像分析系統軟件計算條帶灰度值，代表蛋白相對表達量。

1.5統計學方法采用SPSS19.0統計軟件。計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1Gm15638質粒的構建及鑒定結果構建pCDH-Gm15638質粒后進行雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后在7 742 bp和489 bp處出現2條特異性條帶(圖1)，說明長為489 bp的基因已成功克隆至慢病毒載體中。質粒送測序后經軟件比對，插入的489 bp片段與Ensembl基因庫中序列一致，表明重組質粒pCDH-Gm15638構建成功。將包膜質粒pMD2.G、包裝質粒psPAX2與目的質粒pCDH-Gm15638共同轉染293T細胞，以轉染pCDH-Mock的293T細胞作陰性對照，病毒滴度分別1×108、6×107efu/mL。

2.2重組質粒pCDH-Gm15638轉染SV40-MES13細胞情況兩組轉染后48 h熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達，陽性率為80%。實驗組與對照組細胞中Gm15638相對表達量分別為867、1，兩組相比，P<0.05。

2.3轉染pCDH-Gm15638后SV40-MES13細胞中FN、Col Ⅰ表達比較實驗組細胞中FN、Col Ⅰ相對表達量分別為0.739、1.08，對照組細胞中FN、Col Ⅰ相對表達量分別為0.48、0.845，兩組相比，P均<0.05。見圖2。

注：M為DNA標準參照物；1為Gm15638質粒的雙酶切產物;2為重組質粒pCDH-Gm15638的雙酶切產物。

圖1重組質粒pCDH-Gm15638的雙酶切鑒定結果

圖2　轉染pCDH-Gm15638后SV40-MES13細胞中FN、Col Ⅰ表達比較

3　討論

非編碼RNA(ncRNA)是不被翻譯成蛋白質的RNA的統稱，根據其功能分為持家ncRNA和調控ncRNA，持家ncRNA主要包含tRNA、rRNA、核內小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)，調控ncRNA包含lnc RNA和短鏈非編碼RNA[9]。lncRNA廣泛存在于生物體內，包括內含子、基因間轉錄本及雙向重疊的轉錄本，廣泛參與機體生理和病理過程。lncRNA可從表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控等參與基因的調控。目前，lncRNA的研究還主要集中在其表達差異的檢測，明確功能的lncRNA相對較少，對其作用機制的研究尚處于起步階段。

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發癥中最為嚴重的一種，如治療不及時，可導致終末期腎小球病變、腎衰竭，造成腎臟不可逆性損傷[10]。該病發病機制十分復雜，高血糖引起的代謝通路異常、多元醇代謝通路、氧化應激、晚期糖基化終末產物增多、炎癥介質水平增高等都可能是其發病原因，但具體機制尚未完全闡明，治療效果也并不理想[15]。糖尿病腎病的典型病理變化是腎小球硬化，組織學特點是基底膜增厚、細胞外基質堆積和腎小管基質纖維化，而基底膜主要是由膠原、非膠原糖蛋白和蛋白多糖構成，因此，纖維化和膠原蛋白增多可能是糖尿病腎病發生的重要因素[11,12]。

新近研究表明，ncRNA通過異常表達、甲基化、基因多態性等多種途徑在糖尿病的發病過程中起重要作用[16]。Alvarez等[17]研究表明，高糖狀態下LncRNA-PVTI能上調腎系膜細胞中纖溶酶原激活物抑制因子和轉化因子的表達，從而導致腎小球中細胞外基質積聚，FN-1水平增高。有學者[18]發現，lncRNA ANRIL可通過抑制胰島素依賴性蛋白激酶抑制因子2B的表達，引起P15INK4B基因低表達而導致糖尿病。Ravassard等[19]發現，HI-LNC25是一種胰島特異性lncRNA，能夠調控與糖尿病發生相關的蛋白編碼基因如GLIS家族鋅指3(GLIS3)的表達。糖尿病是導致動脈粥樣硬化的危險因素，Wu等[20]研究顯示，lincRNA-p21可通過調控p53信號轉導通路抑制血管平滑肌細胞和巨噬細胞的增殖、誘導凋亡，從而減少動脈粥樣硬化的發生。

Gm15638屬于基因間lncRNA，定位于4號染色體。本實驗成功構建了Gm15638表達質粒，成功構建了慢病毒，并轉染SV40-MES13細胞，發現SV40-MES13細胞中FN、Col Ⅰ表達下調，提示上調Gm15638表達可能有助于降低腎小球系膜細胞纖維化指標水平，延緩纖維化。我們猜測，Gm15638可能通過調控下游靶蛋白等途徑發揮作用，具體的調控機制仍有待進一步研究。

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江蘇省衛生廳科研項目(H201458)。

陸衛平(E-mail: hyhalwp@sina.com)

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R692.6

A

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2016-05-12)