阿奇霉素對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用及其機制

金梅花，金正勇，申英花

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

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阿奇霉素對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用及其機制

金梅花，金正勇，申英花

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

目的觀察阿奇霉素對新生大鼠高氧肺損傷的防治作用，并探討其機制。方法 選用2 d齡新生Wistar大鼠90只，隨機分為對照組、模型組、實驗組，每組30只。模型組和實驗組大鼠暴露在高氧模型箱內制作高氧肺損傷模型，實驗組大鼠同時腹腔注射阿奇霉素200 mg/(kg·d)，連用14 d。各組分別于建模3、7、14 d各處死10只大鼠，測定肺組織濕/干重比(W/D)，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)測定白細胞總數，觀察肺組織病理變化，采用Western blotting法檢測肺組織中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖調節蛋白78(GRP78)。結果 模型組建模3、7、14 d時肺組織W/D高于對照組和實驗組(P均<0.05)。模型組建模3、7、14 d時BALF中白細胞總數高于對照組和實驗組(P均<0.05)。對照組建模3、7、14 d時肺泡結構無明顯改變，無間質水腫，見少許炎癥細胞；模型組隨建模時間延長，肺組織損傷加重；實驗組建模后不同時間肺水腫程度、炎癥細胞量、肺泡體積等均較模型組明顯減輕。模型組建模3、7、14 d時肺組織中Bax蛋白相對表達量高于對照組和實驗組，Bcl-2蛋白相對表達量低于對照組和實驗組，Bcl-2/Bax低于對照組和實驗組，CHOP、GRP78相對表達量高于對照組和實驗組(P均<0.05)。結論 阿奇霉素可防治新生大鼠高氧肺損傷，這種作用可能與減少肺組織細胞凋亡及下調CHOP、GRP78表達有關。

阿奇霉素；肺損傷；內質網應激；葡萄糖調節蛋白78；CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白；新生大鼠；動物實驗

新生兒重癥監護中常用到高氧輔助通氣治療，雖然新生兒搶救技術不斷發展進步，但支氣管肺發育不良(BPD)仍是未成熟兒最常見的慢性肺損傷性疾病[1，2]。內質網應激反應性凋亡通路被認為與高氧肺損傷有緊密聯系。未折疊蛋白反應是保守的細胞反應，多在細胞受某些環境因素影響發生內質網應激、異常蛋白內質網空腔內堆積或未折疊蛋白異常增多時出現。活性氧簇(ROS)在高氧暴露時產生增多，是導致肺部細胞死亡和高氧損傷的主要原因，且過量的ROS引起的細胞死亡與內質網應激反應引起的細胞凋亡有關[3，4]。多種信號通路和分子參與了內質網應激反應，其中CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖調節蛋白78(GRP78)是反映內質網應激最敏感的指標。CHOP分布在細胞質中，含有亮氨酸拉鏈結構。GRP78在內質網應激中引起重要的調節作用。阿奇霉素半衰期長，有良好的抗菌藥物后效應，具有免疫調節作用及抗炎作用[5]。2014年2月～2015年4月，我們通過高氧誘導制作了肺損傷新生大鼠模型，觀察阿奇霉素對高氧肺損傷的防治作用，并探討其機制，為阿奇霉素治療BPD相關研究提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑2 d齡新生Wistar大鼠90只，體質量5～10 g，雌雄不限，由延邊大學實驗動物中心提供。阿奇霉素由國瑞藥業有限公司提供；GADD153/CHOP、GRP78、Bax、Bcl-2、山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記由美國 Satacuz 公司提供；山羊抗兔IgG/辣根酶標記由中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.2高養肺損傷新生大鼠模型制作及阿奇霉素用法90只新生大鼠隨機分為對照組、模型組和實驗組，每組30只。對照組大鼠置于室內空氣中；模型組、實驗組大鼠置于高氧模型箱(保持氧濃度高于90%)內，箱內放置堿石灰粉吸收CO2，每日開箱約1 h，換墊料，保持濕度55%～65%、室溫25 ℃左右。對照組與模型組互換雌鼠。實驗組同時腹腔注射阿奇霉素200 mg/(kg·d)，模型組不注射藥物。

1.3觀察方法各組分別于建模3、7、14 d，每組10只，各組進行麻醉后，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行白細胞計數；取肺組織，測定肺組織濕/干重比(W/D)；HE染色觀察肺組織病理變化；采Western blotting法測定肺組織中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CHOP、GRP78，以凝膠成像系統掃描分析結果，將目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2　結果

2.1各組肺組織W/D及BALF中白細胞數比較模型組建模3、7、14 d時肺組織W/D高于對照組和實驗組(P均<0.05)。模型組建模3、7、14 d時BALF中白細胞總數高于對照組和實驗組(P均<0.05)。詳見表1。

表1　各組肺組織W/D及BALF中白細胞數比較

注：與實驗組、對照組同時點相比，*P<0.05。

2.2各組肺組織病理變化對照組建模3、7、14 d時肺泡結構無明顯改變，無間質水腫，見少許炎癥細胞。模型組建模3 d時肺泡血管壁、小支氣管壁稍有水腫，肺內小血管輕度擴張充血，偶見少量纖維組織增生，少量炎癥細胞浸潤；建模7 d時血管壁、小支氣管水腫及纖維組織增生程度較建模3 d時加重，炎癥細胞增多，出現肺泡融合，可見不同程度擴大的肺泡腔；建模14 d時出現肺泡纖維化，小支氣管壁和血管壁水腫明顯，肺泡體積增大，肺泡融合，間質內炎癥細胞浸潤增多，肺結構明顯紊亂。實驗組建模后不同時間肺水腫程度、炎癥細胞數量、肺泡體積等均較模型組明顯減輕。

2.3各組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CHOP、GRP78表達比較模型組建模3、7、14 d時肺組織中Bax蛋白相對表達量高于對照組和實驗組，Bcl-2/Bax低于對照組和實驗組，CHOP、GRP78相對表達量高于對照組和實驗組(P均<0.05)。詳見表2。

表2　各組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CHOP、GRP78相對表達量比較

注：與實驗組、對照組同時點相比，*P<0.05。

3　討論

隨著肺表面活性物質廣泛應用、機械通氣的應用及早產兒管理技術的提高，早產兒及危重新生兒生存率明顯提高。研究[6，7]認為，長時間暴露于高氧環境可導致急、慢性肺損傷，可有支氣管肺發育不良等后遺癥，并可造成早產兒視網膜病變、睡眠呼吸障礙、神經發育延遲等。高氧環境中，肺組織細胞出現凋亡，這是一種特殊的細胞死亡方式，以細胞形態的迅速變化和功能損害為特點，在急性肺損傷中起重要作用[8]。早產兒肺發育不良對患兒在兒童期及青春期的肺功能有不同影響，患兒胎齡越小，兒童期及青春期時肺功能損傷風險越大[9]。

人類肺組織中存在大量肺泡，肺泡結構完整性對保證正常氣體交換非常重要[10，11]。任何能減弱肺泡穩定性的因素均可引起肺萎縮，造成呼吸窘迫，甚至導致死亡。肺表面活性劑(PS)是一種由脂蛋白復合體和Ⅱ型肺泡上皮細胞合成的物質，其在呼吸周期中起到重要作用，還能維持肺泡表面穩定性，調節肺泡表面張力[12～14]，除此之外，PS還可以控制肺部感染及抑制宿主防御。本研究將2 d齡新生大鼠置于密閉的玻璃箱內，持續通入已知濃度的高氧，制作高氧肺損傷動物模型。病理檢查結果顯示，高氧環境下新生大鼠肺組織會出現急性肺損傷改變，隨著高氧暴露時間延長，損傷程度逐漸加重，表現為肺泡間隔增寬、肺泡融合、血管擴張充血、炎癥細胞浸潤增多、肺結構紊亂等。高氧可增加組織內表面活性蛋白基因表達，有研究[15]報道表面活性蛋白A(SP-A)和表面活性蛋白D(SP-D)在高氧肺損傷過程中的重要作用，因此其基因表達上調是對高氧的一種適應性反應，增加機體的抗炎和抗氧化功能，有利于機體的防御及修復。

Bcl-2、Bax蛋白共同參與了細胞凋亡過程，Bcl-2/Bax比例下降時細胞凋亡增多。本研究發現，模型組建模3、7、14 d時肺組織中Bax蛋白相對表達量高于對照組和實驗組，Bcl-2蛋白相對表達量低于對照組和實驗組，Bcl-2/Bax低于對照組和實驗組，提示高氧導致肺損傷的機制與誘導細胞凋亡有關。文獻[16]報道，高氧損害嚴重時，氧活性物質的產生與許多信號途徑有關[17，18]。未折疊蛋白反應是一種質控機制，在多物種細胞中存在高同源性，可激活轉錄因子6(ATF6)、ERS相關蛋白雙鏈依賴蛋白激酶內質網激酶(PERK)、肌醇蛋白1(IRE1)等應激受體[19]。上述三種內質網膜蛋白可使內質網中未折疊蛋白聚集，當未折疊蛋白在內質網腔內嚴重聚集時，GRP78能與ATF6、PERK、IRE1蛋白出現解離反應。GRP78是內質網應激的標志物，在內質網應激中起重要調節作用。CHOP分布在細胞質中，具有亮氨酸拉鏈結構，也是反映內質網應激最敏感的指標[20，21]。

阿奇霉素屬于氮環內酯類，具有抗炎和調節免疫的功能。阿奇霉素與其他大環內酯類抗生素的結構有顯著差異，能阻止內部形式半酮縮醛反應。在細菌中，阿奇霉素可與核糖體50S亞基結合，阻止轉肽過程，抑制相關蛋白合成，從而發揮抗菌作用。阿奇霉素還可誘導嗜酸性粒細胞凋亡，促進WBC凋亡、影響WBC趨化活性，直接抑制外周血中性粒細胞釋放ROS，減少組胺釋放，從而達到抗炎的目的[22]。本研究用阿奇霉素作用于高氧肺損傷新生大鼠，發現建模后不同時間實驗組肺損傷程度較模型組明顯減輕，且肺組織W/D、BALF中白細胞總數低于模型組，提示阿奇霉素對新生大鼠高氧肺損傷有防治作用。我們進一步研究發現，實驗組建模3、7、14 d時肺組織中Bax蛋白、CHOP、GRP78相對表達量低于模型組，Bcl-2蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax高于模型組，推測阿奇霉素對高氧肺損傷的防治作用可能是通過減少細胞凋亡、下調CHOP、GRP78表達實現的，具體機制仍需進一步研究證實。

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國家自然科學基金資助項目(81160083)。

金正勇(E-mail: jinzhengyong2003@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.012

R563.9

A

1002-266X(2016)31-0040-03

2016-03-18)