響應面法優化棉花黃萎病拮抗菌Bacillus axarquiensisTUBP1產抗菌蛋白發酵條件研究

馬江鋒　曾 紅

(1 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室/塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團農業技術推廣總站， 新疆 烏魯木齊 830011)

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響應面法優化棉花黃萎病拮抗菌Bacillus axarquiensisTUBP1產抗菌蛋白發酵條件研究

馬江鋒1,2曾 紅1*

(1 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室/塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團農業技術推廣總站， 新疆 烏魯木齊 830011)

本實驗擬采用Plackett Burman(PB)試驗設計篩選出影響Bacillus axarquiensis TUBP1產抗菌蛋白關鍵因素，并采用響應面設計中Box-Behnken(BB)實驗設計對其產抗菌蛋白最佳配比進行優化。本文使用Plackett Burman設計對影響B. axarquiensis TUBP1產抗菌蛋白的8個因素進行篩選，得到影響抗菌蛋白產量顯著的因素為葡萄糖、蛋白胨和發酵pH。在此基礎上進一步采用Box-Behnken設計對這3個顯著因素的最佳配比進行優化，得到葡萄糖、蛋白胨、pH最佳配比為葡萄糖2. 53%、蛋白胨1.76%和pH7. 17，與優化前相比蛋白產量提高了34. 55%。

B. axarquiensis TUBP1； 響應面法； 抗菌蛋白； 發酵條件

棉花黃萎病影響棉花的產量和質量，也直接影響產棉地區農民經濟收入，其是由半知菌亞門大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的維管束真菌性病害[1-2]。目前針對棉花黃萎病的防治常規方法有化學防治、農業措施以及培育抗病品種等手段，但是沒有明顯的防病效果。“以菌治菌”的生物防治因其無污染、無殘留、不易使植物病原菌產生耐藥性、生產工藝及流程簡單等特點，以及有些生防菌還能促進農作物生長，倍受許多研究學者青睞[3-4]。

生防菌種類有放線菌[5]、霉菌[6]、細菌[7-9]，不同生防菌作用機理也有所不同，其中產生次生代謝抗菌產物達到抗菌作用是生防機理之一，據報道有subtilin、plipastatin、subtilosin、fengycin、sunlancin、surfactin、iturin等抗菌物質從芽孢桿菌中分離得到。本實驗室從新疆南疆棉田土壤中分離得到的阿薩爾基亞種(Bacillus axarquiensis TUBP1)對新疆連作棉田棉花黃萎病有抑制作用，其田間生防效果可達43. 07%[10]，針對B. axarquiensis TUBP1分類學地位有零星報道[11]，而對此菌代謝產物及代謝產物發酵條件未見相關報道。前期試驗表明其抗菌活性成分主要是以胞外蛋白為主，針對其抗菌蛋白發酵條件研究國內外尚未見文獻報道。因此，基于前期研究基礎上，本試驗采用Plackett Burman、Box-Behnken優化B. axarquiensis TUBP1產蛋白發酵條件，提高其次生代謝產物產量，為進一步開發其作為生防菌進行小規模生產及發酵奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

植物病原菌：大麗輪枝菌 (V. dahliae Kleb ACCC36211)

生防菌TUBP1分離于新疆農一師12團棉田土壤并通過生理生化和分子學手段鑒定為B. axarquiensis TUBP1[11]，且生防效果可達 43. 07%，以上病原菌及拮抗菌均由塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室提供。

1.1.2供試培養基配方

NB培養基：5 g NaCl，10 g蛋白胨，20 g葡萄糖，5 g牛肉膏，1 000 mL蒸餾水

發酵培養基：NB基礎培養基(根據表2中配方進行配制)

1.2方法

1.2.1拮抗菌B. axarquiensis TUBP1種子液的制備

將60 mL配置的NB培養基裝于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min后，每瓶接種2 mL拮抗菌B. axarquiensis TUBP1，37 ℃、180 r/min，培養24 h后，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2拮抗菌B. axarquiensis TUBP1發酵液制備和抗菌蛋白含量測定

50 mL發酵培養基接種2 mL B. axarquiensis TUBP1種子液，置于恒溫震蕩培養器，37 ℃、180 r/min條件下，培養48 h，5 000 g離心20 min，收集發酵上清液 4 ℃冰箱保存備用。

發酵上清加入80%飽和度的硫酸銨。置于4 ℃冰箱沉淀過夜，5 000 g離心20 min，棄上清液收集沉淀，用磷酸緩沖液PBS(pH 7. 2)進行溶解，裝于截流分子量為8 000～14 000的透析袋中，置于4 ℃冰箱透析過夜。透析袋里蛋白質溶液用微孔濾膜過濾(Φ=0. 22 μm)除去雜質，并用考馬斯亮藍法測蛋白質含量[12]。1.2.3Plackett-Burman試驗設計及Box-Benhnken設計優化發酵條件

Plackett-Burman(PB)試驗設計，利用Design Expert.8.0 軟件將B. axarquiensis TUBP1發酵培養的8個條件(蛋白胨、葡萄糖、初始pH、氯化鈉、轉速、接種量、溫度、裝液量)分別作為PB試驗的因素，采用試驗次數N=12的試驗設計，各因素分別取2個水平，如表1所示。然后按照PB試驗設計并采用考馬斯亮藍法測胞外蛋白含量[12]，以期找出影響B. axarquiensis TUBP1產胞外蛋白含量最顯著的因素。

Box-Benhnken(BB)試驗設計優化發酵條件，根據PB試驗確定的因素和水平，采用BB試驗設計對B. axarquiensis TUBP1產胞外蛋白條件進行3因素3水平的響應面分析試驗。得出影響B. axarquiensis TUBP1胞外蛋白含量的最佳發酵條件。

1.2.4B. axarquiensis TUBP1產胞外蛋白發酵條件驗證實驗

經響應面法中BB試驗設計優化得到B. axarquiensis TUBP1產胞外粗蛋白發酵條件，重復6次實驗檢驗B. axarquiensis TUBP1產胞外蛋白發酵條件，與理論產胞外蛋白相比較，檢驗模型的有效性。

表1　Plackett-Burman試驗因素水平及編碼

表2　Placketts Burman實驗設計及結果

2　結果與分析

2.1培養基中氮源、碳源、無機鹽篩選結果

在實驗前期已成功篩選出了最佳氮源為蛋白胨、最佳碳源為葡萄糖、最佳無機鹽為氯化鈉。

2.2Plackett Burman實驗結果

基于前期實驗結果，對影響B. axarquiensis TUBP1產抗菌蛋白的8個因素(葡萄糖、pH、氯化鈉、裝液量、接種量、轉速、溫度)一起進行考察，每個因素考察2個水平，以蛋白含量為響應值，試驗因素如表1所示，PB試驗設計和試驗結果如表2所示，PB方差分析如表3所示，由表3可知，試驗模型極顯著(p<0. 01)，說明PB試驗設計適合優化B. axarquiensis TUBP1產蛋白質發酵條件。由PB方差分析表，得到影響B. axarquiensis TUBP1產蛋白含量最為顯著的三個因素分別為：A(葡萄糖)、B(蛋白胨)和C(初始pH)。

表3　Plackett Burman方差分析

續表3

來源平方和均方F值P值顯著性EG2.402.402.030.3914EH1.131.134.730.4493FG0.830.830.910.0616FH0.620.621.020.9021GH0.080.083.530.5102A23.363.364.120.0007**B21.511.510.560.0041**C21.491.490.370.0016**D20.030.032.830.0544E20.380.383.840.0627F22.272.2711.780.3724G210.8810.886.790.1728H24.304.302.930.0822殘差27.3490.34失擬項18.934.921.390.5437

注：**. P<0. 0 1為差異極顯著；*. P<0. 0 5為差異顯著

2.3Box-Behnken響應面分析的實驗結果

表4　響應面三因素三水平試驗設計

表5　Box-Behnken設計及結果

續表5

試驗號A-葡萄糖%B-蛋白胨%C-pH蛋白質含量μg/mL600020.4270-1-120.3180-1113.909-11017.301001115.701110-117.431201-120.101300020.50141-1015.301500020.601600020.501710113.62

基于PB 試驗結果分析基礎上，對影響蛋白含量的主要3個因素，葡萄糖、蛋白胨和pH進一步采用BB試驗設計進行發酵條件的優化，試驗三因素(葡萄糖、蛋白胨和pH)三水平及編碼見表4，試驗設計及結果分析見表5，PB方差分析如表6所示，由表6可知，試驗模型極顯著(p<0. 01)，由此可說明BB試驗設計適合對影響B. axarquiensis TUBP1產蛋白質最顯著的3個因素(葡萄糖、蛋白胨和pH)進行最佳配比優化。

2.3.1響應面方差分析結果

表6　響應面回歸模型方差分析

R2=0. 972 0;Adj R-Squared=0. 943 9; Adeq Precision=13. 274

注：**. P<0. 0 1為差異極顯著；*. P<0. 0 5為差異顯著

利用Minitab 16軟件對BB試驗結果進行二次多項回歸方程擬合，獲得拮抗細菌B. axarquiensis TUBP1發酵抗菌蛋白對蛋白胨、葡萄糖和pH的多元二次回歸方程:Y=44. 112 7+0. 975 3A+0. 070 5B-2. 045 0C+0. 146 5AB-1. 60 71AC-0. 308 7BC-0. 218 4A2-0. 085 7B2-2. 461 3C2

式中：Y為抗菌蛋白含量，A為葡萄糖，B為蛋白胨，C為pH，根據回歸方程得出最佳的拮抗蛋白含量為20. 93 μg/mL。

由表6可知，P值的大小可以判斷各因素對拮抗菌B. axarquiensis TUBP1產蛋白影響的強弱。P值越小，對產蛋白影響作用越強。拮抗菌B. axarquiensis TUBP1發酵液產蛋白的影響程度大小的次序為pH(C)>葡萄糖(A)>蛋白胨(B)。

2.3.2響應面圖分析

響應面圖形是響應值Y對應與實驗因素X1、X2和X3(X1為葡萄糖，X2為蛋白胨，X3為pH)所構成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，其可以直觀的反映各因素及它們之間的交互作用對響應值的影響，結果見圖1至圖3。

圖1　蛋白胨和葡萄糖對B. axarquiensis TUBP1菌株產蛋白含量影響的響應面和等高線圖

圖2　葡萄糖和pH對B. axarquiensis TUBP1產蛋白含量影響的響應面和等高線圖

圖3　蛋白胨和發酵pH對B. axarquiensis TUBP1產蛋白含量影響的響應面和等高線圖

由圖1可知，隨著葡萄糖和蛋白胨含量的逐漸增大，B. axarquiensis TUBP1產拮抗蛋白含量由高變低，由此可知，適當的增大葡萄糖和蛋白胨含量，可以在一定程度上提高該菌株所產蛋白質的含量。由圖2可知，隨著pH的增大與葡萄糖濃度的提高，菌株產生蛋白質也是表現為由高變低。在圖3中，pH的適當增大及蛋白胨含量的增加對菌株產蛋白的影響與圖2的響應面圖形相似，通過對該模型方程的求解及其模型驗證試驗得知，棉花黃萎病拮抗菌B. axarquiensis TUBP1最優的發酵條件為葡萄糖2. 53%、蛋白胨1. 76%和pH7. 17。因此，在實際操作中，應適當控制蛋白胨、葡萄糖的含量及pH值，以獲得B. axarquiensis產較高的蛋白質。

2.4B. axarquiensis TUBP1產抗菌蛋白最佳工藝條件驗證實驗

進一步通過重復試驗驗證結果準確性，結果如表7所示，由表7可以看出，在最佳工藝條件下，B. axarquiensis TUBP1菌株產生的拮抗蛋白平均值實際上可達20. 91 μg/mL，實際值與預測值相接近，且重復性良好，由此可以說明B. axarquiensis TUBP1產抗菌蛋白條件優化結果可靠可行。

表7　B. axarquiensis TUBP1產抗菌蛋白最佳工藝條件驗證結果

3　討論

拮抗菌的次生代謝產物是其主要抗菌方式之一，影響抗菌物質產生的因素有碳源、氮源和無機鹽等，傳統方法是先進行單次單因素試驗，再采用正交試驗確定單因素的最佳組合，此方法僅能在確定單因素基礎上，比較已選定的水平的好壞，而并非獲得最佳的優化條件[13]。Plackett-Burman設計是從許多影響代謝產物產量的變量間快速篩選出主要因素，再通過與響應面方法結合確定這些主要因素最佳水平，此方法可以彌補以前在微生物培養條件優化中的一些不足。許多學者通過用此方法提高了微生物次生代謝產物[14-15]。

本課題組對已分離棉花黃萎病菌拮抗菌株B. axarquiensis TUBP1抗菌活性成分分析，初步確定為胞外蛋白，有望開發成新型農用抗棉花黃萎病菌藥物。為提高B. axarquiensis TUBP1發酵產抗菌蛋白的能力，本研究首先通過用PB設計對影響B. axarquiensis TUBP1產蛋白的8個因素(葡萄糖、pH、氯化鈉、裝液量、接種量、轉速、溫度)進行考察，并利用Minitab 16軟件篩選出了關鍵因素為葡萄糖、蛋白胨和pH，并通過響應面法中BB試驗設計對發酵條件中的葡萄糖、蛋白胨和pH進行優化，獲得B. axarquiensis TUBP1產蛋白最優條件，進一步驗證最優條件，實驗重復值與預測值擬合良好。

4　結論

本實驗用Plackett-Burman實驗設計篩選出棉花黃萎病拮抗菌B. axarquiensis TUBP1抗菌蛋白發酵條件中的關鍵因素為葡萄糖、蛋白胨和發酵pH。并通過全因子中心組合實驗設計和響應面法，明確其最佳配比為葡萄糖2. 53%、蛋白胨1. 76%和pH7. 17。在此條件下，得到抗菌蛋白含量最高為20. 91 μg/mL，與優化前相比蛋白產量提高了34. 55%。

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Optimizing Fermentation Conditions of Antagonistic Bacillus axarquiensis TUBP1Against Verticillium dahlia by Response Surface Method

Ma Jiangfeng1,2Zeng Hong1*

(1 Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Xinjiang Production and Construction Group/College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(2 Institute for the Control of Agrochenicals, Xinjiang Production and Construction Group, Urumqi, Xinjiang 830011)

To improve and optimize antifungal protein production by a newly isolated B. axarquiensis, Plackett-Burman (PB) design and Box-Behnken design (BB) were adopted in culture conditions, the PB design was undertaken to evaluate the effects and Box-Behnken design was used to optimize the critical internal factors.The results showed that, the peptone, glucose and pH were the key factors, the optical concentration of the variables were determined as glucose at 2.53%, peptone at 1.76% and pH at 7.17. Protein yield increased by 34.55% compared with before optimization.

B. axarquiensis TUBP1; response surface method; antifungal protein; fermentation conditions

2015-06-18

國家自然科學基金(31260013)；新疆生產建設兵團博士基金(2013BB006)；塔里木大學校長博士基金(TDZKBS201206)。

馬江鋒(1982-)，男，研究方向為植物保護。E-mail：30768050@qq.com

*為通訊作者E-mail：zenghong0705@163.com

1009-0568(2016)01-0005-09

TQ92

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.01.002