病毒生態學研究進展

韓麗麗, 賀紀正

中國科學院生態環境研究中心　城市與區域生態國家重點實驗室, 北京　100085

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病毒生態學研究進展

韓麗麗, 賀紀正*

中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室, 北京100085

病毒是目前所知的最簡單的生命單元,通常由外殼蛋白和包裹在外殼蛋白內的核酸兩部分組成。病毒本身缺乏完整的酶系統及能量轉化系統,當游離于環境中時,它只是一個有機大分子,只有侵染宿主后才具有生命特征,進行復制。病毒也是地球上最豐富的生物實體,是微生物群落和功能的重要影響因素。盡管病毒在生態系統中發揮著重要的作用,但因病毒間缺少通用的標記基因,病毒生態學的研究遠遠滯后于細菌和真核生物。近年來高通量測序技術的發展應用幫助人們發現和認識了許多未知的新病毒及其基因,極大地豐富了病毒基因數據庫,直接推動了病毒生態學的發展。從生態學角度對病毒的結構與分類、病毒生態學研究方法、病毒的生態功能及土壤病毒生態學研究進展作一簡要綜述,并提出今后土壤病毒生態學研究的重點。

病毒;多樣性;基因水平轉移;生物地球化學循環;土壤環境

Virus particles are widely distributed in the environment, with the abundance of viruses in soils ranging from 1.5 × 108g-1to 109g-1soil. Soil-dwelling viruses belong to four morphological types: tailed bacteriophage-like particles, spherical particles, thin filaments, and thick filaments. Most soil virus particles can be identified using electron microscopy. With the rapid development of molecular methodologies, signature genes have been identified in order to investigate the diversity within specific virus groups. These genes include auxiliary metabolism genes and polymerase genes, as well as those encoding structural proteins such as portal protein, major capsid protein, and tail sheath protein, etc. Signature genes have been used in combination with PCR-based fingerprinting and sequencing approaches, in order to investigate the spatial and temporal variations of viruses, as well as their diversity across a wide range of habitats. The development of next-generation sequencing platforms has been followed by a large number of metagenomic studies focusing on bacteria, archaea, and fungi from many environments. A large number of new viruses and genes have also been discovered and identified, which has greatly enriched the virus gene database and contributed significantly to the development of the field of viral ecology; however, our understanding of the soil viruses found in different soil types is still in its infancy.

Viruses play several important roles in soil ecology. First, they have the ability to infect soil microorganisms and thus change the functions and nutrients provided by the soils, by altering such factors as nutrient element biogeochemical cycles. Second, viruses acting as shuttle vectors can lead to genetic innovation and bacterial horizontal gene transfer, which facilitates the rapid adaptation of soil bacteria to changing conditions via the transferral of beneficial genes. Thirdly, viruses can affect their host′s metabolism by encoding homologous host genes to modify cell physiology in a way that benefits the infecting virions.

Here, we summarize the latest knowledge of the community structure and classification of viruses, their ecological functions, the research methodologies of viral ecology, and in particular, appropriate strategies for surveying the complex biology of soil viruses. Furthermore, we propose several important areas, which should be considered for future study.

病毒是目前所知的最簡單的生命單元,通常是由外殼蛋白和包被在外殼蛋白內的核酸(DNA或RNA)兩部分組成。病毒本身缺乏完整的酶系統及能量轉化系統,當游離于環境中時,它只是一個有機大分子,只有侵染宿主后才具有生命特征,進行復制。它是地球上最豐富的生物實體,在環境中數量巨大且無處不在,據估計僅海洋中病毒的數量就超過1030。隨著現代分子生物學的發展,病毒及其在環境中的作用逐漸被人們所認知,它誘導的細胞裂解間接地促進了環境中有機和無機營養元素的循環,是生物地球化學循環的重要驅動者之一;它能侵染多個宿主,是物種間基因水平轉移的重要媒介;它直接推動了微生物物種形成及進化發展,是微生物多樣性的關鍵影響因子;病毒的豐度、多樣性及其分布構成了生態系統功能的重要參數。

本文將從病毒的結構與分類、病毒生態學研究方法、病毒的生態功能及土壤病毒生態學研究等方面對病毒生態學的研究進展進行綜述。

1　病毒的分類及系統發育

1977年,Woese通過比較多種生物的16S rDNA或18S rDNA的核苷酸序列,提出了生物界的三域學說(Three Domains Theory),即細菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)及真核生物域(Eukarya)[1],這三域構成了生物界的生命之樹。在該學說中,病毒作為一個重要的生物實體,因其自身不具備繁殖的能力,它的分類地位是游離于這三域之外的。研究發現,生物界中每個生物體通常都被一種或多種病毒所侵染,可以說這三域之間正是通過病毒聯系起來的,無論是細菌、古菌還是真核生物,它們的進化過程都和病毒密不可分。

1.1病毒的結構與分類

病毒不同于一般的細胞生物,沒有完整的細胞結構,通常由蛋白質外殼包裹著單一核酸(DNA/RNA)組成;它是一種獨特的侵染因子,缺乏自身的核糖體,不能進行獨立的代謝活動,但其所含的核酸能使病毒利用寄主細胞進行復制。因此,病毒既可被看作是極其簡單的微生物,也可被看作是極其復雜的化學物質。圖1是幾種常見的病毒類型[1-2],其中有尾噬菌體主要侵染細菌,而球狀的包膜病毒主要侵染動物和植物細胞,絲狀病毒在環境中分布較少,但它可侵染所有形式的生命細胞。另外環境中還存在一類不具有完整病毒結構的亞病毒(subviruses),包括類病毒、擬病毒、朊病毒。這類簡單病毒僅含有某種核酸而不具備蛋白質結構,或僅具有蛋白質而不含核酸,它能夠侵染動植物的微小病原體。這里以大腸桿菌病毒T4噬菌體為例,簡要介紹一下有尾噬菌體的形態結構及侵染方式。T4噬菌體頭部大小為95 nm×65 nm,內部包含了1.66×106個核苷酸的雙鏈線性DNA,尾部是一個100 nm×20 nm的管狀器官,由一個內徑為2.5 nm的中空尾髓及外面包著的尾鞘組成。尾部末端還有基板、6根尾釘和6根尾絲。在頭部和尾部連接處是一個頸圈結構,頸圈上有6根頸須。T4噬菌體通過尾絲和寄主細胞的特異受體結合,通過尾部釋放的溶菌酶和尾鞘收縮作用,使尾髓穿透細胞壁和膜,將頭部的核酸通過尾髓注入寄主細胞,蛋白外殼則留在細胞外;噬菌體的核酸在細菌寄主體內復制,并與新合成的蛋白質外殼裝配成成熟的噬菌體顆粒釋放到環境中。

圖1　幾種主要的病毒形態[2-3]Fig.1　The main morphologies of viruses[2-3]

目前,國際上對病毒研究還沒有通用的系統發育學分類方法,主要依據病毒宿主、基因組類型、復制方式、基因含量以及形狀等方式進行分類。2013年國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)公布的ICTV分類法中,將病毒分為7個目(Orders)：有尾噬菌體目(Caudovirales)、皰疹病毒目(Herpesvirales)、線狀病毒目(Ligamenvirales)、單股反鏈病毒目(mononegavirales)、網巢病毒目(Nidovirales)、小核糖核酸病毒(Picornavirales)和蕪菁黃花葉病毒目(Tymovirales)。

1.2噬菌體的分類及系統發育研究

噬菌體是一類感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱,最早是在1915年由英國細菌學家托特發現,至今已經有100a的研究歷史[4]。根據噬菌體與被感染寄主菌的相互關系,可將噬菌體分為兩大類——烈性噬菌體(virulent phage)和溫和噬菌體(temperate phage)或溶源噬菌體(lysogenic phage)。

由于官方的病毒分類信息主要基于病毒表型特征及寄主信息,這對于生態學的研究顯然是不夠的。因此,美國學者Rohwer等在ICTV分類系統的基礎上,基于167個完整的噬菌體基因組序列,通過生物信息學分析首次提出了噬菌體蛋白組樹(Phage Proteomic Tree,PPT)的分類方法[5-6],目前該發育樹已經囊括了1220個細菌和古菌噬菌體的DNA/RNA基因組序列,具體分類及基因組信息見表1[5,7]。PPT系統發育樹總體結構與ICTV分類一致,但對于一些遺傳信息發生改變,如發生基因水平轉移的噬菌體,在PPT分類法中它們的分類地位被真實地還原。如P4噬菌體在ICTV分類法中被歸入肌尾病毒科(Myoviridae),但其蛋白組學信息顯示其屬于短尾病毒(Podophage),可能是因為在進化過程中,它獲得了肌尾病毒某個病毒粒子的表型基因,使其表現出了肌尾病毒的形態。

1.3噬菌體與細菌的相互作用

噬菌體在環境中具有兩個重要功能,一是作為病原體侵染微生物,改變環境中微生物的數量、群落結構以及功能。由于噬菌體對寄主具有特異性且侵染過程通常發生在寄主密度較高的情況下,即高接觸率可導致高侵染率,因此關于噬菌體在環境中的侵染機制,有人提出了殺死優勝者假說。關于這一假說目前學術界一直爭論不休,Diaz-Munoz在應用微生物學研究進展一書中羅列了大量關于論證或駁斥該假說的文獻[8]?？偟膩碇v,噬菌體對微生物群落的影響也要視環境因子而定,同樣的環境中噬菌體可能對某些細菌種有影響而對群落中的其它種類細菌沒有影響。另外,牛津大學的研究人員Vos等發現,土壤中的噬菌體能夠根據其周圍環境中細菌的類型而不斷改進它們感染細菌的能力[9],說明細菌不斷進化的抗侵染能力緩沖了一部分噬菌體侵染的效果,這種進化方式有利于重構其生存的小范圍生態系統。

表1　噬菌體分類及其基因組含量[5,7]

噬菌體在環境中的另一個重要功能是作為微生物間的穿梭載體,促進細菌間基因的橫向轉移,使其獲得更為有利的基因快速適應環境的變化。噬菌體侵染細菌和細菌抵抗侵染的機制是細菌進化的關鍵,它涉及到噬菌體的功能吸附[10]、寄主及噬菌體的結構變化[11],噬菌體核酸向細菌細胞轉運并避免核酸在細胞內降解[12],最終導致噬菌體和細菌表型的變化等幾個過程。病毒還能交換自身和寄主的基因信息,該作用機制可能在進化過程中直接推動了原核生物物種的形成[13]。另外,有研究指出寄主對噬菌體的敏感性或抗性取決于寄主所含的質粒,噬菌體侵染促使核酸和寄主質粒整合后,質粒在不同的細菌之間轉移,可導致噬菌體寄主譜系變寬[12,14]。隨著研究的深入,越來越多的證據顯示,無論是在自然條件下還是實驗室環境中,細菌與噬菌體的這種共進化關系能增加它們的表型及遺傳多樣性,增強細菌和噬菌體的進化及分異速率,推動微生物群落的演變。

另外,噬菌體還能影響寄主的生理活性,如通過編碼寄主的同源基因影響寄主菌的代謝,在某些情況下,這種輔助的代謝基因可被用來增強寄主細胞的生理活性。如藍藻噬菌體所攜帶的光合基因可幫助寄主細胞在光合蛋白消失后為其提供能量[15]。很多藍藻噬菌體侵染藍藻后,會在宿主體內表達編碼光合作用Ⅱ反應中的核心蛋白,如psbA基因編碼的D1蛋白,它能在所有產氧光合作用生物間快速的轉移光合作用產物。而病毒的復制速率則取決于光合作用速率,因此侵染過程中這些光合作用基因的表達不僅增強宿主的光合作用速率,也增加藍藻噬菌體的復制速率。

2　病毒生態學研究方法

過去人們對自然界中存在的病毒的認識主要是依靠顯微鏡觀察和分離培養。在研究病毒生態學過程中,研究者們需要突破兩大難點,一是大部分的噬菌體宿主目前不可培養,二是對病毒的研究缺乏通用的標記基因,因此在研究過程中需要用到一種或多種分析方法。

在20世紀,科學家們對病毒的研究主要依賴于電鏡技術研究可培養病毒形態及多樣性,這種方法相對便宜且便于操作,缺點是不能準確地評價病毒群體的多樣性。隨著技術的發展,分子生物學技術被逐漸應用于病毒生態學的研究,最常用的有PFGE(Pulse Field Gel Electrophoresis)和RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA analysis)這兩種指紋圖譜技術,這類技術可用于大量樣品的比較分析,相對經濟、易操作,還可發現新型病毒,缺點是同顯微技術一樣,不能評價病毒群體的多樣性,也不能提供直接的功能信息。由于病毒的研究缺乏通用的標記基因,因此很多科學家也選擇針對某一類病毒,以一些高度保守的結構或功能基因作為標記基因,研究病毒的系統發育地位,常見的基因有T4噬菌體的g23基因,藍藻噬菌體的g20、psbA和psbD基因等。

進入21世紀,高通量測序技術的出現,突破了探尋環境微生物黑箱的瓶頸。關于病毒基因組的測序始于1977年,第一株被測序的病毒是侵染大腸桿菌的ΦΧ174噬菌體,基因組共包含5 375個核苷酸[16]。2002年,Breitbart等首次通過鳥槍測序法對兩個海洋病毒群體進行了宏基因組測序,初探了海洋環境中病毒的多樣性,結果表明這兩個海水樣本中病毒多樣性極高,有超過65%的序列之前沒有被報道過[17]。2005年,Edwards等提出了病毒宏基因組的概念,并針對環境中的噬菌體群體提出了新的PPT分類方法[6]。西班牙的Rodriguez-Valera教授實驗室利用宏基因組測序技術,測定了超過1000種海洋病毒的遺傳序列,發現了208種為新的海洋噬菌體[18]。Hurwitz等采用比較基因組學和網絡分析方法分析了海洋病毒群體的生態驅動模型[19]。經過10余年的研究,病毒宏基因組學技術的發展已經幫助人們從多樣的環境中快速有效地發現了許多未知的新病毒和基因。

3　病毒的生態功能

3.1病毒的傳播與應用

提到病毒,人們腦海中馬上就會浮現出艾滋病毒、SARS病毒、禽流感病毒以及近期在西非蔓延的埃博拉病毒等,這些病毒嚴重威脅人類的健康和生命安全。自古以來,人類就在和病毒進行不斷的斗爭,如古代的天花、牛痘等,病毒威脅著人類生存的同時也促進人類不斷完善自身的免疫防御系統。病毒除了威脅人類健康,也會侵害植物,其中我國的水稻、小麥、玉米等農作物病毒病害發生嚴重,給社會造成了重大的經濟損失。作物病害中常見的病毒有水稻條紋病毒、水稻黑條矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、玉米粗縮病毒、煙草花葉病毒等等。植物病毒不像噬菌體和動物病毒那樣具有殼體蛋白與寄主細胞表面受體之間的特異性,一般在植物細胞表面損傷后,從傷口侵入。自然界中植物病毒的傳播主要依靠昆蟲作為媒介(如蚜蟲、葉蟬等)。了解病毒在環境中的類型、豐度、生存和分布狀態,有助于人們對環境生態系統健康進行評價。

凡事都有兩面性,病毒除了能使人和動植物致病外,也有對人類有利的一面。例如針對某些特殊病毒的增殖、失活、存活、以及生命周期等特性,調控感染農業有益(根瘤菌)或有害微生物(植物病原體)的病毒使其朝著對作物生產有利的方向發展。自1915年噬菌體被發現以來,土壤生物學家在農業生產方面開展了很多關于根瘤菌噬菌體(rhizobiphage)的研究。包括種群、根瘤菌噬菌體宿主范圍、根瘤菌噬菌體對根瘤形成的影響、根瘤菌噬菌體對豆科植物產量等的研究[20],研究還發現種植豆科植物的土壤中存在的大量根瘤菌噬菌體豐度和宿主細菌的豐度趨勢一致[21]。另外,科學家們還針對病毒對土傳植物病害的影響進行研究,例如Ashelford等人在甜菜地中觀察到了短尾噬菌體(Podoviridae)及其宿主液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)在土壤中均存在顯著的季節性種群動態變化特征[22]。

從醫學和人類健康角度來講,病毒侵染病原細菌,如霍亂弧菌噬菌體、炭疽芽孢菌噬菌體等能將病原菌宿主裂解,可作為治療這些疾病的特效藥,從而減少流行病的發生,這種通過噬菌體裂解細菌治療病原菌感染的手段稱為噬菌體療法(Phage Therapy)。噬菌體療法最早在1919年被應用于4名法國兒童痢疾的治療,結果這4名兒童均恢復了健康[23]。20世紀中期,由于抗生素的發展大行其道,歐美等國家對噬菌體的研究一度處于停滯階段。隨著病原菌對抗生素抗性問題日益嚴重,導致了大量病原菌產生耐藥性,甚至出現超感染免疫抗性,正是病原菌對抗生素的這種耐藥性促進了噬菌體研究的復興。2014年5月召開的美國微生物學會(ASM)上,瑞士洛桑大學的Resch博士首次介紹了由歐盟投資380萬歐元的Phagoburn計劃,這是首個應用噬菌體療法治療人體感染的大型跨國臨床試驗。因噬菌體的宿主譜系較窄,只針對特異的寄主病原菌起作用,特異性高、對人體細胞無害等特點,較抗生素這類廣譜殺菌劑而言有一定優勢,科學家們正在研究通過噬菌體療法代替抗生素達到控制病原菌的目的,并將該技術逐步應用于醫學、食品、水產、農業、環境等多個領域[24]。

3.2病毒與元素的生物地球化學循環

病毒還是生物地球化學循環的重要驅動者。在海洋環境中,病毒介導的細胞裂解所釋放的碳源和其他營養元素推測是全球范圍碳循環的主要驅動因子[25]。地球早期的生命形態大部分都是化能自養型(chemolithoautotrophs),它們所需的能量主要來自周圍的巖石和海洋;細菌細胞組分可直接固定環境中的CO2,這種不產氧光合作用在早期的地球上很豐富,只通過光照和CO2產生它們的生命形式。而如今細菌中所參與的各種各樣的代謝活性,有許多和人類生理代謝很相似,比如能使人致病的葡萄球菌(Staphylococcus)、沙門氏菌(Salmonella),或者食品和飲料如奶酪和酒中的異養生物(heterotrophs),利用復雜的碳水化合物或其它有機分子作為細胞能量,組成細胞組份,這些都不同于早期的巖石和光照作為能量來源[26]。那么早期的這些異養生物是如何開發利用環境中龐大的有機碳資源的呢？推測可能是病毒侵染導致這些細菌和古菌的細胞凋亡,釋放大量的有機碳進入海洋,為異養生物開拓了新的資源利用領域,同時也將新的碳固定環節帶入碳循環。

地球化學研究證據指出地球大氣中直到40億年前才出現氧氣分子,隨后游離氧濃度逐步增加至今天的21%,這個過程稱為大氧化事件[27]。早期研究生物驅動大氣成份的改變主要是通過藍藻,藍藻也是現今開展這類研究最常用的模式生物之一,全球海洋中關于光合作用的研究大部分是由原綠球藻(Prochlorococcus)和聚球藻(Synechococcus)這兩種最常見的藍藻驅動的,它們貢獻了全球碳固定量的25%[28]。藍藻光合作用過程中的部分活性還要歸功于它的合作伙伴——藍藻噬菌體。藍藻噬菌體和藍藻光合作用能力的協同進化是產氧光合作用的遠古驅動者,也是空氣中氧氣含量在地球表面升高的早期驅動者。有研究指出地球上每20個人中就有1個人呼吸的氧氣是來自海洋中病毒刺激的生氧光合作用。

當病毒裂解其微生物宿主時,會導致驚人數量的生源要素釋放到環境中去。在海洋中,病毒甚至會重復利用這些被特定的海洋大型浮游生物所消耗的營養物質。病毒裂解沿海水域“褐潮”中的藻類Aureococcusanophagefferns,還可增加海水中溶解的鐵含量,隨后溶解的鐵又被異養細菌快速轉移為可過濾的顆粒物[29]。此外,病毒甚至還能影響到天氣,如病毒侵染藻類時會釋放二甲基硫(DMS),DMS 不僅與酸雨、酸霧的形成有關,它還能使大氣中的云凝結核,增加對太陽的輻射[30]。

據估計地球上原核生物的數量在1030[31],而病毒豐度約為1031[32];海洋環境學家們認為海洋中病毒顆粒至少是原核生物的10倍,這還不包括整合在基因組上的溶源性病毒,且病毒在環境中每秒可發生高達1024次的寄主侵染,以維持它們在環境中的數量[7],這些數據間接證明了病毒對生物地球化學循環起著關鍵作用,估算土壤中微生物和噬菌體的豐度對評估土壤中病毒在元素的生物地球化學循環方面有著重要作用。目前,噬菌體在環境中的這些特征和數據主要是通過海洋中噬菌體的研究所得,而土壤中的噬菌體在環境條件發生改變時,它們的群體結構會作出更加迅速的反應[33],因此可以推測噬菌體在土壤中發揮著更為重要的作用。

3.3量化病毒對生態系統的貢獻需要技術及數據分析方法的進步

病毒、細菌以及其他生物在環境中的相互關系是相對穩定的。在海洋環境中,病毒貢獻了很多和能量代謝相關的基因。研究者們通過顯微鏡觀察、關鍵代謝產物產生速率及決定性的病毒作用過程速率粗略的評估病毒對整個能量流的貢獻,但精確的值還是很難獲得。更為復雜的系統,如腸道和土壤,有數千種病毒類型存在,由于病毒間缺乏通用的標記基因,加上病毒變異速率快,功能基因保守性低等特性,目前還無法通過分子生物學方法對病毒數量進行量化,評估復雜環境中病毒活性則更為困難。目前國際上已經有不少實驗室的科學家們正專注這一新領域的研究并嘗試進一步了解全球生態系統對病毒的依賴,如開發生物反應器等人工模擬系統,這將有利于人們進一步認識病毒如何驅動生產力的發展并維持生態系統的穩定。

4　土壤病毒生態學研究進展

過去幾十年由于病毒生態學的迅速發展,被稱為病毒學研究的第三紀[34],但這個階段的研究主要集中在海洋和湖泊等水生環境,在土壤環境中涉及的還很少。土壤中的病毒生態學的研究起步于近10年,且集中在濕地和稻田等接近水生生態系統的噬菌體研究。如借助對海洋病毒的認知,利用已知海洋病毒的基因組序列設計藍藻噬菌體及T4噬菌體功能基因的引物,考察這兩種病毒在土壤中的多樣性及分布特征。國內的王光華等和日本的Kimura教授合作在藍藻噬菌體和T4噬菌體的多樣性研究方面發表了多篇論文。他們通過藍藻噬菌體的g20基因研究了稻田田面水和稻田土壤中噬藻體的多樣性[35],同時比較了日本水稻土和中國東北水稻土中藍藻噬菌體的g20基因序列,發現兩個地區的藍藻噬菌體分布存在明顯差異。以g23基因作為標記基因研究了水稻土[36-37]、濕地[38]及旱地[39]黑土中T4噬菌體的多樣性,研究表明g23基因分布與其生存環境關系很大,T4 型噬菌體基因多樣性非常豐富,它的群落結構在湖泊、海洋和稻田環境中具有較大的差異。由于研究中所使用的g20和g23基因的擴增引物均依據海洋分離的噬菌體序列設計,加之噬菌體本身快速突變的特性,這兩個基因擴增所得序列專一性并不高,目前只能通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)及切膠測序的方法分析這兩種噬菌體的多樣性,還未見利用高通量測序方法研究這兩種噬菌體多樣性的報道。

環境中病毒的群體組成是復雜而多樣的,除了對土壤中T4和藍藻噬菌體等單一病毒多樣性及分布特征研究外,搞清楚土壤中有哪些病毒,這些病毒的分布和土壤環境因子之間的關系如何也很重要。早期有一些基于表型的研究表明病毒的多樣性與土壤的基本性質密切相關。如病毒在低溫時潛伏期變長、生活周期也變長,噬菌體的釋放量急劇降低,推測是由于溫度較高的情況下,微生物和酶的活性更高,蛋白酶等加速了病毒的分解代謝周期[20]?？梢娡毦嗨?溫度也是病毒在土壤中生存的重要控制因子。Williamson等通過對6種美國東部地區的土壤(2種農田土壤,2種沿海平原森林土壤和2種典型山脈森林土壤)中的噬菌體多樣性研究表明森林土壤中噬菌體的含量要高于農田土壤,噬菌體的含量和水份含量相關而和土壤質地關系不大,土地使用類型和細菌及病毒的豐度均顯著相關[40],濕潤的森林土壤中的病毒豐度和多樣性均要高于旱地農田土壤,土地利用方式是影響病毒豐度及多樣性的關鍵因素[33,40-41]。由此可見,病毒的多樣性及其與宿主的相互作用受溫度、pH、含水率、土壤結構及營養元素可利用性等多種環境因子的影響。

不得不說近年來,宏基因組學作為環境微生物學的前沿研究方法,為宏病毒組學的發展帶來了新的契機。最近Reavy等在AEM上發表了1篇4種不同類型土壤(沿海土、耕作棕壤土、高山灰壤土和腐殖質鐵灰壤土)中病毒多樣性的文章[42],通過宏基因組學結合表型分類方法比較不同類型土壤中的病毒,研究結果表明這幾種土壤中富集的病毒以球狀病毒顆粒和細絲狀病毒為主;高通量測序結果顯示在沿海土壤和耕作土這兩種土壤宏病毒組中均以單鏈環狀DNA病毒(ssDNA)占主導地位,其中沿海土中Gokushovirus(侵染衣原體、螺原體等原核寄生生物的病毒)較耕作土明顯占優勢,并推測ssDNA病毒的分布特征可能由土壤理化因子驅動的。今年Adriaenssens等也發表了1篇基于宏基因組學方法分析納米布(Namib)沙漠土壤中病毒群體結構的文章[43]。納米布沙漠位于非洲西南部大西洋沿岸的干燥區,是世界上最古老、最干燥的沙漠之一。文章基于電子顯微鏡的表型技術以及Illumina平臺的宏病毒組高通量測序技術研究發現該沙漠土壤中的病毒主要分布于有尾噬菌體目,尤其以長尾噬菌體為主。對測序所得的功能基因與4個病毒基因數據庫(KEGG、COG、SEED和ACLAME)比對后發現細胞壁裂解酶基因、核苷酸還原酶基因以及噬菌體相關基因豐度較高。以焦磷酸水解酶基因phoH和末端酶大亞基基因terL作為標記基因,構建的系統發育樹顯示納米布沙漠土壤中的病毒基因大多是新的未報道的基因?？梢姴《净驍祿焯貏e是土壤中的病毒基因數據庫遠沒有其它微生物基因信息完善,宏病毒組測序所得序列通常有一半不能和數據庫中已知的序列相匹配,這也是制約病毒生態學研究發展的主要因素。隨著科技的進步和大數據時代信息的發展,我們相信土壤病毒生態學研究將會有長足的進步和更為廣闊的發展空間。

5　展望

從1915年英國細菌學家托特發現噬菌體至今,有關微生物病毒的研究已經整整100a,噬菌體的發現和研究徹底改變了我們對生物學的理解。隨著研究技術的不斷發展,針對環境中病毒的研究經歷了最初的顯微技術、單個或多個基因的分子生物學技術、單個病毒的基因組學技術以及環境病毒的宏基因組學技術這幾個階段,尤其是高通量技術的應用大大促進了病毒生態學研究的發展。這些技術從不同層面揭示了病毒基因的多樣性,展示了病毒在地球生物化學循環中的重要驅動作用。在病毒研究的下一個世紀中,在土壤病毒生態學方向可重點開展以下幾方面的研究：(1)從大尺度上研究土壤中病毒的群體組成及空間分布格局,揭示土壤病毒地理分異的生態驅動機制;(2)對病毒裂解宿主菌,導致營養元素的循環進行量化研究,用以評估土壤中的病毒在元素生物地球化學循環過程中的作用;(3)結合各種組學技術對土壤中的病毒進行研究,在表型、基因和功能水平上進一步解析病毒與宿主菌之間的協同進化關系;(4)理解不同類型病毒在土壤環境中的生存和傳播機制,為病毒的控制提供依據。

[1]Woese C R, Fox G E. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1977, 74(11): 5088-5090.[2]Adenosine. File: Tevenphage.svg. Wikimedia. (2008- 5- 28) [2015-05- 13]. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Tevenphage.svg.

[3]Rohwer F, Barott K. Viral information. Biology & Philosophy, 2013, 28(2): 283- 297.

[4]Twort F W. An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses. The Lancet, 1915, 186(4814): 1241-1243.[5]Rohwer F, Edwards R. The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy for phage. Journal of Bacteriology, 2002, 184(16): 4529- 4935.

[6]Edwards R A, Rohwer F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(6): 504- 510.

[7]Rohwer F, Youle M, Maughan H, Hisakawa N. Life in Our Phage World. San Diego: Wholon, 2014: 8- 8.

[9]Vos M, Birkett P J, Birch E, Griffiths R I, Buckling A. Local adaptation of bacteriophages to their bacterial hosts in soil. Science, 2009, 325(5942): 833.

[10]Randall-Hazelbauer L, Schwartz M. Isolation of the bacteriophage lambda receptor fromEscherichiacoli. Journal of Bacteriology, 1973, 116(3): 1436- 1446.

[11]Mahony J, Van Sinderen D. Structural aspects of the interaction of dairy phages with their host bacteria. Viruses, 2012, 4(9): 1410- 1424.

[12]Richter C, Chang J T, Fineran P C. Function and regulation of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated (Cas) systems. Viruses, 2012, 4(10): 2291- 2311.

[13]Weinbauer M G, Rassoulzadegan F. Are viruses driving microbial diversification and diversity? Environmental Microbiology, 2004, 6(1): 1- 11.

[14]Deng Y M, Harvey M L, Liu C Q, Dunn N W. A novel plasmid-encoded phage abortive infection system fromLactococcuslactisbiovar.diacetylactis. FEMS Microbiology Letters, 1997, 146(1): 149- 154.

[15]Mann N H, Cook A, Millard A, Bailey S, Clokie M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature, 2003, 424(6950): 741.

[16]Sanger F, Air G M, Barrell B G, Brown N L, Coulson A R, Fiddes J C, Hutchison C A, Slocombe P M, Smith M. Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA. Nature, 1977, 265(5596): 687- 695.

[17]Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy J M, Segall A M, Mead D, Azam F, Rohwer F. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(22): 14250- 14255.

[18]Mizuno C M, Rodriguez-Valera F, Kimes N E, Ghai R. Expanding the marine virosphere using metagenomics. PLoS Genetics, 2013, 9(12): e1003987.

[19]Hurwitz B L, Westveld A H, Brum J R, Sullivan M B. Modeling ecological drivers in marine viral communities using comparative metagenomics and network analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(29): 10714- 10719.

[20]Kimura M, Jia Z J, Nakayama N, Asakawa S. Ecology of viruses in soils: past, present and future perspectives. Soil Science and Plant Nutrition, 2008, 54(1): 1- 32.

[21]Sharma R S, Mohmmed A, Babu C R. Diversity among rhizobiophages from rhizospheres of legumes inhabiting three ecogeographical regions of India. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(7): 965- 973.

[22]Ashelford K E, Norris S J, Fry J C, Bailey M J, Day M J. Seasonal population dynamics and interactions of competing bacteriophages and their host in the rhizosphere. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(10): 4193- 4199.

[23]Borysowski J, Mi?dzybrodzki R, Górski A. Phage Therapy. Norfolk: Caister Acadimic Press, 2014: 289- 301.

[24]Jassim S A A, Limoges R G. Natural solution to antibiotic resistance: bacteriophages ‘The Living Drugs’. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 30(8): 2153- 2170.

[25]Jover L F, Effler T C, Buchan A, Wilhelm S W, Weitz J S. The elemental composition of virus particles: implications for marine biogeochemical cycles. Nature Reviews Microbiology, 2014, 12(7): 519- 528.

[26]Greene S E, Reid A. Viruses throughout life & time: friends, foes, change agents. A report on an American academy of microbiology colloquium. San Francisco: American Society for Microbiology, 2013.

[27]Lyons T W, Reinhard C T, Planavsky N J. The rise of oxygen in Earth′s early ocean and atmosphere. Nature, 2014, 506(7488): 307- 315.

[28]Flombaum P, Gallegos J L, Gordillo R A, Rincón J, Zabala L L, Jiao N Z, Karl D M, Li W K W, Lomas M W, Veneziano D, Vera C S, Vrugt J A, Martiny A C. Present and future global distributions of the marine CyanobacteriaProchlorococcusandSynechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(24): 9824- 9829.

[29]Gobler C J, Hutchins D A, Fisher N S, Cosper E M, Sanudo-Wilhelmy S A. Release and bioavailability of C, N, P, Se, and Fe following viral lysis of a marine chrysophyte. Limnology and Oceanography, 1997, 42(7): 1492- 1504.

[30]王斐, 鄭天凌, 洪華生. 海洋病毒在微生物食物環中的重要作用. 海洋科學, 1998, (4): 41- 43.

[31]Whitman W B, Coleman D C, Wiebe W J. Prokaryotes: the unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, 95(12): 6578- 6583.

[32]Breitbart M, Rohwer F. Here a virus, there a virus, everywhere the same virus? Trends in Microbiology, 2005, 13(6): 278- 284.

[33]Srinivasiah S, Bhavsar J, Thapar K, Liles M, Schoenfeld T, Wommack K E. Phages across the biosphere: contrasts of viruses in soil and aquatic environments. Research in Microbiology, 2008, 159(5): 349- 357.

[34]Mann N H. The third age of phage. PLoS Biology, 2005, 3(5): e182.

[35]Jing R Y, Liu J J, Yu Z H, Liu X B, Wang G H. Phylogenetic distribution of the capsid assembly protein gene (g20) of cyanophages in paddy floodwaters in Northeast China. PloS One, 2014, 9(2): e88634.

[36]Wang G H, Murase J, Taki K, Ohashi Y, Yoshikawa N, Asakawa S, Kimura M. Changes in major capsid genes (g23) of T4-type bacteriophages with soil depth in two Japanese rice fields. Biology and Fertility of Soils, 2009, 45(5): 521- 529.

[37]Liu J J, Wang G H, Wang Q, Liu J D, Jin J, Liu X B. Phylogenetic diversity and assemblage of major capsid genes (g23) of T4-type bacteriophages in paddy field soils during rice growth season in Northeast China. Soil Science and Plant Nutrition, 2012, 58(4): 435- 444.

[38]Zheng C Y, Wang G H, Liu J J, Song C C, Gao H X, Liu X B. Characterization of the major capsid genes (g23) of T4-type bacteriophages in the wetlands of northeast China. Microbial Ecology, 2013, 65(3): 616- 625.

[39]Wang G H, Yu Z H, Liu J J, Jin J, Liu X B, Kimura M. Molecular analysis of the major capsid genes (g23) of T4-type bacteriophages in an upland black soil in Northeast China. Biology and Fertility of Soils, 2011, 47(3): 273- 282.

[40]Williamson K E, Radosevich M, Wommack K E. Abundance and diversity of viruses in six Delaware soils. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(6): 3119- 3125.

[41]Williamson K E, Wommack K E, Radosevich M. Sampling natural viral communities from soil for culture-independent analyses. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(11): 6628- 6633.

[42]Reavy B, Swanson M M, Cock P J, Dawson L, Freitag T E, Singh B K, Torrance L, Mushegian A R, Taliansky M. Distinct circular single-stranded DNA viruses exist in different soil types. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(12): 3934- 3945.

[43]Adriaenssens E M, Van Zyl L, De Maayer P, Rubagotti E, Rybicki E, Tuffin M, Cowan D A. Metagenomic analysis of the viral community in Namib Desert hypoliths. Environmental Microbiology, 2015, 17(2): 480- 495.

Advances in viral ecology research

HAN Lili, HE Jizheng*

StateKeyLaboratoryofUrbanandRegionalEcology,ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China

Viruses are usually composed of a small fragment of nucleic acid (DNA or RNA) surrounded by coat protein, and have been recognized as the simplest living organisms known thus far. Viruses exist only as organic macromolecules when in the environment, because they lack integral enzyme and energy transformation systems. However, once they infect host cells, viruses become active and begin to replicate. Despite their dependence on host cells to reproduce, viruses are the most ubiquitous living organisms, and important drivers influencing microbial communities and ecosystem functioning. However, our understanding of the microbial ecology of viruses in the environment has not kept pace with the rapid advances of studies on bacteria and eukaryotes, owing to the lack of a universal phylogenetic biomarker.

virus; diversity; horizontal gene transfer; biogeochemical cycles; soil habitat

國家自然科學基金資助項目(41571248, 41301265, 41230857)

2015- 01- 21; 網絡出版日期:2015- 12- 01

Corresponding author.E-mail: jzhe@rcees.ac.cn

10.5846/stxb201501210170

韓麗麗, 賀紀正.病毒生態學研究進展.生態學報,2016,36(16):4988- 4996.

Han L L, He J Z.Advances in viral ecology research.Acta Ecologica Sinica,2016,36(16):4988- 4996.