hBMSCs幼年食蟹猴腦內移植的安全評價、遷移及分布

李加美，朱華，姚志剛，鄧威，李秦，馬春梅，秦川*

(1.山東大學附屬省立醫院病理科，濟南　250021；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院，實驗動物研究所病理室,北京　100021；3.中國醫學科學院實驗動物研究所Motac合作實驗室,北京　100021)

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hBMSCs幼年食蟹猴腦內移植的安全評價、遷移及分布

李加美1, 2，朱華2，姚志剛1, 2，鄧威2，李秦3，馬春梅2，秦川2*

(1.山東大學附屬省立醫院病理科，濟南250021；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院，實驗動物研究所病理室,北京100021；3.中國醫學科學院實驗動物研究所Motac合作實驗室,北京100021)

目的 評價hBMSCs幼年食蟹猴腦內移植的安全性，并進一步觀察hBMSCs在腦內的遷移和分布情況，為治療兒童中樞神經系統疾病建立新的技術平臺及理論依據。方法直接向幼年性食蟹猴腦內注射hBMSCs，通過HE染色和免疫組化的方法觀察注射部位炎癥反應及免疫排斥情況；通過對hBMSCs體外標記示蹤和攜帶的男性特異基因的檢測，觀察移植后hBMSCs在腦內的遷移及分布情況。結果研究結果顯示直接腦內注射hBMSCs未引起受試動物出現全身癥狀，移植部位腦組織炎癥反應局限，未見明顯免疫排斥反應，未見腦組織變性壞死和明顯膠質細胞增生聚集。hBMSCs移植4周后，仍大量存活，并可在腦內廣泛遷移，其遷移分布具有一定的規律性，可觀察到不同移植受體細胞分布重疊現象。另外，hBMSCs遷移分布具有從前腦向后腦遷移及向血管和室管膜下遷移的趨勢。結論hBMSCs直接腦內注射移植安全性好；hBMSCs可以在腦內長期存活并遷移。

人骨髓間充質干細胞；食蟹猴；遷移；分布

發生在兒童的神經變性疾病及大腦外傷性損害等均可引起嚴重的臨床神經功能障礙，這些疾病包括腦癱、運動功能紊亂、缺血缺氧性腦病、腦外傷等，多表現為神經元的變性缺失，神經系統無法產生新的神經元、建立新的突觸聯系，致使中樞神經系統損傷后結構和功能難以恢復。而目前現有的臨床治療方法有限，不能達到有效恢復神經功能的目的，因此，保護神經免受損傷并促進神經再生對神經系統疾病的治療至為關鍵。動物實驗及臨床實驗均證明應用干細胞為基礎的細胞治療可以阻止并修復神經系統損傷[1-3]。

骨髓間充質干細胞(bone marrow derived-mesenchymal stem cells, BMSCs)為骨髓來源的多能干細胞，具有多向分化潛能、獲取方便、易于分離培養和鑒定、遺傳背景穩定及體內植入免疫反應比較弱等優點。自從首次報道其在腦內可以向神經細胞分化后，BMSCs移植治療中樞神經系統疾病就成為了研究熱點。本實驗采用的人BMSCs(hBMSCs)來源于健康志愿者，前期工作已證實其在體外具有多向分化的潛能、并能快速擴增、可誘導免疫耐受、能減輕或抑制移植物抗宿主病等，在神經系統疾病、自身免疫性疾病及血液病的臨床前期及臨床研究中頗受重視[4, 5]。在神經系統疾病動物模型實驗中，靜脈及經腦移植的MSCs能夠穿過血腦屏障遷移到損傷部位腦組織[6-8]。MSC為基礎的治療對中樞神經系統疾病的治療安全而有效[9]，已成功應用于多種神經系統疾病動物模型的治療中，如腦出血、阿爾滋海默病和帕金森病[10-13]。很多實驗均證實應用MSCs治療幼年性腦缺血損傷模型非常有效，如腦癱患者。MSCs移植已經成為可行、有效和安全的治療方法，對神經功能的恢復效果明顯[10]。

目前MSCs的移植途徑主要包括直接腦內注射和間接通過靜脈、動脈及腹腔注射等。間接途徑移植為全身治療，到達病變部位的時間較長，細胞數量較少，發揮作用較慢。而腦內注射移植為局部治療，創傷小，起效快，并且腦內的免疫應答能力比較弱，因此直接腦內注射成為局部治療中樞神經系統疾病的優先選擇。但hBMSCs直接腦內移植的安全性如何？其腦內移植后能否進行遷移？這些都是hBMSCs臨床應用前期亟需解決的問題。我們通過將hBMSCs直接腦內移植到幼年食蟹猴腦內，觀察hBMSCs在腦內注射的安全、遷移和分布情況，為hBMSCs在兒童神經系統疾病的治療應用奠定基礎。

1　材料和方法

1.1實驗動物

食蟹猴10只(2～3個月)，具體體重、年齡及細胞移植情況見表1，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供[SCXK(軍)2002-001]。動物用懸掛在脖頸處刻有檔案號的標牌作為該動物的編號，動物進入動物室檢疫兩周。動物實驗后由隨其母單籠飼養。10只食蟹猴隨機分為生理鹽水對照組(n=2)，hBMSCs移植組(n=8)。每組分為2周和4周(表1)。動物使用申請批準號：MC-07-6008。

1.2hBMSCs標記

hBMSCs 由中國醫學科學院北京協和醫學院基礎研究所組織工程中心提供。CM-DiI(固體)溶解于DMSO，濃度為1 mg/mL。取第4～5代細胞，待細胞融合度達到80%～90%時，加入2 mL 25%胰酶，鏡下觀察見細胞回縮后，立即倒掉消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基2～3 mL，輕輕吹打使細胞之間分散成單個細胞，加培養基至10 mL繼續吹打成單細胞懸液，并于鏡下觀察。離心：1000 rpm/min離心10 min。去上清，用無血清新鮮培養基重懸細胞，將配好的CM-DiI溶液加入到細胞懸液中，使其終濃度為5 μg/μL。37℃孵育5 min，4℃孵育15 min，此過程要避光處理。用生理鹽水混懸細胞，調整其密度為10000個/μL。

1.3hBMSCs腦內移植

麻醉后的動物采用俯臥位固定在立體定位儀上，五點法(上頜托、雙側外耳道、雙側眶下緣中點)固定頭部，讀取坐標并設為坐標原點。根據注射的部位(右側尾狀核頭部)得出注射點坐標。Antero-posterior (AP)=+16，Depth (D)=+20，lateral (L)=-4，AP代表前后方向，D代表注射深度，L代表側方坐標。hBMSCs用微量加樣器注射到右側尾狀核；注射細胞數量為1×106個細胞，注射體積為125 μL，注射速率：10 μL/min，注射完后留針3 min；生理鹽水對照組注射等體積生理鹽水。無菌手術在中國醫學科學院實驗動物研究所進行[SYXK(京)2005-0042]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

表1　食蟹猴的生理指標及實驗分組情況

1.4腦組織取材

解剖前麻醉動物，待動物進入麻醉狀態后，股動脈放血處死。開顱取腦，腦組織取材在中國醫學科學院實驗動物研究所進行[SYXK(京)2005-0042]。具體取材參考Isakova等[10]的方法(圖1)。圖中白色區域大約4～6 mm用來切冰凍切片直接觀察熒光或者石蠟包埋做免疫組織化學染色和原位雜交。淺灰色區域大約3 mm，腦組織腦冠狀面被平均分成100～200 mg的小塊，用來提取組織DNA，放入凍存管-80℃保存。深灰色區域大約2 mm用來提取組織總RNA。

圖1　大腦取材示意圖Fig.1　The schematic diagram of usagae of brain tissue

1.5hBMSCs腦內移植的局部炎癥反應和免疫反應

動物麻醉后，先經生理鹽水(1 L/kg)灌注，再經10%中性福爾馬林(1 L/kg)灌注后取腦組織。大鼠腦組織平均分為4部位，每部分厚度大約1 cm。標本經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.6hBMSCs腦內移植遷移的檢測

1.6.1CM-DiI熒光檢測

白色區域(4～6 mm)組織取材后，立即用OCT包埋，恒溫冷凍切片機切片，切片厚度為10 μm，每部分組織共切取20張切片，經4℃多聚甲醛固定10 min后晾干，與-80℃冰箱保存。觀察時，將切片從冰箱取出，室溫放置30 min，PBS洗10 min后，直接用含有DAPI的封片劑封片，5 min后直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察，并做記錄。

1.6.2Real-time PCR檢測SRY基因

通過檢測男性Y染色體特有基因SRY基因，觀察hBMSCs的遷移和移植情況。腦組織沿冠狀分成12～14個腦冠狀面，厚度為3 mm或6 mm，將每個厚為3 mm的腦冠狀面分成重量為100～200 mg的小組織塊，提取組織總DNA。制備標準品的制備并建立標準曲線。每個腦組織樣本重復4次，根據標準曲線得出所檢樣本中男性DNA的含量。95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s 45個循環。人SRY基因引物序列Forward：5′-GGCGAAGATGCTGCCGAAG-3′，Backward： 5′-TTCGCTGCAGAGTACCGAAGC-3′，熒光報告探針：FAM-TGCAGTTTGCTTCCGG CAGATCC-TAMRA

2　結果

2.1移植后一般情況觀察

術后動物呼吸平穩，飲食和排泄均正常，四肢運動正常。頭部傷口干燥結痂，無紅腫及滲出。和hBMSCs移植前相比，移植后1周和2周，血液中的白細胞及分類細胞學均未見明顯異常。

2.2局部炎癥反應和排斥反應

通過觀察HE染色和對炎細胞、參與免疫反應的抗原提呈細胞及效應細胞的檢測來觀察局部炎癥反應及排斥反應。結果發現，注射部位腦組織輕微空泡變性，少量泡沫細胞聚集，未見其他炎細胞浸潤，未見明顯水腫和神經元變性壞死(圖2)，其他臟器和器官組織學檢查也未見異常。免疫組織化學結果顯示，移植局部腦組織，CD4、CD8、CD57和HLA-DR均呈陰性表達，CD68和CD45可見個別陽性細胞，在移植對照組也可見到。

2.3CM-DiI熒光觀察結果

CM-DiI熒光示蹤結果發現，hBMSCs在腦內能夠廣泛遷移，每個腦冠狀面均能觀察到CM-DiI的紅色熒光信號。移植后2周，hBMSCs在腦內遷移范圍廣泛，每個腦冠狀面均能觀察到CM-DiI的紅色熒光信號，以移植部位所在腦冠狀面(第1、2和4腦冠狀面)熒光信號比較密集，第2個腦冠狀面的熒光信號仍然聚集于與注射部位相對應的區域，其他冠狀切面也能觀察到少量的熒光信號。移植后4周，hBMSCs在腦內的遷移更為廣泛，每個冠狀面均能觀察到CM-DiI熒光信號，移植部位所在腦冠狀面信號仍然最為密集，第2、4、5和6腦冠狀面均能觀察到較多且彌散分布的熒光信號，與移植2周相比，熒光信號的分布更為分散，該結果提示隨著時間的變化，hBMSCs在腦內逐步遷移(圖3)。

2.4hBMSCs移植后遷SRY基因檢測

從SRY基因DNA分布圖觀察，hBMSCs移植后，每個腦冠狀面均能檢測到SRY基因的存在，不同受體之間存在重疊現象。移植后2周，男性DNA主要分布與第2、3、4和5腦冠狀面，其含量峰值位于第3個腦冠面(注射部位所在腦冠狀面)，其左右相鄰腦冠面的含量也明顯高于其他冠面。移植后4周，男性DNA主要分布于3、4、5、6和7腦冠狀面，其含量峰值位于第5個面，總體DNA含量較高的腦冠狀面為3、4、5、6腦冠狀面(圖4)。MSCs移植4周后的分布區域要比移植后2周的分布廣泛，呈現從前往后遷移的趨勢。檢測到SRY基因的位置與觀察到熒光信號的位置基本基本保持一致。具體分布見圖5。

3　討論

神經系統的疾病復雜多樣，大多呈慢性過程，且往往導致嚴重的后果，由于腦內神經不能再生，因此這些疾病治療起來比較困難，到目前為止，臨床仍沒有很好的治療方法。干細胞的應用，為這類疾病的治療帶來了希望。MSCs能夠在腦內遷移和分化，加上其獲取簡單，體外擴增容易，能夠被修飾表達特異重組蛋白，使得它們成為神經系統疾病治療的首選種子細胞，為MSCs的臨床應用奠定了理論基礎。

有研究證實小鼠骨髓來源的BMSCs，同種移植后，能夠在腦內長期存活并廣泛遷移[14, 15]，Munoz-Elias將大鼠來源的MSCs向胚胎大鼠的腦室內注射，發現MSCs可以移植、遷移和分化，并能夠長時間的存活[16]，Isakova等[10]將恒河猴的BMSCs同種移植到大腦尾狀核，發現其可在恒河猴腦內長期存活達6個月，并能在腦內廣泛遷移，并且發現直接腦內移植是安全的。直接注射到小腦的未經修飾的MSCs可以減輕Niemann-Pick C型疾病中的炎癥反應[17]。盡管有很多學者已經做過非人類BMSCs在小鼠、大鼠和恒河猴等實驗動物直接腦內注射安全有效，MSCs并能腦內廣泛遷移，但hBMSCs直接腦內注射非人靈長類的安全性如何，尚沒有文獻報道。

注：(A)hBMSCs移植后2周；(B)hBMSCs移植后4周。圖2　hBMSCs移植部位腦組織HE染色 Note.(A)2 weeks post-transplantation;(B)4 weeks post-transplantation.Fig.2　HE staining of injection sites of hBMSCs transplantation

注：A和B分別代表hBMSCs移植后2周和4周;不同的顏色代表不同的DNA含量;顏色條下方的數據單位為ng。圖4　SRY基因含量分布示意圖Note.A and B showed the distribution of hMSCs after 2 weeks and 4 weeks transplantation respectively;The different color represents different content of SRY gene;The unit under the colour bar is ng. Fig.4　Sketch diagram of SRY gene content distribution

注：移植后2周，男性DNA的含量峰值位于第3個面，而hBMSCs移植后4周，男性DNA的含量峰值位于第5個面。圖5　hBMSCs腦內移植水平評價Note.The peak content of male DNA located in the third brain section after 2 weeks transplantation and in the fifth brain section after 4 weeks transplantation. Fig.5　Evaluation of hBMSC engraftment in the CNS

為了評估腦內移植hBMSCs局部治療的安全性及其在腦內的遷移情況，該研究參考了Isakova等[10]的研究方法，將hBMSCs直接注射到幼年食蟹猴大腦尾狀核內，觀察對幼年食蟹猴健康、行為及注射局部腦組織的影響，并通過real-time PCR和體外標記hBMSCs的方法，觀察hBMSCs在腦內的移植水平和遷移情況。紋狀體包括豆狀核和尾狀核，后者是由部分復雜的連接大腦皮質、基底核以及丘腦的回路組成，具有廣泛的認知和運動功能，紋狀體-丘腦回路包括拮抗紋狀體回路，與行為、運動控制有關，該部位與多種肌張力障礙和運動障礙疾病相關，選擇該部位注射，更能評價hBMSCs移植的安全性，為上述疾病的治療奠定基礎。 我們的研究結果顯示hBMSCs直接腦內注射后未引起明顯副作用，包括移植側的一過性偏癱、飲食飲水障礙、腦水腫癥狀以及情緒變化等。局部注射部位未發現腦組織的水腫、變性壞死，炎細胞浸潤以及明顯的膠質細胞聚集。hBMSCs移植后的短期內(4周)，受試動物未見明顯副作用，提示它們對該操作的耐受性比較好，腦內直接注射干細胞移植法治療神經系統疾病是安全可行的。該研究對hBMSCs直接腦內注射的安全可行性進行驗證，對hBMSCs腦內移植后的遷移能力進行了檢測，為將來其在神經系統疾病中的臨床應用提供理論依據。

為了檢測干細胞移植后在腦內前遷移和分布情況，我們應用CM-DiI體外示蹤及體內特異性SRY基因檢測的方法，比較準確的示蹤移植到腦內的hBMSCs。Real-time PCR結果顯示hBMSCs可以在腦內廣泛遷移，這些數據可以代表整個大腦的1/3的干細胞的移植水平。由real-time PCR的數據繪制成的柱狀圖發現，每個腦冠狀面檢測到的基因的含量以注射部位所在腦冠狀面及相鄰腦冠狀面比較高，但在前腦和小腦也可以檢測到，并且顯示移植的細胞多定位在某些特定的區域。盡管hBMSCs是單側注射的，但是雙側大腦半球均可以檢測到SRY基因存在，而且不同移植受體之間，一些區域hBMSCs移植存在著重疊，從柱狀圖我們可以推斷出，雖然SRY基因的含量在移植后2周和4周沒有統計學上的差異，但是隨著移植時間的推移，hBMSCs的遷移有沿著頭部向尾部遷移的趨勢。CM-DiI熒光信號檢測結果同時也繪制成不同腦冠狀面的分布圖，結果顯示 hBMSCs的遷移具有從頭部向尾部遷移的趨勢，與real-time PCR的結果相一致。熒光觀察還發現大量的hBMSCs向血管周、腦室旁進行遷移，部分血管內及腦室內也可觀察到熒光信號，這提示MSCs還可能通過血液循環和腦脊液循環進行快速的遷移。

我們移植hBMSCs到幼年食蟹猴腦內，結果證實直接腦內注射短期內(4周)局部腦組織沒有觀察到炎癥反應和免疫反應，并且可以在腦內持續存活和遷移，這為hBMSCs的臨床應用治療兒童中樞神經系統疾病打下了理論基礎。但hBMSCs長期移植的安全性還需進一步實驗證明，而hBMSCs的遷移機制也是復雜多樣的，也還需要進一步研究闡明。

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Safty evaluation, migration and distribution of human bone marrow derived-mesenchymal stem cells in the cns of young macaca fascicularis

LI Jia-mei1, 2, ZHU Hua2, YAO Zhi-gang1, 2, DENG Wei2, LI Qin3, MA Chun-mei2, QIN Chuan2*

(1. Department of Pathology, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China;2. Department of Pathology, Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China; 3. China Motac collaborative laboratory, Institute of Laboratory AnimalScience, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)

Objective To evalutate the safty of hBMSCs transpalntation and to observe their migration and distribution in the brain of young macaca fascicularis. To establish a new technology platform and theoretical basis for the treatment of central nervous system diseases in children.MethodsLabelled hBMSCs were transplanted into the striatum of young macaca fascicularis. Brain sections were examined to evalutate the inflammatory reaction and immunological rejection of local injection sites by HE observation and immunohistochemical staining. Migration and distribution of transplanted-hBMSCs was observed by real-time fluorescence quantitative PCR of male DNA and fluorescence microscope.ResultsThe results showed that the direct intracerebral injection of hBMSCs did not cause systemic symptoms in animals. There is no inflammatory reaction and immunological rejection was detected, and degeneration and necrosis of neural cells and proliferation of glial cells were absent in the local injection sites. The transplanted hBMSCs survived, and migrated into the brain after 4 weeks transplantation. Its migration and distribution have certain regularity and were overlapping between transplant recipients. In addtion, hBMSCs tended to extend rostrally into the forebrain and showed preference of migrating toward the blood vessels and below the ependyma.ConculsionsIntracerebral transplantation of hBMSCs is safe. And hBMSCs can survive and migrate into the brain.

Human bone marrow derived-mesenchymal stem cells; Macaca fascicularis; Migration; Distribution

國家自然科學基金項目(81502568,81402479)，山東省醫藥科技發展計劃項目(2014WS0355)。

李加美(1981- )，女，主治醫師，研究方向：干細胞。E-mail: lijiamei366@126.com。

秦川(1959-)，女，教授，研究方向：阿爾滋海默病的比較醫學。E-mail: chuanqin @vip.sina.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0007-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.002

2016-03-08