血壓的性別差異與小鼠腎臟鈉離子通道的關系

王偉，俞國峰，程夢婷，趙蓉，劉珍

(溫州醫科大學，檢驗醫學院生命科學學院，浙江省遺傳學重點實驗室，浙江 溫州　325035)

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血壓的性別差異與小鼠腎臟鈉離子通道的關系

王偉，俞國峰，程夢婷，趙蓉，劉珍*

(溫州醫科大學，檢驗醫學院生命科學學院，浙江省遺傳學重點實驗室，浙江 溫州325035)

目的研究雌雄小鼠的血壓、腎臟尿鈉排泄以及相關的腎臟鈉離子通道和信號通路，初步探討血壓的性別差異與腎臟鈉離子通道的關系。方法選取成年雌雄小鼠，用無創血壓儀檢測小鼠血壓，火焰分光光度計測量小鼠血、尿鈉離子濃度，Real-time PCR和Western-Blot檢測小鼠腎臟鈉氯同向轉運體(NCC)、鈉鉀氯同向轉運體(NKCC2)、上皮鈉離子通道(ENaC)的表達水平，以及上游的缺乏賴氨酸的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(WNK激酶)的mRNA水平。 結果雌鼠血壓低于雄鼠，尿鈉排泄高于雄鼠，NCC、NKCC2的mRNA和蛋白水平均明顯增加，ENaC無明顯差異，WNK4顯著升高，WNK1無差異。結論雌鼠血壓低于雄鼠可能是由雌鼠尿鈉排泄增加導致，WNK4-NCC/NKCC2信號通路參與其調控。

性別；血壓；鈉離子通道；WNK；小鼠

血壓存在兩性差異，女性在絕經前的血壓和高血壓的患病率均低于男性，其具體機制尚未完全闡明[1,2]。血壓的調控受多種因素影響[3]，其中腎臟起著至關重要的作用[4,5]。已有報道，腎臟主要通過腎素血管緊張素醛固酮(RAAS)系統[6]調節離子轉運[7]以維持血壓平衡。大量的研究表明，性別與RAAS系統密切相關[8-12]。其中腎臟中參與血壓調節的鈉離子轉運蛋白有鈉氯同向轉運體(NCC)，鈉鉀氯同向轉運體(NKCC2)以及上皮鈉離子通道(ENaC)等[13]。

近來研究發現，NCC/NKCC2受WNK- SPAK/OSR1-NCC/NKCC2信號通路的調節[14-16]。WNK激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族新成員，自2001年耶魯大學首次提出WNK突變會導致一種新型的家族性高血鉀高血壓(FHHt)后，WNK激酶對腎臟離子通道影響的研究成為熱點。

本研究通過分析雌、雄小鼠的血壓、腎臟鈉離子通道以及WNK信號通路的異同，以期發現它們之間的關聯，初步探討血壓的性別差異與腎臟鈉離子通道的關系。

1　材料和方法

1.1實驗動物

20～24周齡的SPF級C57BL/6J雌、雄小鼠各10只，體重20～25 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]。動物實驗均于溫州醫科大學實驗動物中心[SYXK(浙)2015-0009]進行，實驗中涉及的動物操作均遵守實驗動物使用的3R原則。

1.2主要儀器及試劑

儀器：小鼠代謝籠購自北京佳源興業科技有限公司；小鼠無創血壓計(BP-98A)購自日本Softron公司；火焰分光光度計(PFP7)購自英國JENWAY公司；蛋白電泳儀(Bio-Rad 通用蛋白電泳及轉膜系統)；蛋白印跡成像系統(Bio-Rad Chemi Doc MP)；Real-time PCR System(Bio-Rad：CFX96系統)。

試劑：TRIzol?RNA分離試劑購自Life Technologies；反轉錄試劑盒(Takara)；熒光定量試劑盒SYBR(Bio-Rad)；蛋白濃度定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific)。

抗體：兔抗鼠NCC (Stress Marq)；兔抗鼠NKCC2 (Stress Marq)；兔抗鼠WNK4 (Alpha Diagnostic)；兔抗鼠ENaC (Alonmone)；兔抗鼠β-actin (Beyotime)。

1.3血壓的測量

采用尾套法測量小鼠尾動脈血壓。小鼠在訓練3 d后每天固定時間測量至少20個循環，持續測量5～7 d的血壓。

1.4血鈉與尿鈉的檢測分析

血鈉：小鼠麻醉后眼眶靜脈取血，低速離心取上清，用火焰光度計檢測血清鈉水平。

尿鈉：小鼠置于代謝籠，期間供給常規飼料和自由飲水，待其穩定后收集尿樣，用火焰光度計檢測尿鈉離子濃度。

1.5腎臟相關蛋白分子的檢測

1.5.1轉錄水平—Real-time PCR

小鼠麻醉后取腎臟，按照TRIzol試劑盒操作說明裂解分離提取總RNA，經反轉錄后得到cDNA，按照Real-time PCR儀器操作要求進行熒光定量分析。其中所用的引物序列如下：

Renin (F:5’-ATGAAGGGGGTGTCTGTG-3’;R:5’-ATGTCGGGGGAGGGTGGGC-3’);

NCC (F:5’-GGGTTTGTGTCATGAGGAT-3’;R:5’-AGATGGTGCTAGCCTGCT-3’);

NKCC2 (F:5’-CCAGAGCGTTGTCTAAAGC-3’;R:5’-TGGGCAGCTGTCATCACTTA-3’);

WNK4 (F:5’-GCGGAGGAGGTGGCT-3’;R:5’-GCCACTGGCTGGTAGTCA-3’);

WNK1 (F:5’-GTCTGGACACCGAAACCAC-3’;R:5’-AGAAACTACTAGTAGTAGCAAAATCCT-3’);

Cyclophilin (F:5’-CGTGGCTCCGTTGTCTT-3;R:5’-TGACTTTAGGTCCCTTCTTCT-3’)。

1.5.2蛋白水平—Western-blot

小鼠麻醉后取腎臟，裂解提取總蛋白，經SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜。一抗均為兔抗鼠單克隆抗體，稀釋度為1:2000。為避免免疫印跡不同標本蛋白量不同造成的影響，免疫印跡結果用β-actin進行矯正。二抗均為山羊抗兔單克隆抗體，稀釋度為1:4000。

1.6數據統計分析

2　結果

2.1血壓和鈉代謝

基礎狀態下，雌鼠血壓明顯低于雄鼠(F:117.6±0.54 vs M:110.0±0.67 mmHg,P< 0.05，圖1A)，伴隨雌鼠腎素mRNA水平升高50%(圖1B)。雖然雌、雄小鼠血鈉水平無明顯差異(圖1C)，但雌鼠尿鈉排泄明顯高于雄鼠(F:514.30±23.1 vs M:365.0±27.2 μmol/24 h，P< 0.05，圖1D)。這提示雌鼠血壓低于雄鼠可能是由雌鼠尿鈉排泄增加導致。

注: *P < 0.05；NSP>0.05，與雄鼠相比。圖1　雌雄小鼠的血壓、腎素、血鈉和尿鈉的分析Note. *P < 0.05；NSP>0.05，compared with M group.Fig.1　Analysis of blood pressure, renin, plasma sodium level and urinary sodium excretion in male and female mice

2.2腎臟鈉離子通道蛋白

在腎臟鈉分泌中起重要調控作用的鈉離子通道蛋白主要有遠曲小管的鈉氯共轉運體(NCC)、髓袢升支粗段的鈉鉀氯共轉運體(NKCC2)和皮質集合管處的上皮鈉離子通道蛋白(ENaC)。為研究雌、雄小鼠血壓與腎臟鈉離子通道的關系，我們檢測了上述通道的mRNA和蛋白水平表達量。

2.2.1NCC(sodium chloride cotransporter)鈉氯同向轉運體

如圖2A所示，Western-blot結果顯示，與雄鼠相比，雌鼠NCC 蛋白表達量增加約80%，Real-time PCR顯示雌鼠NCC的mRNA水平比雄鼠增加70%(圖2B)。

2.2.2鈉鉀氯共轉運體(Na-K-2Cl cotransporter-2, NKCC2)

如圖3A 的Western-blot結果顯示：相對于雄鼠，雌性小鼠NKCC2 蛋白表達量升高一倍。Real-time PCR顯示雌鼠NKCC2的mRNA水平高于雄鼠約60%(圖3B)。

2.2.3ENaC-β(epithelial sodium channel)上皮鈉離子通道蛋白

雌、雄小鼠ENaC轉錄水平和翻譯水平表達差異無統計學意義(圖4A、4B)。

注：(A)蛋白印跡分析;(B)實時熒光定量分析;*P < 0.05，與雄鼠相比。圖2　雌雄小鼠腎臟NCC的表達Note. A: Western-blot ; B: Real-time PCR analysis；*P < 0.05，compared with M group.Fig.2　The expression of NCC in male and female mice

注：(A)蛋白印跡分析; (B)實時熒光定量分析;*P < 0.05，與雄鼠相比。圖3　雌雄小鼠腎臟NKCC2的表達Note.(A)Western-blot ; (B)Real-time PCR analysis；*P < 0.05，compared with M group.Fig.3　The expression of NKCC2 in male and female mice

注：(A)蛋白印跡分析; (B)實時熒光定量分析; NSP > 0.05，與雄鼠相比。圖4　雌雄小鼠腎臟ENaC-β的表達Note.(A)Western-blot ; (B)Real-time PCR analysis；NSP > 0.05，compared with M group.Fig.4　The expression of ENaC-β in male and female mice

2.3WNK激酶

通過檢測WNK 激酶家族中的WNK1和WNK4，發現雌鼠腎臟WNK4 轉錄水平高于雄鼠約50%(圖5A)，而WNK1在雌、雄小鼠之間無顯著差異(圖5B)。

注: *P < 0.05；NSP > 0.05，與雄鼠相比。圖5　實時熒光定量分析WNK4和WNK1 的mRNA水平Note. *P < 0.05；NSP > 0.05，compared with M group.Fig.5　Real-time PCR analysis of WNK4 and WNK1 mRNA expression

3　討論

大量研究表明，血壓存在著一定的性別差異，已發現與同齡男性相比，絕經前女性的血壓較低，但具體機制尚未闡明。我們發現雌鼠的血壓低于雄鼠，雖然之前Swasti Tiwari[17]報道雌、雄小鼠血壓差別不明顯，可能是小鼠的背景不同，或是血壓測量方法不同導致。腎素-血管緊張素-醛固酮系統可維持血壓的平衡，我們的結果顯示，雌鼠腎素水平高于雄鼠，可能是血壓低導致的反饋性上升。

血壓的調控受多方面影響，其中腎臟鈉離子的重吸收對維持血壓的穩定起著重要調控作用。我們的研究發現，雌鼠尿鈉排泄升高，這可能是導致雌鼠血壓下降的一個重要因素。尿鈉的排泄增加一般會伴隨著腎臟鈉離子轉運通道的下降，但是我們的研究表明，NCC、NKCC2的表達量上升，這和雌鼠血壓下降、排鈉增多的結果相悖，其具體機制未知，可能是鈉排泄增加導致的NCC、NKCC2代償性上升[18-23]。

已有研究表明，WNK激酶與SPAK/OSR1形成的信號通路對NCC &NKCC2 起著重要的調控作用，Rojas-Vega[24]報道，雌鼠的SPAK/OSR1明顯高于雄鼠，我們的結果顯示，雌鼠WNK4的表達量明顯高于雄鼠,WNK1無統計學意義，提示WNK4-SPAK /OSR1-NCC/NKCC2信號通路可能參與雌雄小鼠血壓差異的調控。

綜上所述，不同性別小鼠之間存在血壓差異，這一差異與腎臟的鈉離子轉運通道 NCC /NKCC2 以及WNK4激酶信號通路密切相關，其具體機制尚待進一步研究[25-27]。

[1]Reckelhoff JF.Gender differences in the regulation of blood pressure [J].Hypertension, 2001, 37(5):1199-1208.

[2]Antoinette PB, Michel B.Female sex hormones, salt, and blood pressure regulation [J]. American Journal of Hypertension, 2004, 17(10):994-1001.

[3]Lyngdoh T, Viswanathan B, Myers GJ,etal. Impact of different adiposity measures on the relation between serum uric acid and blood pressure in young adults [J].Journal of Human Hypertension,2012, 26(11):677-683.

[4]李卓, 劉雙信, 史偉. 高血壓與腎臟病 [J].中華老年多器官疾病雜志, 2012, 11(1):11-14.

[5]唐政, 尹廣. 腎臟和高血壓的相互關系 [J]. 中國醫師進修雜志, 1995(9):1-4.

[6]杜新平, 柯生發, 蔣文平. 腎素-血管緊張素系統與高血壓研究進展 [J]. 心血管病學進展, 2001, 22(2):104-105.

[7]María CB, Gerardo G. Mechanisms of sodium chloride cotransporter modulation by angiotensin II [J]. Current Opinion in Nephrology & Hypertension, 2012, 21(5):516-522.

[8]Tiwari S, Li LS, Halagappa VK,etal. Sex differences in adaptive downregulation of pre-macula densa sodium transporters with ANG II infusion in mice [J]. American Journal of Physiology Renal Physiology, 2010, 298(1):187-195.[9]Baojian Xue, Alan Kim Johnson, Meredith Hay. Sex differences in angiotensin II- and aldosterone-induced hypertension: the central protective effects of estrogen [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2013, 305(5):459-463.

[10]Komukai K,Mochizuki S,Yoshimura M.Gender and the renin-angiotensin-aldosterone system [J]. Fundamental & Clinical Pharmacology, 2010, 24(6):687-698.

[11]Brown RD, Hilliard LM, Head GA,etal. Sex differences in the pressor and tubuloglomerular feedback response to angiotensin II [J]. Hypertension, 2012, 59(1):129-135.

[12]Qi Y, Wang X, Rose KL,etal. Activation of the Endogenous Renin-Angiotensin-Aldosterone System or Aldosterone Administration Increases Urinary Exosomal Sodium Channel Excretion [J]. American Society of Nephrology, 2016, 27(2): 646-656.

[13]Heo NJ, M-J S, Lee JW,etal. Effect of estradiol on the expression of renal sodium transporters in rats [J]. Climacteric, 2013, 16(2):265-273.

[14]Rafiqi FH, Annie Mercier Zuber, Mark Glover,etal. Role of the WNK-activated SPAK kinase in regulating blood pressure [J]. Embo Molecular Medicine, 2010, 2(2):63-75.

[15]Bergaya S, Faure S, Baudrie V,etal. WNK1 regulates vasoconstriction and blood pressure response to α 1-adrenergic stimulation in mice [J]. Hypertension, 2011, 58(3):439-445. [16]Richardson C, Alessi DR. The regulation of salt transport and blood pressure by the WNK-SPAK/ OSR1 signalling pathway [J]. Cell Sci, 2008, 121(20):3293-3304.

[17]Swasti T, Lijun L, Shahla R,etal. Sex and age result in differential regulation of the renal thiazide-sensitive NaCl cotransporter and the epithelial sodium channel in angiotensin II-infused mice [J]. American Journal of Nephrology, 2009, 30(6):554-562.

[18]張艷榮，全雄志，董偉，等. 多巴胺D5 受體轉基因小鼠的建立[J].中國比較醫學雜志,2008,18(5):54-58.

[19]唐振旺,肖莉, 郭紫芬,等. 血壓的性別差異及其生物學意義[J].中國動脈硬化雜志, 2010,18(12):996-1000.

[20]董偉, 楊志偉, 曹興水,等. 不同鼠齡的人多巴胺D5F173L突變基因轉基因高血壓小鼠血壓及心臟結構與功能分析 [J]. 中國比較醫學雜志, 2010, 20(8): 1-5.

[21]黃群英, 羅素芬, 晉學慶. 不同年齡自發性高血壓大鼠腎臟AT-1R和AT-2R的表達[J].中國比較醫學雜志, 2009, 19(12): 19-23.

[22]張敏，王艷. 腎小管Na-Cl共同轉運體與血壓關系的研究 [J]. 中華腎臟病雜志, 2015, 31(12): 941-943.

[23]華琦, 王艷玲. 女性高血壓的發病特點及治療對策 [J]. 中華高血壓雜志, 2010(9):803-805.

[24]Rojasvega L, Reyescastro LA, Ramírez V,etal. Ovarian hormones and prolactin increase renal NaCl cotransporter phosphorylation [J]. American Journal of Physiology Renal Physiology, 2015, 308(8): 799-808.[25]Pedro SC,Paola DLH,Jose PC,etal. WNK kinases, renal ion transport and hypertension [J]. American Journal of Nephrology, 2008, 28(5):860-870.[26]Yang SS, Lin SH, Huang CL. Role of WNK Kinases in Blood Pressure Control [J]. Current Hypertension Reviews, 2008, 4(3):161-166.

[27]Yang CL, Zhu X, Wang Z,etal. Mechanisms of WNK1 and WNK4 interaction in the regulation of thiazide-sensitive NaCl cotransport [J]. Clin. Invest, 2005, 115(5):1379-1387.

Relationship between gender difference of blood pressure and sodium ion channels in the kidney of mice

WANG Wei, YU Guo-feng, CHENG Meng-ting, ZHAO Rong, LIU Zhen*

(Wenzhou Medical University,School of Laboratory Medicine and Life Science,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical,Wenzhou 325035,China)

ObjectiveStudy on the blood pressure, renal sodium excretion, related renal sodium ion channels and signaling pathways between male and female mice, to investigate the relationship between gender differences in blood pressure and renal sodium ion channel.MethodsBlood pressure of adult female and male mice was measured using tail-cuff sphygmomanometer. Plasma and urine electrolytes were performed using flame photometer.Protein levels of renal sodium transporters NCC, NKCC2, ENaC were determined by western blot, mRNA levels of these transporters and the upstream With No lysine (WNK) kinases were determined by Real-time PCR.ResultsThe blood pressure of female mice was significantly lower than that of male mice. Renal sodium excretion and mRNA levels of NCC&NKCC2 were increased significantly in female mice. No obvious difference was observed in ENaC. The mRNA level of WNK4 was increased while no change in WNK1.ConclusionsThe lower blood pressure of female mice may caused by increasing renal sodium excretion and WNK4-NCC/NKCC2 signaling pathway involved.

Gender; Blood pressure; Sodium ion channels; WNK; Mice

國家自然科學基金(81300709)；浙江省自然科學基金(LY13H070007)。

王偉(1986-)，男，研究生，專業：生物學。E-mail: aster2103@126.com。

劉珍(1975-)，女，教授，研究生導師，研究方向：腎臟生理學。E-mail: zhenliuus@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0013-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.003

2016-03-30