耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立

李航，龔寶勇，羅銀珠，吳玉娥，陳梅玲，陳銳，劉曉霖，王暉，黃韌，張鈺*

(1.廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州　510663；2.廣東藥學院中藥學院，廣州　510006)

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耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立

李航，龔寶勇1，羅銀珠1，吳玉娥1，陳梅玲1，陳銳1，劉曉霖1，王暉2，黃韌1，張鈺1*

(1.廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州510663；2.廣東藥學院中藥學院，廣州510006)

目的 為新藥篩選建立耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型。方法對免疫抑制ICR小鼠靜脈注射臨床耐氟康唑白色念珠菌CaR，通過臨床癥狀、生存情況、組織載菌量、組織病理、細胞因子分析以及藥物治療等方法對模型評價。結果CaR感染小鼠在接種后第1天出現死亡，相比臨床藥敏菌株CaS感染組，16 d觀察期內動物死亡率無顯著性差異(CaR, 90.7%; CaS, 86.2%,P=0.158)，但觀察早期CaR組死亡比CaS組快。感染第4天，不同組織均可檢測到念珠菌，并發現與CaS組相比，腎、腦組織載菌量具有顯著性差異。真菌引起的典型肉芽腫樣是腎、腦、心的主要組織病理學特征。利用流式細胞儀檢測腎組織細胞因子，IL-1α、IL-6、TNF-α、IFN-γ等細胞因子變化顯著，與CaS組比較，IL-1α和IFN-γ顯著升高，TNF-α顯著下降。CaR和CaS感染小鼠給予10 mg/kg氟康唑治療，死亡率分別為83.3%、37.5%，具有顯著性差異。結論本研究成功建立了耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型，有望成為抗感染新藥研發的重要工具。

耐藥白色念珠菌；感染；模型

白色念珠菌是一種常見的二相性條件致病菌，平時以酵母相寄居在人體中，酵母相白色念珠菌一般不致病。由于艾滋病、癌癥放化療、器官移植等患者免疫功能低下或免疫功能受到抑制，酵母相白色念珠菌會由共生菌發芽增殖為菌絲相致病菌，此時白細胞對其吞噬率及殺滅率大幅降低，這導致臨床上白色念珠菌感染的比例大大提高[1]。據統計，全身性白色念珠菌感染有著高達31.8%的死亡率[2]，也是醫院重癥監護病房第四大血液感染因素[3,4]。

氟康唑為第三代三唑類抗真菌藥，自上市后憑借良好的臨床療效被廣泛應用，但長期大劑量使用導致院內感染耐藥菌分離率越來越高，趙德軍等[5]檢測出院內感染白色念珠菌的耐氟康唑菌株可達10.4%，劉宇[6]在院內感染白色念珠菌感染中耐氟康唑菌株檢出率也有10.0%，可見院內感染中白色念珠菌耐藥菌感染問題日益嚴峻，這就亟需開展及加強抗耐藥白色念珠菌藥物的研究。動物模型作為疾病機理和藥物開發研究的重要工具，建立耐藥念珠菌感染動物模型對開展耐藥菌株的藥物篩選具有重要意義。

1　材料和方法

1.1實驗動物

SPF級5～6周齡雌性ICR小鼠，體重24～26 g，購自廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0002]，飼養在廣東省實驗動物監測所負壓屏障小鼠房[SCXK(粵)2012-0122]，實驗動物飼料由廣東省醫學實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。實驗研究計劃通過廣東省實驗動物監測所IACUC審查(編號：IACUC2012006)。

1.2供試菌株

臨床耐氟康唑菌株CaR、臨床藥敏菌株CaS[7]由中國科學院北京微生物研究所張立新研究員惠贈，均置于-80℃冰箱保存。使用前利用活菌計數法確定菌液濃度。

1.3環磷酰胺誘導免疫抑制

ICR小鼠適應性飼養3 d后，按體重(100 mg/kg)腹腔注射環磷酰胺(CY)，連續注射3 d。

1.4感染動物生存實驗

小鼠隨機分為兩組，分別尾靜脈注射濃度為5.0×105CFU/mL的CaR、CaS菌液0.2 mL/只。每天定時觀察感染小鼠臨床癥狀及生存情況，及時將死亡小鼠取出。記錄小鼠弓背、眼睛或鼻子出現分泌物、呼吸異常、離群等異常情況，當小鼠出現不能行走、瀕臨死亡時進行安樂死，記做第二天死亡。觀察16 d，統計小鼠生存情況。

1.5指標檢測

1.5.1組織載菌量檢測

在感染第2、4、6天，每組5只小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織取出后稱重，加入1.0 mL無菌生理鹽水研磨至勻漿，確定適當稀釋度，吸取0.2 mL勻漿液接種于YEPD培養基，計算各組織載菌量。

1.5.2組織病理診斷

在感染第4天，每組3只小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織取出后放入10%福爾馬林溶液中，制備病理切片，進行HE染色和PAS染色。

1.5.3細胞因子檢測

將感染第4天小鼠腎組織勻漿液4℃低溫冷凍離心機3000 r/min離心10 min，取上清液做細胞因子檢測。

1.6模型的藥效評價應用

CaR組和CaS組小鼠尾靜脈注射5.0×105CFU/mL白色念珠菌0.2 mL/只，在感染后5 h給予小鼠按體重(10 mg/kg)灌胃給予臨床藥物氟康唑治療，連續給藥5 d。觀察16 d，統計小鼠生存情況。

1.7統計學方法

2　結果

2.1耐藥念珠菌感染小鼠臨床癥狀及生存情況

CaR組和CaS組小鼠感染白色念珠菌臨床癥狀基本一致，感染后體質明顯虛弱、立毛嚴重，眼部出現分泌物，CaR組感染第一天出現死亡，而CaS組在感染第二天出現死亡。在感染早期，CaR感染小鼠死亡率比CaS感染高，中位生存期分別為3.3 d、6.8 d；感染后期小鼠出現身體傾斜、偏頭等神經系統癥狀；尸體剖檢，可見感染小鼠腎腫大，表面有白色斑點，其它組織未見明顯病變。16 d觀察期內，兩種菌株感染動物死亡率分別為90.7%、86.2%，無顯著差異，結果見圖1。

注：3次獨立實驗。圖1　白色念珠菌感染小鼠生存曲線(n=29)Note.3 independent experiments.Fig.1　Survival curves of mice infected with Candida albicans

注： *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與CaS組相比。圖2　組織載菌量(n=5)Note. *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，Compared with the CaS group.Fig.2　Fungal burden in tissues

2.2指標檢測結果

2.2.1耐藥念珠菌感染小鼠組織載菌量變化

感染第2天CaR組小鼠各組織均可檢測到念珠菌，隨著感染時間的推移，各組織載菌量逐漸下降。其中，感染主要靶器官腎組織載菌量較高，大于107CFU/g組織，腦的載菌量在103～104CFU/g組織，明顯高于CaS感染，具有顯著性差異，結果見圖2。 2.2.2感染小鼠組織病理變化

CaR組小鼠各組織均可檢測到念珠菌。組織病理檢測顯示，腎、心、腦等能觀察到典型的病理變化。其中，腎組織的病理變化最為嚴重，HE染色顯示，大部分腎小體結構破壞，病灶周圍出現中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等大量炎癥細胞浸潤，腎小管出血。心組織可觀察到病灶中出現大量炎癥細胞浸潤，伴隨著細胞壞死，心肌纖維斷裂；大腦皮質內也能觀察到組織結構的破壞，病灶中性粒細胞及小膠質細胞浸潤。以上組織PAS染色病理切片均顯示病灶區出現大量紅色深染的酵母型、菌絲型共生的白色念珠菌。

肺、脾、肝組織較少出現典型的組織結構破壞，結果見圖3。

以上組織病理變化與CaS感染小鼠組織相比未見明顯變化。

注：(A、C、E、G、I、K)腎、心、腦、肺、脾、肝HE染色切片；(B、D、F、H、J、L)腎、心、腦、肺、脾、肝PAS染色切片。圖3　CaR組感染第4天小鼠組織切片(×20,bar=100 μm)Note.(A,C,E,G, I,K)H&E staining of kidney, heart, brain, lung, spleen, liver;(B,D,F,H,J,L)PAS staining of kidney, heart, brain, lung, spleen, liver.Fig.3　Infected mice of CaR group tissue sections at day 4 after infection

2.2.3耐藥念珠菌感染小鼠免疫因子的變化

我們利用流式細胞儀對感染第4天小鼠腎組織勻漿液上清液進行細胞因子檢測，結果發現IL-6、TNF-α、IL-1α、IFN-γ顯示明顯升高，表現典型的非特異免疫反應。CaR組與CaS組比較，在感染第4天，IL-1α、IFN-γ顯示明顯升高，TNF-α明顯下降，具有顯著性差異，結果見圖4。

注：**P < 0.01,***P < 0.001，與CaS組相比。圖4　感染小鼠第4天腎組織細胞因子含量(n=5)Note. **P < 0.01,***P < 0.001，Compared with the CaS group. Fig.4　Cytokine content of mice kidney at day 4 after infection

2.3耐藥念珠菌感染小鼠的藥效評價

CaR和CaS小鼠感染1.0×105CFU/只，給予10 mg/kg氟康唑藥物進行治療，在16 d觀察期內，CaS組生存率明顯升高，CaS組和CaR組動物死亡率分別為37.5%、83.3%，具有顯著性差異(圖5)。

注：*P < 0.05，與CaS組相比。3次獨立試驗。圖5　白色念珠菌感染小鼠給藥后生存曲線(n=29)Note. *P < 0.05，Compared with the CaS group.3 independent experiments.Fig.5　Survival curves of mice infected with Candida albicans after administration

3　討論

根據經典白色念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立方法[8]，腹腔注射環磷酰胺以降低小鼠體內白細胞數量[9]，模擬臨床免疫抑制及免疫功能低下患者；然后尾靜脈注射耐藥念珠菌CaR(1.0×105CFU/只)，成功建立了耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型。該模型以死亡為評價指標，在感染16 d內，動物死亡率約為90%。

CaR組與CaS組感染小鼠顯示相似的疾病特征，在感染的早期階段，雖然兩組感染小鼠的生存分析不能顯示顯著性差異，但CaR組小鼠中位生存時間3.3 d，明顯低于CaS組6.8 d；又因感染念珠菌小鼠的腎指數變化與其腎臟載菌量、病理變化呈正相關，腎指數能夠較準確的反應機體感染白念菌的程度[10]，在感染初期CaR組腎組織載菌量明顯高于CaS組，說明CaR菌株毒力與CaS菌株相比較強。

該模型顯示出典型的彌散性感染特征。組織病理檢測顯示，腎、腦、心組織能觀察到典型的病灶，大量炎性細胞浸潤。小鼠實質組織感染第2天就能檢測到念珠菌，其中腎組織載菌量最高，隨著感染時間的推移，組織載菌量逐漸下降。說明感染初期動物感染最為嚴重，隨后機體進行非特異性免疫，促炎因子IL-6，IL-1α，TNF-α、IFN-γ顯著升高，有效調控了機體的抗感染過程。兩組小鼠IL-1α、IFN-γ的顯著性差異由念珠菌感染程度不同引起，同時說明IL-1α、IFN-γ在抗感染過程中起重要作用。

利用建立的耐藥念珠菌小鼠模型進行氟康唑藥效評價，給予10 mg/kg的氟康唑，CaS組小鼠死亡率明顯減低，而CaR組小鼠死亡率較高，說明CaR組小鼠不能獲得有效保護，耐藥模型對氟康唑表現出耐藥性。該模型的建立為我們提供了耐藥菌株體內藥物篩選和致病機理研究的平臺，這為后期研究抗感染新藥提供體內篩選模型工具。

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The establishment of the drug-resistant Candida albicans disseminated infected mice model

LI Hang1,GONG Bao-yong1,LUO Yin-zhu1, WU Yu-e1, CHEN Mei-ling1,CHEN Rui1, LIU Xiao-lin1, WANG Hui2, HUANG Ren1, ZHANG Yu1*

(1.GuangDong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals,Guangzhou 510663,China;2.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Objective Establishing the drug-resistant Candida albicans disseminative infected mice model for new drug screening. Methods The disseminative infected mouse model was generated by intravenously injecting a clinical Drug-resistant Candida albicans strain (CaR) to immunosuppressive ICR mice. The features of model was evaluated by clinical symptom, survival condition, fungal burden in tissue, histopathology, cytokines assay and medication. ResultsAfter infected with CaR (0 day), the death of mice started at the first day, though, compared to clinical drug sensitive strain (CaS) infected group, the difference of mortality rate in 16-day observation period was not significant in two groups (CaR, 90.7%; CaS, 86.2%,P=0.158), mice in CaR group died faster than those in CaS group at the early stage; On the fourth day of infection, Candida albicans could be detected in the different tissues, and we found fungal burden in kidney and brain was a significant difference. The typical granuloma caused by fungal infection was the main histopathological feature observed in the kidney, brain and heart. Cytokines in renal tissue were detected by flow cytometry, The changes of IL-1α,IL-6,TNF-αand IFN-γin kidney were significant. Compared with CaS group, IL-1 and IFN-γ were significantly higher and TNF-αdecreased significantly in CaR group.The mice of groups CaR and CaS were treated with 10 mg/kg fluconazole, the mortality rates were 83.3% and 37.5%, which have a significant difference. ConclusionsIn this study, we successfully established a drug-resistant Candida albicans disseminative infected mice model which is potential tool for the development of new anti-infectious agent.

Drug-resistant Candida albicans; Infected;Model

廣東省科技計劃項目(2014A010107018)。

李航(1988-)，男，研究實習員，研究方向：實驗動物疾病模型。

張鈺(1970-)，女，研究員，研究方向：實驗動物疾病模型。E-mail: zhangyugzh@hotmail.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0025-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.005

2015-10-26