自發與誘發2型糖尿病小鼠模型的比較研究

倪程佩，王婧怡，沈艷華，周慧英，周正宇

(蘇州大學實驗動物中心，江蘇 蘇州　215123)

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自發與誘發2型糖尿病小鼠模型的比較研究

倪程佩，王婧怡，沈艷華，周慧英，周正宇*

(蘇州大學實驗動物中心，江蘇 蘇州215123)

目的 為比較自發與誘發2型糖尿病小鼠模型在糖代謝，胰島素抵抗以及炎癥反應等方面的差異。方法動物分為正常對照組，誘發模型組和自發模型組，每組10只。正常對照組：正常11周齡C57BL/6J小鼠；誘發模型組：用高脂飼料結合STZ誘導11周齡C57BL/6J小鼠建立糖尿病模型；自發模型組：選擇8周齡的C57BL /KsJ- db/db鼠；監測各組動物八周內體重，空腹血糖，糖耐量變化；檢測實驗前后FINS，AUC，HOMA-IR以及TNF-α，IL-18，IL-1β，INF-γ含量的變化；八周后處死動物取肝、腎、胰腺、睪丸、骨骼肌等組織做病理分析。結果在實驗周期內，自發模型組體重持續上升，而誘發模型組體重明顯下降；誘發模型組小鼠血糖八周后有所下降，而自發模型組小鼠穩定維持高血糖；誘發模型組的FINS上升，AUC以及HOMA-IR明顯下降，自發模型組FINS無顯著變化，AUC以及HOMA-IR均顯著上升；模型建立初，兩種模型鼠血清中促炎癥因子(TNF-α，IL-18，IL-1β，INF-γ)的含量均比正常對照組要高。在第八周時，誘發模型組鼠促炎癥因子部分含量有所下降，自發模型組促炎癥因子的含量都明顯的升高；兩種模型鼠的胰腺等組織均出現明顯的炎性病變。結論八周后自發性2型糖尿病模型糖代謝異常以及炎癥反應都日漸加重，長時間維持高血糖癥狀；誘發性2型糖尿病模型在飼養八周后糖代謝以及炎癥反應部分緩解，高血糖癥狀部分好轉。

2型糖尿病；小鼠模型；促炎因子

糖尿病(diabetes mellitus)一種由代謝系統紊亂引起的內分泌疾病，對機體心腦血管，神經系統，泌尿系統等都會有嚴重的破壞[1]。2013年全球大約有3.82億人患有糖尿病至2035年將會增加到5.92億[2]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者占到95%以上，其主要表現為胰島素相對不足并且伴隨有胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。用于研究的T2DM動物模型主要為兩種：①實驗誘發型，即鏈脲佐霉素(streptozotocin，STZ)加高脂飲食誘導型。②Leptin受體基因缺陷小鼠C57BL /KsJ- db/db[3]。本研究通過對這兩種模型的病理及生理比較，為之后深入研究T2DM機制研究提供參考。

1　材料和方法

1.1試劑與儀器

鏈脲佐霉素(STZ)，sigma；檸檬酸與檸檬酸鈉，Sigma；高脂高糖飼料[4](普通飼料50%、豆粉5%、干酪素5%、奶粉10%、花生5%、蛋黃粉5%、豬油12%、蔗糖5%、麻油1%、食鹽2%、維生素A+ D 10 滴)，蘇州雙獅飼料公司；ELISA試劑盒，南京建成生物有限公司；血糖儀及測試紙，羅氏；

1.2實驗動物

1.2.1動物來源

35只SPF級 3周齡18～20 g C57BL/6J雄鼠和20只SPF級 3周齡C57BL /KsJ- db/db雄鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]。

1.2.2動物分組

正常對照組(Normal)：隨機選擇3周齡體重15～20 g C57BL/6J雄鼠10只作為正常對照，基礎飼料喂養。誘發模型組(STZ+HF)： 20只3周齡C57BL/6J用高脂飼料喂養，喂養四周時， STZ注射100 mg/kg(溶于檸檬酸緩沖液)，正常對照組注射相同劑量檸檬酸緩沖液，三周后誘發模型組再次注射100 mg/kg STZ，高脂繼續喂養一周后，測量禁食8 h后血糖，血糖達到16.7 mmol/L認為造模成功，隨機選擇血糖≥16.7 mmol/L的小鼠10只作為實驗對象。自發模型組(db/db)：20只雄鼠C57BL /KsJ- db/db 3周齡，常規飼料喂養至八周齡時，選擇血糖≥16.7 mmol/L的小鼠10只作為實驗對象。

1.2.3動物飼養

動物喂養在蘇州大學實驗動物中心SPF屏障設施內[SYXK(蘇)2012-0045]，個體自由攝取水和飼料，24 h恒溫恒濕。室溫保持在(25±2)℃，濕度保持在(55±5)%，每天保持12 h的晝夜循環。所有操作符合實驗倫理委員會的要求。

1.3實驗方法

1.3.1體重測量

血糖達標后每隔6 d測量體重。

1.3.2糖耐量測試

血糖達標后每隔6 d測量，實驗前小鼠12 h禁食不禁水，以2.0 g/kg葡萄糖灌胃，于0 h、0.5 h、1 h、2 h 4個時相分別用儀檢測血糖(fasting blood glucose, FBG)用曲線下面積(area under the curve, AUC)來反映糖耐量和胰島素抵抗，HOMA-IR 指數可表示胰島β細胞功能的差異[5, 6]。

AUG=1/4( BG 0 h ) + 1/2( BG 0.5 h )+ 3/4 ( BG 1 h )+1/2( BG 2 h )

HOMA-IR=( FBG [in mmol/L] × FINS [in units/L] )/22.5

1.3.3血清胰島素含量測定

血糖達標后第1天，以及實驗結束時第57天測量空腹血糖后，眼眶靜脈取血，ELISA檢測血清胰島素含量。

1.3.4血清中TNF-α，IL-18，IL-1β，INF-γ含量檢測

同胰島素檢測方法。

1.3.5組織病理學觀察

動物脊椎脫臼處死各組織置于10%福爾馬林中固定，常規病理切片制作。

1.4統計學方法

2　結果

2.1各組動物體重變化

第零周時誘發模型組(32.856±2.106)g和自發模型組(33.874±1.86)g的體重明顯高于正常對照組(21.533±1.631)g (P< 0.05)。自發模型組小鼠第八周時體重明顯大于其他兩組 (P< 0.05)。誘發模型組體重第八周時與正常對照組無顯著差異(P> 0.05)。與誘發模型組相比，自發模型組體重明顯高于誘發模型組(P< 0.05)。(圖1)

圖1　各組小鼠的體重變化(g)Fig.1　Comparison of weigh in mouse of 3 group

2.2各組動物血糖變化

與對照組相比，誘發模型組血糖明顯升高(P< 0.05)，在第二周達到最高值(25.83±3.028) mmol/L，自發模型組在第三周開始血糖明顯高于誘發模型組(P< 0.05)，以后血糖逐漸升高，遠高于其他兩組 (P< 0.05)。第六周開始，自發模型組體重增長趨于穩定。(圖2)

注：*P < 0.05，與誘發模型組相比較。圖2　各組小鼠的空腹血糖變化(mmol/L)Note. *P<0.05，compared with the STZ+HF group. Fig.2　Comparison of fasting blood glucose in mouse of 3 group

2.3各組動物空腹胰島素變化

與正常對照組相比，第零周時兩個糖尿病模型組空腹血清胰島素含量(FINS)都與正常對照組有顯著差異(P< 0.05)。與正常對照組相比，第八周時誘發模型組INS含量無顯著性差異(P> 0.05)，而自發模型組顯著高于正常對照組(P< 0.05)。

比較第零周與第八周各組FINS的變化，自發模型組FINS含量在實驗前后有顯著性升高(P< 0.05)。(圖3)

注：*P < 0.05，與正常對照組相比較。圖3　各組小鼠FINS含量的差異Note. *P < 0.05,compared with the normal group.Fig.3　Comparison of FINS in mouse of 3 group

2.4糖代謝的變化

與正常對照組相比，在整個實驗周期內兩個糖尿病模型組AUC都存在顯著性的差異(P< 0.05)，第五周開始，誘發模型組與自發模型組相比，誘發模型組AUC有明顯下降(P< 0.05)，并且在第八周時最為明顯(P< 0.05)。(圖4)

第零周時兩個糖尿病模型組HOMA-IR指數都與正常對照組有顯著差異(P< 0.05)，胰島素抵抗嚴重。在第八周時，誘發模型組HOMA-IR比第零周時有明顯下降(P< 0.05)，而自發模型組HOMA-IR指數比第零周時有明顯上升(P< 0.05)。(圖5)

注：*P < 0.05,與誘發模型組相比較。圖4　各組小鼠糖耐量曲線下面積的變化Note. *P < 0.05, compared with the STZ+HF group.Fig.4　Comparison of AUC in mouse of 3 group

注：*P < 0.05，與正常對照組相比較；#：兩者相比有顯著性差異。圖5　各組小鼠的HOMA-IR的差異Note. *P < 0.05, compared with the normal group; #：the two groups had statistically comparative difference.Fig.5　Comparison of HOMA-IR in mouse of 3 group

2.5各組動物炎癥相關因子表達的差異

第零周時，誘發模型組血清中INF-γ明顯大于正常對照組和自發模型組(P< 0.05)，第八周，自發模型組INF-γ遠大于其他兩組(P< 0.05) (圖6 a)；在第零周時兩組糖尿病模型組小鼠TNF-α的含量遠超正常對照組(P< 0.05)，且誘發模型組明顯高于自發模型組 (P< 0.05)。第八周時，兩個糖尿病模型組中TNF-α含量大于正常對照組(P< 0.05)，自發模型組的含量明顯超過誘發模型組 (P< 0.05)，而誘發模型組在第八周時TNF-α含量顯著性下降(P< 0.05)(圖6 b)；在第零周時，誘發模型組血清中IL-18含量較高，與正常對照組之間有顯著性差異(P< 0.05)，但在第八周時誘發模型組IL-18含量明顯減少。自發模型組第八周時IL-18表達顯著增多，與正常對照組差異明顯(P< 0.05)(圖6 c)；與正常組相比，第零周時IL-1β在兩個糖尿病模型組中高濃度表達(P<0.05)。第八周時，自發模型組IL-1β含量大于誘發模型組(P< 0.05)(圖6 d)。(圖6)

2.6組織病理變化

①胰腺：誘發模型組表現為胰島萎縮，β細胞數目減少，剩余細胞代償性增大并且有脂質沉積，細胞質大小不一；自發模型組胰腺炎細胞浸潤，胰島細胞數目減少，部分細胞代償性肥大，脂肪異位沉積。②肝臟：誘發模型組肝細胞呈現混合型大小泡性脂變；自發模型組肝細胞出現彌漫性小泡性脂肪變。③睪丸：誘發模型組模型中各級生精細胞脫落減少，細胞凋亡，睪丸曲細精管萎縮，生精細胞成熟障礙。有脂肪不規則沉積；自發模型組變化相似。④腎臟：誘發模型組腎小球內部和上皮細胞都有脂質沉積，腎小球毛細血管擴張，充滿紅細胞；自發模型組腎小球萎縮硬化，且上皮細胞脂肪異樣沉積，炎性細胞浸潤等腎臟病變。⑤肌肉：；誘發模型組骨骼肌神經性萎縮；自發模型組與之相似。(圖7)

注：(a)INF-γ含量的差異(pg/mL)；(b)TNF-α含量的差異(ng/L)；(c)IL-18含量的差異(ng/L)；(d)IL-1β含量的差異(ng/L)；*P < 0.05，與正常對照組相比較，#：兩者相比有顯著性差異。圖6　各組小鼠不同時間血清中促炎相關因子含量的差異Note.(a)Concentration of INF-γ in Serum (pg/mL);(b)Concentration of TNF-α in Serum (ng/L);(c)Concentration of IL-18 in Serum (ng/L);(d)Concentration of IL-1β in Serum(ng/L)；*P<0.05, compared with the normal group; #：The two groups had statistically comparative difference.Fig.6　The concentration of four Pro-inflammatory cytokine in mouse of 3 group.

圖7　不同組小鼠各組織病理變化(bar=2 μm)Fig.7　Pathology of different tissues in each group

3　討論

在進行糖尿病研究時，常用的動物模型有：①自發性動物模型，是由自然條件下未經人為處置情況下發生， LETL 大鼠，BB (bio-breeding rat) 鼠、和NOD( Non-obese diabetic mice) 鼠常用于TD1研究，這幾種實驗動物沒有肥胖現象，并且發病之初呈現胰腺炎的癥狀[7]；常用的T2DM動物模型有 ob/ob 小鼠和 db/db 小鼠， GK大鼠等；②誘發性糖尿病模型根據制備方法的不同分為：化學藥物誘導：目前主要使用鏈脲佐菌素對胰島細胞造成破壞。飲食誘導：通過長時間的高脂飲食的喂養，造成動物代謝紊亂，進而誘發糖尿病。高脂飲食對糖尿病的影響包括對胰島細胞的毒害作用，以及造成胰島素受體細胞胰島素敏感性下降。高熱量飲食，肥胖，以及慢性炎癥是造成糖尿病的三大重要原因[8]③基因工程動物模型包括：轉基因和基因敲除模型。目前還不夠完善。

本研究中自發模型組db/db小鼠是一種Leptin瘦素受體基因缺陷導致的先天性T2DM小鼠，個體極度貪食，胰島細胞大量分泌胰島素造成胰島細胞凋亡以及IR，伴有高血糖和高血脂等特性，模型穩定性較好[9, 10]，而在誘發模型組中，通過外界環境中高脂高糖飲食的長期作用，使得胰島細胞一直處于大量分泌的狀態中，胰島分泌顆粒中胰島素不足，同時持續的高血糖又不斷地施壓，造成胰島細胞功能損傷。而大量研究證實產生IR的大鼠體內存在嚴重的氧化應激，而后者又進一步加重IR[11]。在T2DM個體中，由于長期的高糖環境，以及FFA含量的增加，造成大量ROS產生，引起有下游一系列的炎癥反應，對細胞造成損傷[12]。游離脂肪酸的作用也能通過胰島內TG的沉淀實現[13]。誘發模型組是通過高脂飲食結合化學藥物(STZ)誘導而成，STZ作為廣譜抗生素對胰島β細胞有選擇破壞功能，長期的高熱量飲食結合STZ的可誘導出 IR糖尿病模型[14]。大多數報道認為該模型穩定性好存活率高[15]，但是通過本研究發現與自發性動物(db/db)相比穩定差，該容易發生退化。。

本研究中個體周期選擇，參考了前期預實驗以及文獻資料[16]。db/db鼠在7～8周齡時出現高血糖癥狀癥狀[17]，實驗中發現db/db鼠不僅存在高血糖的癥狀，自身胰島素水平也非常高，有著嚴重的IR， TSUKUDa等[17]認為這是由于該模型小鼠大腦中缺乏或氧化物酶，造成的。

本實驗中誘發組在前期體重增加明顯。當兩種模型小鼠都出現糖尿病高血糖時，誘發模型組體重有明顯下降，自發模型組體重持續升高db/db小鼠實驗過程保持高血糖狀態，而誘發模型組血糖在造模三周之后就不斷下降，并且個體差異明顯，考慮動物本身有自我修復能力，在STZ失效后部分胰島細胞可以自我修復，恢復正常分泌功能這可能會影響到涉及免疫耐受性的移植實驗結果[18]。有報道提到誘導的糖尿病模型中各臟器中p450同工酶有所變化，因此涉及該方面的研究應謹慎選擇[19]。

糖尿病炎癥學說認為血清中炎癥因子的含量可以預測2型糖尿病的發生[20, 21]，本實驗所得關于促炎癥因子的含量的結果，基本符合該學說。與正常對照組相比，誘發模型組在造模成功時炎癥因子(INF-γ，TNF-α，IL-18，IL-1β)都有明顯上升，與以前的報道一致[22]。有研究表明臟器中代謝異常脂質的堆積能促進促炎癥因子的高表達[23]。本實驗初步驗證了糖尿病的炎癥學說。

作為兩種常用的T2DM動物模型，誘發模型價格低廉，但存在模型保存時間短，易退變，個體差異大的缺點；自發性動物模型穩定，能保持長時間的高血糖癥狀和高胰島素血癥狀，但不能完全模擬人類T2DM發生過程。本研究為糖尿病發病機理的研究提供寶貴參考。

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Comparison of spontaneous type 2 diabetes mice with induced diabetes mice

NI Cheng-pei, WANG Jing-yi, SHEN Yan-hua, ZHOU Hui-ying, ZHOU Zheng-yu*

(Laboratory Animal Center of Soochow University, Suzhou 215123，China)

ObjectiveTo investigate biological parameters and morphology in spontaneous type 2 diabetes C57BL /KsJ-db / db mice and mice with type 2 diabetes mellitus which induced by high-fat diet and streptozotocin injections. MethodsC57BL/6J mice were divided randomly into normal control group, Induced Group, and Spontaneous Group with 10 mice in each group; Induced Group : The 11 weeks old C57BL/6J mice were fed on a high-fat diet before intraperitoneal injections of STZ; Spontaneous Group: 8 weeks old C57BL /KsJ- db/db mice (db/db); The body weight, Fasting blood glucose (FBG), oral glucose tolerance test (OGTT) was detected every week for 28 days. FINS, AUC, IR index and pro- inflammation factors (TNF-α, IL-18, IL-1β, INF-γ) were evaluated in the beginning and 8thweek. At the end of experiment, the mice were sacrificed for organ and morphological study. ResultsThe weight of Spontaneous Group were higher than Induced Group, both of them are higher than normal group significantly; Non-fasting blood glucose concentrations of Spontaneous Group mice were higher over Induced Group; In 8thweek the abnormal glucose levels of Spontaneous Group extraordinary stability, however, in Induced Group drops obviously;the FINS was increased in Spontaneous Group, but have no significantly change in Induced Group,both AUC and HOMA-IR index Show a significant downtrend in Induced Group, However, in Spontaneous Group, the rising trend of AUC and HOMA-IR are stabe; The content of the pro-inflammatory factor (TNF-α, IL-18, IL-1β, INF-γ) in both diabetes animal are more than normal group. In 8th week the content of pro-inflammatory factor was decreased in Induced Group, but increased in Spontaneous Group significantly; Pathologic results showed that pancreas, kidney, liver, muscle, and testis, appeared serious inflammatory pathological deterioration in two kinds of diabetes models mice. ConclusionsDuring 8weeks the Spontaneous diabetes animal showed abnormal glucose metabolism, and high concentration of pro-inflammatory cytokines which Symptoms of type 2 diabetes become more and more serious.; glucose metabolism and inflammation showed improved in induced animal model.

Type 2 diabetes; Mouse model; Pro-inflammation factors

江蘇省自然科學基金(BK20151217)。

倪程佩(1991-)，女，研究生，研究方向：人類疾病動物模型與比較醫學。E-mail: nichengpe@sina.com。

周正宇(1973-)，男，碩士生導師，研究方向：人類疾病動物模型與比較醫學。E-mail: zacharyzhou@suda.edu.cn。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0036-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.007

2016-03-29