不同產地昆侖雪菊抗氧化活性比較研究

杜鵑，吳津蓉，吳忠紅

（1.新疆農業職業技術學院食品工程學院，新疆昌吉831100；2.新疆農業科學院農產品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

不同產地昆侖雪菊抗氧化活性比較研究

杜鵑1，吳津蓉1，吳忠紅2

（1.新疆農業職業技術學院食品工程學院，新疆昌吉831100；2.新疆農業科學院農產品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

采用化學發光法比較不同產地昆侖雪菊水提物的體外抗氧化活性，結果表明，3種不同產地、海拔的雪菊水提物均能有效地清除O2-·、HO·和H2O2，只是對不同的自由基清除效果不同。和田高原雪菊對O2-·、HO·的清除效果都是好的，達坂城平原雪菊對H2O2的清除效果最好，田高高原雪菊和喀什高原雪菊對HO·的清除效果都優于維生素C，不同產地、海拔雪菊中黃酮含量與O2-·、HO·的清除率之間相關性良好。

不同產地；雪菊；抗氧化性

雪菊［1-2］是生長海拔3200米以上的雪山之隅及喀喇昆侖山脈的野生蛇目菊，所以又稱昆侖雪菊、天山雪菊，其花期極短，產量稀少，是目前新疆惟一與雪蓮齊名，具有獨特功效的稀有高寒植物。長期以來，昆侖雪菊被新疆和田當地居民當花茶飲用，有燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒的功效。近年來，雪菊以其卓越的降血壓、降血脂功能，成為茶界新寵，身價暴增，目前在新疆和田、喀什、達坂城開始產業化種植。雪菊中含有豐富的黃酮類化合物［3-4］，研究表明，黃酮類化合物也是一類天然強抗氧化劑，其中很多黃酮類化合物的抗氧化活性甚至大于維生素E。化學發光法具有靈敏度高、檢測限低、線性范圍寬等特點，常用于抗氧化活性的測定，而且儀器操作快捷簡便，便于自動化分析［5］。本試驗分別以生長在不同產地、不同海拔高度的3種昆侖雪菊為研究對象，采用化學發光法比較不同產地昆侖雪菊水提物的體外抗氧化活性，以期為雪菊花茶的深入研究及新疆雪菊資源的綜合開發利用提供基礎。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

材料：采自3個不同地點的昆侖雪菊樣品分別為新疆和田皮山縣克里陽高原雪菊（生長海拔3 200 m左右）、新疆喀什高原雪菊（生長海拔2 000 m左右）、新疆達坂城平原雪菊（生長海拔1 000 m左右）。50℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，儲藏備用。

魯米諾（色譜純）：Sigma公司；蘆丁標準品（色譜純）：上海金穗生物有限公司；乙醇、鐵氰化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、沒食子酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、抗壞血酸均為分析純；檢測用水為重蒸水。

MPI-A型多參數化學發光分析測試系統：西安瑞邁分析儀器有限公司；FA2004電子天平：上海儀器天平廠；722型可見分光光度計：上海光譜儀器分析有限公司；KS-300EⅡ型超聲波清洗機：寧波海曙科生超聲設備有限公司；Edw ards Pirani 1001冷凍干燥器（U. K.）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；粉碎機：浙江省瑞安市春海藥材器械廠；RE-52旋轉蒸發儀：上海青浦滬西儀器廠。

1.2方法

1.2.1雪菊供試樣品溶液的制備

采用超聲波提取法［6-7］，將3種雪菊樣品粉碎，過60目篩，分別稱取干燥的昆侖雪菊粉各5 g，加95%乙醇50 mL，于超聲波清洗機中提取10 min，趁熱減壓抽濾，用80%乙醇定容至100 mL，搖勻后再稀釋5倍即得樣品溶液。

1.2.2雪菊水提物化學成分的測定

1.2.2.1雪菊總黃酮含量的測定

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品105.8 mg，置100mL容量瓶中，用少量甲醇加熱溶解，冷卻后甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.058 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別精密吸取上述蘆丁標準液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于25 mL的比色管中，加入1.5%AlCl38 mL和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH 5.5）4 mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h。以不加蘆丁為空白，在415 nm波長下測定吸光度，以吸光度值為縱坐標，以顯色液中蘆丁的濃度為橫坐標，用最小二乘法進行回歸，線性方程為A= 0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 4。結果表明，蘆丁標準品溶液在濃度為15.3 μg/mL～59.75 μg/mL范圍內濃度與吸光度的線性關系良好。采用AlCl3分光光度比色法［8-10］。取1.0 mL樣品溶液于10 mL容量瓶，以不加樣品的溶液做空白，以上述的條件測定吸光度，參照標準曲線計算濃度，平行測定3次，取平均值。

1.2.2.2雪菊提取物中的總酚測定

采用Folin酚法［11］測定雪菊總酚含量，沒食子酸為標準品，760 nm處測定樣品的吸光度值，以樣品濃度為橫坐標x，吸光度值為縱坐標y，繪制標準曲線，線性回歸方程為：y=15.49x+0.000 1，R=0.999。

圖1　AlCl3法蘆丁標準曲線Fig.1AlCl3method of rutin standard curve

1.2.3化學發光法檢測雪菊樣品的抗氧化性

1.2.3.1雪菊提取物對超氧化陰離子（O2-·）清除測定

鄰苯三酚一魯米諾化學發光法［12］測定雪菊提取物對超氧陰離子O2-·的清除能力。將3種不同產地的雪菊樣品分別配制成不同的濃度梯度（5、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL）的溶液，用不同濃度的抗壞血酸溶液為陽性對照，以水為空白。在反應池中加入0.2 mmol/L的魯米諾溶液4、0.5mL樣品（或空白）溶液和10mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，快速混勻，迅速置于發光儀測定室中，啟動反應，測定180 s，每3 s的發光強度為I，用蒸餾水作空白，測其I0，計算樣品液對O2-·的清除率（%）。以清除率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪出曲線，根據擬合方程計算清除率50%時的濃度IC50，即半抑制濃度，IC50值越大，樣品清除超氧陰離子O2-·自由基的能力越弱。

1.2.3.2雪菊提取物對羥基自由基（HO·）的清除測定

Fe2+一雙氧水一魯米諾化學發光法［13］測定雪菊樣品對羥基自由基HO·的清除能力。將3種不同產地的昆侖雪菊水提物分別配制成不同的濃度梯度，用不同濃度的抗壞血酸溶液為陽性對照，以蒸餾水為空白。在反應池中加入0.2 mmol/L魯米諾溶液4 mL，樣品（或空白）溶液0.5 mL，0.5 mmol/L Fe2+-EDTA0.2 mL，0.6%的雙氧水溶液0.2 mL，快速混勻，迅速置于發光儀測定室中，啟動反應，連續測定180 s，每隔3 s記錄發光強度，至出現峰值，記錄發光強度I，用蒸餾水作空白記錄I0，以清除率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪制曲線，計算IC50值。

1.2.3.3雪菊提取物對雙氧水H2O2的清除測定

雙氧水一魯米諾-碳酸緩沖液體系測定雪菊樣品對雙氧水的清除能力。將3種不同產地的雪菊花水提物配分別配制成不同的濃度梯度，陽性對照為不同濃度的抗壞血酸溶液，以水為空白。在反應池中加入樣品（或空白）溶液0.5 mL，0.4 mmol/L魯米諾溶液和pH9.0的0.08 mol/L NaCO3-NaHCO3緩沖混合溶液，迅速混勻，立即置于發光儀測定室中，啟動反應，連續測定180 s，每隔3 s記錄發光強度，至出現峰值，記錄發光強度I，用蒸餾水作空白記錄I0，以清除率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪制曲線，計算IC50值。

1.2.4數據統計分析

試驗測試條件為：高壓600 V，測試波長范圍為200 nm～700 nm，采集速度0.1 ms，測試溫度30℃，曲線的積分面積為相對發光強度，采用Origin 7.0軟件進行數據統計，計算清除率用如下公式：

式中：I0表示不加樣品時的空白發光強度，cd；I表示加入雪菊提取物樣品時的發光強度，cd。

2結果與分析

2.1化學發光法檢測雪菊樣品的抗氧化性

2.1.1雪菊提取物對超氧化陰離子（O2-·）清除測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化可以產生超氧陰離子，魯米諾是發光劑，超氧陰離子能激發魯米諾，使魯米諾由激發態返回基態產生化學發光。加入黃酮樣品后，黃酮類結構中含有酚羥基，能提供活潑氫，可阻斷自由基反應，抑制其化學發光。不同產地的雪菊水提物對O2-·的清除效果可見圖2。

圖2　雪菊提取物對超氧化陰離子（O2-·）清除能力比較Fig.2Comparison of the removal ability of the superoxide anion（·）in the snow chrysanthemum

3種雪菊黃酮化合物對O2-·均有清除作用，且隨其雪菊提取物質量濃度的增大，清除效果逐漸增大，3種雪菊黃酮化合物清除率變化趨勢相似，清除效果基本相當，在濃度范圍0.125 mg/mL～0.5 mg/mL時，喀什高原雪菊黃酮提取物O2-·清除效果最好，在濃度范圍1 mg/mL～5 mg/mL時，和田高原雪菊黃酮提取物O2-·清除效果最好。

2.1.2雪菊提取物對羥基自由基（HO·）的清除測定

硫酸亞鐵一魯米諾一雙氧水化學發光體系中，Fe2+還原H2O2生成羥基自由基HO·，魯米諾作為發光劑可以與HO·反應，產生化學發光，其發光強度與HO·在一定強度范圍內呈線性關系，但黃酮和多酚類物質可將Fe2+氧化為Fe3+，阻斷了該體系的反應，抑制化學發光。不同產地的雪菊水提物對HO·的清除效果可見圖3。

圖3雪菊提取物對羥基自由基（HO·）清除能力比較Fig.3Comparison of scavenging capacity of hydroxyl radical（HO·）with snow chrysanthemum

圖3顯示，濃度為0.125 mg/mL～1 mg/mL范圍內，3種雪菊提取物對羥自由基的清除作用均有明顯增強，清除作用和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達坂城平原雪菊，其中當濃度為1 mg/mL時，和田高原雪菊的清除率可以高達81.35%。但是當濃度達到1 mg/mL之后，隨濃度升高，3種雪菊對羥自由基清除率較為穩定，變化不大。

2.1.3雪菊提取物對雙氧水H2O2的清除測定

H2O2在有氧和堿性條件下能氧化魯米諾，可產生化學發光，發光強度的降低可以反映抗氧化物對過氧化物產生的抑制能力。不同產地的雪菊黃酮提取物對H2O2的清除效果如圖4。

圖4　雪菊黃酮提取物對H2O2除能力比較Fig.4Comparison of H2O2scavenging ability of extracts of snow chrysanthemum

3種雪菊黃酮提取物對H2O2的清除效果均隨其質量濃度的增大而增大的趨勢，呈良好的線性關系。濃度為0～0.15 mg/mL范圍內，隨濃度增加，清除率快速增大，當濃度大于0.5 mg/mL時，清除率隨濃度增加而增速變緩，3種雪菊對H2O2的清除效果為：達坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊。

2.2雪菊提取物的抗氧化性與總酚、總黃酮含量的相關性分析

計算不同品種玫瑰花提取物對3種自由基清除率達50%時的樣品濃度IC50及提取物中總酚、總黃酮的含量，結果如表1所示。

表1　不同產地的雪菊提取物的IC50及其總酚、總黃酮含量Table 1 IC50and total phenol and total flavonoids content of the extracts from different habitats of the chrysanthemum

3種雪菊對O2-·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達坂城平原雪菊，對HO·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達坂城平原雪菊，對H2O2的清除效果依次為：達坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊，可見不同產地、海拔的雪菊水提物對不同的自由基清除效果不同，與抗氧化物質維生素C相比，3種雪菊對O2-·和H2O2的清除效果均不如維生素C，但喀什高原雪菊和和田高原雪菊對HO·的清除效果優于維生素C，清除能力很強。

對雪菊提取物清除3種自由基的IC50與總酚、總黃酮含量做相關性分析，總黃酮含量與清除O2-·和HO·的IC50之間、總酚含量與清除H2O2的IC50之間呈負相關，即總黃酮含量對O2-·和HO·的清除能力呈正相關性，總酚含量對清除H2O2能力呈正相關性。多酚和黃酮類成分在3種雪菊水提物抗氧化活性中都能起作用，但是黃酮和多酚含量對清除不同自由基的效果有差異，其中總黃酮含量與O2-·和HO·的清除率之間相關性良好。有資料報導，多酚和黃酮類物質的抗氧化能力與其母核上“-OH”基團數目有關，母核上“-OH”基團數目越多，提供氫質子能力越強，抗氧化能力越強。當“-OH”基團數相同，且所在位置也相同，但C環結構不同，抗氧化能力也不同。Velioglu［14］等比較了28種植物材料的抗氧化活性與酚類物質含量的相關性，結果表明兩者沒有明顯相關性。研究還認為除黃酮以外的其它物質，在抗氧化方面也起一定作用。新疆不同海拔地區生長的3種不同品種的雪菊，其黃酮和多酚的含量不同，同時雪菊水提物中還存在維生素C、綠原酸類等其他活性成分，同時具有清除自由基的能力，可見雪菊的抗氧化活性是多物質抗氧化活性的集合。同時，在對雪菊進行開發利用時，可有針對性的選擇某方面抗氧化能力有優勢的不同產地雪菊為原料，開發多種具有功能活性，抗氧化能力強的特色雪菊產品。本研究為雪菊的深加工，及在食品、保健品、醫藥中的應用奠定研究基礎。

3結論

不同產地、海拔的雪菊水提物對不同的自由基清除效果不同，喀什高原雪菊和和田高原雪菊對HO·的清除效果優于維生素C，3種雪菊對O2-·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達坂城平原雪菊，對HO·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達坂城平原雪菊，對H2O2的清除效果依次為：達坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊，總酚含量與清除H2O2的能力有一定相關性，總黃酮含量與O2-·和HO·的清除率之間相關性較好。

［1］國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：維吾爾藥卷［M］.上海科學技術出版社，2005：992

［2］江蘇省植物研究所，中國醫學科學院藥物研究所.新華本草綱要［M］.上海科學技術出版社，1990

［3］王艷，張彥麗，阿依吐倫·斯馬義.分光光度法測定新疆昆侖雪菊中總黃酮的含量［J］.新疆醫科大學學報，2011，34（8）：817-819

［4］宋琳琳，羅樂，武鵬飛.超聲波法對菊花中總黃酮提取工藝的優化［J］.貴州農業科學，2010，38（10）：188-192

［5］李莉，顏杰，張承紅.超聲-微波協同萃取桑葉總黃酮的工藝研究［J］.安徽農業科學，2010，38（17）：9208-9210

［6］岳慶磊，郭效杰，羅宗銘，等.黃酮類化合物抗氧化機理及其在醫藥中的應用［J］.廣州化工，2003，31（2）：10-12

［7］文鏡，劉璇，趙建.熒光法及化學發光法在保健食品抗氧化體外實驗中的應用［J］.中國釀造，2009（11）：130-133

［8］Stah E，Schorn J.Flavonoids on polia mide chromatography［J］.Physiology chemistry，2010，263（5）：324-326

［9］鄒文靜，劉程程，方天艷，等.5種黔產藥食兩用植物總黃酮、多酚及多糖的含量測定［J］.安徽農業科學，2014（7）：1929-1930，1999

［10］張海軍，郭麗，王明澤，等.HPLC法測定擬南芥中總黃酮含量的研究［J］.黑龍江農業科學，2014（4）：97-100

［11］郭興峰，傅茂潤，杜金華，等．不同干燥方法對荷花花瓣抗氧化活性和化學成分的影響［J］．食品與發酵工業，2010，36（2）：146-149

［12］李培培，戚向陽，羅彤，等.化學發光法研究不同楊梅黃酮提取物的抗氧化活性［J］.中國食品學報，2011，11（7）：190-194

［13］崔莉，朱榮華，王曉，等.化學發光法研究不同品種玫瑰花的抗氧化活性［J］.中國食品添加劑，2013（6）：87-91

［14］Velioglu Y S，Mazza G，Gao L，et al．Antioxidant activity and total phenolicsin selected fruits，vegetables and grain products［J］.J Agric Food Chem，1998，46：4113-4117

Comparative Study on Antioxidant Activity of the Different Habitats of Kunlun Snow Chrysanthemum

DU Juan1，WU Jin-rong1，WU Zhong-hong2
（1.Institute of Science Food，Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，Xinjiang，China）

The antioxidant capacity of three kinds different origin Kunlun snow Chrysanthemum was investigated by chemiluminescence.Scavenging abilities in vitro on O2-·，HO·and H2O2were determined by three chemiluminescence systems.The results showed that the chrysanthemum extracts had good scavenging activity on O2-·，HO·and H2O2，but different samples had diferent antioxidative activity and it was related to its components.Hetian Plateau snow chrysanthemum on O2-·，HO·scavenging effect was good，the best removal effect of plain of Dabancheng chrysanthemum on H2O2，scavenging effect of Hetian high plateau and Kashi Plateau snow chrysanthemum on HO·were better than that of vitamin C.In different places，at an altitude of snow chrysanthemum between flavonoids and O2-·，HO·clearance rate，good correlation.

differentareas；snowchrysanthemum；antioxidantcapacity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.004

2015-11-10

新疆維吾爾自治區高校科研計劃項目（No.XJEDU2013S52）

杜鵑（1978—），女（漢），副教授，碩士，從事食品加工教學及研究工作。