氣升式發酵產細菌纖維素的中試實驗研究

許云華，馬波，，張衡，梁光蕓

（1.連云港師范高等?？茖W校生命科學系，江蘇連云港222006；2.南京理工大學化學生物功能材料研究所，江蘇南京210094）

氣升式發酵產細菌纖維素的中試實驗研究

許云華1，馬波1，2，張衡2，梁光蕓2

（1.連云港師范高等?？茖W校生命科學系，江蘇連云港222006；2.南京理工大學化學生物功能材料研究所，江蘇南京210094）

細菌纖維素的氣升式發酵相對于機械攪拌式發酵具有低剪切力、運行成本低、周期短等優勢，其中試深層發酵試驗研究是其工業化生產的必經階段，有著極為重要的研究價值和意義。利用實驗室20L-100 L-1 000 L氣升式發酵罐系統對細菌纖維素進行中試試驗，測定了葡糖桿菌在100 L種子罐中的對數生長期曲線，研究恒定通風量和逐級增加通風量對1000L氣升式發酵產細菌纖維素的影響，采用流加碳源葡萄糖的方法維持發酵中后期的碳源濃度、提高纖維素產量。在種子生長曲線對數期的后期（42 h）菌體濃度達到2×108CFU/mL，逐級增加通風量比恒定通風量時的發酵周期縮短了12h，菌體濃度增加了37%，細菌纖維素終產量提高到2.7g/L，流加碳源葡萄糖后的纖維素產量相對于未流加時提高了21.7%。

細菌纖維素；中試研究；氣升式發酵；發酵周期

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）具有超細［1］、純度高［2］、力學強度大［3］、生物相容性好［4-5］等特性，已成功應用于食品［6-7］、造紙［8-9］、組織工程［10］、醫用敷料［11-12］等行業。近年來，細菌纖維素的瓶頸——規?；a，受到了廣泛關注［13］。目前，較成熟的BC生產方式為靜態淺盤培養，如在我國海南省等地有較多相關靜態發酵產業化案例，但該方式存在發酵周期長、占地面積大、產品應范圍受限等缺點［13］；而采用生物反應器好氧深層發酵的動態方式發酵產細菌纖維素因供氧充足利于菌體生長、發酵周期短、生產效率高和產品更易加工處理等優點，受到廣泛重視［13］。就較大規模的動態發酵而言，所用的生物反應器主要有兩種形式：機械攪拌式和氣升式發酵罐。用機械攪拌式發酵罐大規模生產細菌纖維素常常會遇到許多問題，如會自發出現Cel-突變株，使得纖維素產量下降［14］；渦流的存在會對纖維素的聚合及結晶產生不良影響，從而導致多糖的產量下降。

同機械攪拌式發酵罐相比，氣升式發酵罐由于無機械攪拌而大幅降低了剪切力對菌體細胞和產物的影響［14］，對細胞產BC更為有利；其次，從發酵能耗方面比較，氣升式發酵罐由于無需機械攪拌而節省生產成本20%以上，特別是規?；糯笊a后，其綜合效益將更優；從生產工藝上比較，氣升式發酵產BC的工藝更簡單，省去了摸索不同攪拌葉片形式和攪拌轉速等試驗周期；從設備方面比較，氣升式發酵罐更易于加工和維護、避開了機械攪拌罐軸封常出現的密封不嚴實及導致的染菌等問題。

目前，國內有關細菌纖維素發酵研究主要包括：菌種優化、碳源和氮源、配方與工藝條件、小型機械攪拌和氣升式發酵罐等方面。首先，獲得高產而穩定的菌種是實現規模化工業化生產的首要任務，在產纖維素菌種方面，已報道的有葡糖醋酸菌屬、醋酸桿菌屬等十幾個屬［15-18］，其中木醋桿菌是目前研究最多且產纖維能力最強的菌種［19］。通過基因工程法改良菌種，也可大幅提高菌株產纖維素能力。如Setyawati等［20］將Vitreoscilla hemoglobin（VHb）在木醋桿菌中表達，可將靜態發酵纖維素產量提高70%。在碳源、氮源及配方工藝條件方面，國內外的研究者進行了大量的實驗研究［21-23］。近幾年國內相關研究者更加關注采用腐爛水果、大豆糖蜜等廉價農副產品作為碳源、氮源等進行BC發酵研究［24-27］，嘗試降低其生產成本。

目前，在國內外文獻中有較多小型發酵罐（50 L及以下）產BC的研究報道［28-30］，如Song等［31］采用了一種小型的球形氣升式生物反應器（10 L）進行BC發酵，該生物反應器具有低剪切力、高溶氧和促進代謝產物BC積累的作用，其BC最高產量超過5 g/L，遠高于機械攪拌式發酵罐的BC產量。雖然在BC的小型氣升式發酵罐方面取得了一定的研究進展，卻少有BC的氣升式發酵中試研究（100 L及以上）相關報道，而中試級別氣升式生物反應器產BC的試驗研究對商業化生產極其重要，必須進行相關中試試驗研究，才能確定氣升式發酵工藝是否適用于工業生產，同時對優化生產工藝、降低生產成本、提高BC產量具有重要的研究價值。本文采用實驗室已有的20 L-100L-1000 L氣升式發酵罐系統，對實驗室選育的葡糖桿菌RZS01（Komagataeibacter nataicola RZS01）氣升式深層發酵產纖維素進行了中試發酵研究，對推動我國細菌纖維素氣升式工業發酵生產具有重要意義。

1材料與方法

1.1主要材料和儀器

菌種：由南京理工大學化學生物功能材料研究所篩選，經16S rDNA基因測序鑒定為葡糖醋桿菌RZS01（Komagataeibacter nataicola RZS01），并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京），保藏編號為CGMCC 10961。

斜面培養基［32］：葡萄糖20 g/L，蔗糖10 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，檸檬酸1.1 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂18 g/L，酵母粉1 g/L，pH6.0；

種子培養基［32］：葡萄糖20 g/L，硫酸銨6 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉2.25 g/L，羧甲基纖維素鈉0.4 g/L，自然pH；

發酵培養基［32］：葡萄糖22.5 g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀5g/L，硫酸鎂0.7g/L，蔗糖27.5 g/L，乳酸鈣0.2 g/L，檸檬酸0.6g/L，蛋白胨10 g/L，醋酸1.5 mL/L，酵母粉7.5 g/L，羧甲基纖維素鈉0.4 g/L，pH6.0。

上述原料中，在斜面及搖瓶實驗中采用分析純，在20 L、100 L及1 000 L種子或發酵罐中采用食品級原料。

FZ-D型20 L機械攪拌式發酵罐、100 L氣升式種子罐、1000 L氣升式發酵罐：江蘇豐澤生物工程設備有限公司；QHZ-98A恒溫振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；Inpro3030 pH電極：METTLER TOLED0；Inpro6800溶氧電極：METTLER TOLED0；LWD300-38LT顯微鏡：上海測維光電技術有限公司；CELL-VUCBC DRM-700細胞計數板：南京裕安儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華化器制造有限公司；DHG-9035A干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1試驗方法

1.2.1.1中試發酵基本工藝流程

活化菌種→搖瓶種子培養（（30±1）℃，160 r/min）→20 L種子罐中種子培養（（30±1）℃）→100 L氣升罐種子擴培（（30±1）℃）→1 000 L氣升罐發酵（（30±1）℃→動態BC后處理→保存或進行實驗研究。

在上述氣升罐發酵工藝流程中，可依據試驗工藝選擇不同的通風量或工藝進行BC的動態深層發酵試驗。

1.2.1.220L種子罐中種子培養與工藝試驗

按種子培養基組成配制10 L種子液（先定容至8 L，實消時會產生約2 L的蒸汽冷凝水），調pH值至6.0，按0.03%比例加消泡劑（江蘇賽歐），加至20 L種子罐中進行實消（121℃，20 min）。冷卻至30℃后，火焰保護下，以8%接種量接種搖床中培養好的種子。采用20 L機械攪拌種子罐在種子培養時的試驗工藝參數主要有：液氣比為1 L：0.25 L/min（通氣量為0.16 m3/h），轉速為300 r/min，培養溫度為30℃，罐壓為0.08 MPa。在此條件下，進行了葡糖桿菌的種子培養。培養過程中測定的參數主要有：還原糖濃度、pH值、溶解氧濃度（DO）和菌體濃度。

主要研究常規工藝或條件下，20 L種子罐中還原糖、pH、DO和菌濃的變化，確定移種基本工藝條件或參數。

1.2.1.3100L種子罐中種子培養與工藝試驗

按種子培養基組成配制70 L種子液，調pH值至6.0，按0.03%的比例加消泡劑，加至100 L氣升式種子罐中實消，移種管道通蒸汽滅菌。冷卻后，以8%接種量移種。主要培養條件為：液氣比為1∶0.25（通氣量為1.2 m3/h），培養溫度為30℃，罐壓為0.08 MPa。在此條件下進行種子擴培。過程中測定參數主要有：還原糖濃度、pH值、DO和菌體濃度。

1.2.1.41000 L氣升罐發酵與通風量工藝試驗

為模擬大試生產工藝，采用三級種子發酵中試試驗。其中一級種子在恒溫振蕩培養箱中培養，培養條件為30℃、160 r/min；二級種子在20 L種子罐中培養，接種比例為8%；三級種子在100 L氣升式種子罐中培養，移種比例為8%。

1 000 L氣升式發酵罐的裝液量為700 L，pH、DO、溫度為在線監測控制。主要試驗在通風量恒定（19 m3/h）和通風量逐級增大（14.4 m3/h～24.1 m3/h）的情況下對BC動態發酵的影響。同時，為保證各批次發酵罐發酵BC過程參數、工藝的一致性，設定了1 000 L氣升式發酵罐的發酵條件：培養溫度為30℃、罐壓為0.08 MPa。其它主要測定的參數有：菌濃、還原糖、BC產量等。

1.2.1.51000 L氣升式發酵過程中流加碳源對產BC的影響試驗

在以1000 L氣升式發酵罐進行中試試驗過程中，隨著發酵液中碳源葡萄糖的消耗，還原糖濃度逐漸降低至1.5%時，進行葡萄糖的流加，并保持還原糖濃度在（1.5±0.1）%左右。流加24 h后結束流加，至還原糖降至最低時停止發酵。實驗過程中其它工藝參數為：培養溫度為30℃、罐壓為0.08 MPa。其它主要測定的參數有：pH值、菌濃、還原糖、DO、BC產量等。

1.2.2檢測方法

還原糖測定［32］：采用工業測糖法進行測定。

pH值、DO測定：均采用在線實時檢測，其中DO校準時，以大氣中含氧量標定為100%，以實消過程中121℃、0.1 MPa條件下標定為0。

菌濃測定［32］：采用血球計數板在光學顯微鏡下進行細胞計數，計數前按需要將發酵液稀釋一定的倍數。

BC產量測定［32］：依據試驗需要按一定的發酵周期進行取樣，在發酵罐取樣口遵循無菌取樣操作每次取100 mL發酵液。過濾除去培養液，收集絮狀BC并分散在含0.3%NaOH和0.3%H2O2的水溶液中，于80℃水浴鍋中處理2 h～4 h。用自來水沖洗至中性后，將BC放置于80℃的普通干燥箱中過夜（12 h），計算每升培養液中所含有的BC干重即為BC產率。

2結果與討論

2.1100L種子罐相關工藝、參數研究

為研究葡糖醋桿菌種子在100 L種子罐中的生長對數期表現與還原糖、菌體濃度等參數變化，詳細測定或監測了種子培養過程中還原糖、pH值、DO和葡糖醋桿菌細胞濃度（菌體濃度）的變化情況，結果見圖1。

圖1　100L種子罐培養過程中各參數的變化情況Fig.1Process parameters curves during the seed culture process in 100 L fermentor

如圖1中所示，可以發現在100 L種子罐的種子液培養過程中，前12 h中葡糖醋桿菌細胞濃度（菌體濃度）變化不大，大約在1.5×107CFU/mL左右，為明顯的細胞生長曲線延滯期；在12 h～42 h期間，菌體濃度迅速增加到接近2×108CFU/mL，為葡糖醋桿菌的對數生長期，在該階段中種子液的還原糖、pH值和DO均大幅下降，其中還原糖濃度降低了0.55%、pH值降低了0.31、DO下降了約25%；依據本實驗室前期研究結果［32］，在葡糖醋桿菌種子液的細胞濃度接近或達到2×108CFU/mL時較適宜移種。

2.21000 L氣升式發酵罐通風量試驗

圖2是在保持1 000 L氣升式發酵罐的通風量恒定時，菌體濃度、產量等參數的變化曲線。

圖2　1000 L氣升式發酵罐恒定通風量發酵培養過程中各參數的變化情況Fig.2BC fermentation experimental curves under constant ventilation in 1 000 L air lift fermentor

在發酵周期前25 h，發酵液的pH、DO和還原糖含量均較快幅度下降，而細胞菌體濃度和BC產量開始上升，表明葡糖醋桿菌細胞開始增殖并產生次級代謝產物細菌纖維素；發酵第25 h～33 h后還原糖含量略有反彈情況發生，而pH、DO則維持下降趨勢，BC產量持續增加，其原因可能是發酵液pH降低后導致少量蔗糖發生水解反應；發酵33 h后發酵液的還原糖、pH和DO同時進入快速下降階段，BC產量大幅提升至2 g/L左右，菌體濃度快速增加到1.25×108CFU/mL；在發酵進行至60 h時，pH、還原糖和DO降低不明顯，產量和細胞菌體濃度增加較緩慢；在發酵周期達到72h～76 h時，發現細胞菌體濃度開始出現下降趨勢，表明可能有部分細胞開始自溶。最終1 000 L氣升式發酵罐的BC中試試驗產量為2.3 g/L。在產物形態方面，同機械攪拌發酵罐相比，氣升罐動態發酵得到的細菌纖維素更細，且有較多長絲狀纖維生成，部分纖維絲帶之間纏結形成小球狀，表明不同發酵方式對產品纖維的形態產生了影響。

在BC氣升式發酵罐的發酵過程中，通風量恒定情況下，發酵中后期的發酵液中溶解氧相對含量出現大幅下降，從而可能會導致葡糖醋桿菌增殖和次級代謝產物BC的生成速率下降。實驗中，采取分段逐級增加通風量以克服代謝副產物增多導致的粘度過大、溶氧降低和傳質效率下降的問題。

圖3　1000 L氣升式發酵罐逐級加大通風量發酵培養過程中各參數的變化情況Fig.3BC fermentation experimental curves under enhancive ventilation step by step in 1 000 L air lift fermentor

如圖3所示，1 000 L氣升式發酵罐的通風量從初始階段（0～24 h）的14 m3/h，增加到發酵中期（24 h～48 h）的19 m3/h和發酵后期（48 h～64 h）的24 m3/h；其相應發酵液中的DO值隨著發酵周期的延長而降低，但下降的幅度明顯降低，試驗中的DO值始終維持在35%以上。最終的發酵周期僅為64 h，菌體濃度達到1.72×108CFU/mL，BC終產量為2.7 g/L。相對于恒定通風量實驗，逐級增加通風量實驗的發酵周期縮短了12 h，菌體濃度增加了37%，而次級代謝產物BC終產量提高了17.4%，表明在氣升式發酵罐中進行BC的中試發酵試驗時根據發酵不同階段逐級提高通風量是一種有效的策略，對縮短發酵周期、降低發酵成本、提高菌體濃度和代謝產物BC的產量均有明顯的促進作用。2.31 000 L氣升式發酵罐流加碳源試驗

采用流加碳源、補酸或補堿等提高代謝產物產量的方法是一種發酵工程中較常用的策略。葡糖醋桿菌細胞合成細菌纖維素的底物為葡萄糖，在分批式發酵中，隨著底物葡萄糖的耗盡，發酵達到終點。本試驗中，對1 000 L氣升式發酵罐進行流加葡萄糖的試驗結果見圖4。

圖4　1000 L氣升式發酵罐發酵培養過程中流加葡萄糖與各參數的變化情況Fig.4BC fed batch of glucose and fermentation experimental curves in 1 000 L air lift fermentor

流加葡萄糖的過程從發酵周期第40 h到72 h，葡萄糖濃度保持在1.5%左右。在流加碳源葡萄糖的過程中，發酵液DO從60%下降至20%，BC產量從0.8 g/L增加至2.2 g/L。同時，圖4中明顯出現一個值得探討和研究的現象，流加過程中，發現發酵液的pH值由4.5逐漸升高至5.7左右，可能是由于發酵液中代謝產生的副產物葡萄糖酸等在降低。而流加葡萄糖結束后，發酵液pH值隨著葡萄糖濃度的降低開始迅速下降。通過本次流加試驗，經分離、提純后的代謝產物BC終產量為2.8g/L。相對于未采用流加發酵（恒定通風量試驗）的1 000 L氣升罐發酵BC終產量提高約21.7%。

同機械攪拌發酵罐相比［33-36］，氣升式發酵罐的優點在于無攪拌、運行費用較少，發酵周期有所縮短，產生的剪切力較小，對葡糖醋桿菌細胞的變異影響較小，BC產量達到或超過機械攪拌式發酵；主要的缺點是由于罐體高徑比大，中試級別的氣升式發酵罐的底部清洗較困難。目前，本試驗中的氣升式發酵罐通過一個內筒實現發酵液的內循環，其主要問題是發酵液量無法進行改變，發酵液內循環系統需進一步改進。此外，應對氣升式發酵罐的發酵動力學進行深入的模擬和實驗研究［37-38］，有助于指導細菌纖維素動態深層發酵的中試研究和工業化生產。

3結論

采用1 000 L氣升式發酵罐研究了細菌纖維素的中試發酵工藝。氣升式發酵代謝產物細菌纖維素更細、絲狀纖維更長。在細菌纖維素動態深層發酵的不同時期逐級增大通風量可將BC產量提高到2.7 g/L，DO相對值保持在30%以上，發酵周期縮短至64 h，節省了運行成本。采用流加碳源葡萄糖發酵相對于未流加發酵的BC產量提高了21.7%。

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Airlift Fermentation Pilot Study of Bacterial Cellulose

XU Yun-hua1，MA Bo1，2，ZHANG Heng2，LIANG Guang-yun2
（1.Department of Life Sciences，Lianyungang Normal College，Lianyungang，222006，Jiangsu，China；2.Chemicobiology and Functional Materials Institute of Nanjing University of Science and Technology，Nanjing，210094，Jiangsu，China）

Compared with mechanical stirring fermentation，airlift fermentation method of bacterial cellulose possess low shear，low operation cost and short fermentation period.The pilot fermentation experiment of bacterial cellulose（BC）is a necessary stage for its industrial production.It has a very important value and significance.The pilot fermentation experiment were systematically researched using 20 L-100 L-1 000 L laboratory airlift fermentation system.The logarithmic growth phase curve of Komagataeibacter nataicola seeds at 100 L fermentor were determined.The effects of constant and enhanced ventilation step by step on 1 000 L airlift fermentation tank were studied.To maintain the level of carbon source，flowing carbon source glucose method were used during fermentation and cellulose production.The results showed that the bacteria concentration in the fermentation tank was more than 2×108CFU/mL in the late stage of logarithmic phase（42 h）.Compared with the constant ventilation in the airlift fermentation，the fermentation period was reduced by 12 h using the step by step increase ventilation.Also，the bacterial concentration was increased by 37%，and the final yield of bacterial cellulose was increased to 2.7 g/L.After adding carbon source glucose，the cellulose increased by 21.7% compared with current overtime.

bacterialcellulose；pilotstudy；airliftfermentation；fermentationperiod

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.018

2016-07-21

國家自然科學基金（51572124）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（16KJB180034）；江蘇省高等職業院校國內高級訪問學者計劃資助項目（2015FX032）

許云華（1968—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：微生物學。