恩諾沙星可視化凝膠柱快速免疫檢測方法研究

生威，吳雪寧，胡高爽，李詩潔，劉越，張燕，王碩

（教育部食品營養與安全重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

恩諾沙星可視化凝膠柱快速免疫檢測方法研究

生威，吳雪寧，胡高爽，李詩潔，劉越，張燕，王碩*

（教育部食品營養與安全重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

建立一種動物源性食品中獸藥恩諾沙星可視化凝膠柱快速免疫檢測新方法。采用活化酯法制備恩諾沙星與辣根過氧化氫酶（HRP）的偶聯物作為酶標抗原。整個檢測在一個標準的1 mL SPE固相萃取柱中進行，柱中包含兩層：一個結合了恩諾沙星特異性抗體的凝膠檢測層和一個結合了HRP抗體的凝膠質控層。將樣品提取液與酶標抗原預混合后加入到檢測柱中，基于抗原抗體的競爭結合反應和辣根過氧化物酶的酶促反應，根據檢測柱的檢測層顏色的深淺和有無來定性半定量檢測恩諾沙星的含量。該凝膠檢測柱的檢測限為5 μg/L，整個檢測過程可以在10 min內完成，豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉和牛奶等動物源性食品中恩諾沙星檢測限為100μg/kg。該方法具有準確、靈敏、特異性好、操作簡便快速、成本低等優勢，適合動物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查。

恩諾沙星；凝膠柱；可視化檢測

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）屬于喹諾酮類抗菌藥，作為廣譜抗菌藥，對支原體、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌等均具有抗菌作用。恩諾沙星在畜牧和水產養殖中應用廣泛，但是由于不科學地使用這類藥物導致其在動物源性食品中殘留，影響人類健康，使細菌的耐藥性增強，進而影響藥物在人類疾病治療中的作用。目前用于檢測動物源性食品中恩諾沙星殘留的方法主要有微生物法［1］、高效液相色譜法［2-3］、液相色譜-質譜聯用法［4-5］、毛細管電泳法［6-7］、免疫分析法［8-10］等。儀器分析法靈敏度高、準確性好，但檢測儀器昂貴、檢測步驟繁瑣，不適合快速檢測。免疫分析法特異性好、成本低、操作簡單快速、結果判斷容易，適合現場快速檢測，特別是酶聯免疫試劑盒［11-12］和膠體金試紙條［13］檢測方法已經在獸藥殘留檢測中得到了廣泛應用。本研究旨在建立一種新型可視化免疫層析凝膠檢測柱用于動物源性食品中恩諾沙星殘留的快速檢測。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

恩諾沙星等喹諾酮類獸藥：德國Dr公司；辣根過氧化物酶、過氧化氫脲、3，3，5，5－四甲基聯苯胺（TMB）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N’-二環已基碳二亞胺（DCC）、二甲基甲酰胺（DMF）、Tris、甘氨酸、Proclin 300抑菌素：美國Sigma公司；β-環糊精、二甲基亞砜（DMSO）：德國Merck公司；CNBr-Sepharose 4B溴化氰活化瓊脂糖凝膠：美國GE公司；HPR抗體：北京莊盟生物技術公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、鹽酸、檸檬酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

超純水系統：美國Millipore公司；分析天平-BL610：德國賽多利斯公司；周轉式振搖器-MS2：美國IKA公司；旋渦混合器-HQ-60：北方同正生物技術發展公司；燒結玻璃過濾器：天津盛博玻璃儀器有限公司；SPE柱（1 mL）、聚乙烯墊片、轉接頭：美國Agilent Technologies公司。

1.3主要溶液

偶聯緩沖液（pH 8.3）：NaHCO34.2 g，NaCl 14.6 g，雙蒸水定容500 mL，用1 mol/L的NaOH調節其pH到8.3，4℃保存備用。封閉緩沖液（pH 8.0）：0.3 g甘氨酸溶于20 mL偶聯緩沖液中。平衡淋洗液（pH 4.0）：CH3COOH 0.58 mL，NaCl 2.92 g，雙蒸水定容100 mL，用1 mol/L的無水乙酸鈉調節其pH到4.0，4℃保存備用。溶脹酸液（pH 3.0）：41.66 μL的濃鹽酸，雙蒸水定容到500 mL。底物液（TMB-過氧化氫脲溶液）：底物液A：無水醋酸鈉8.2 g，β-糊精2.5 g，過氧化氫脲428.6 mg，加雙蒸水至1 000 mL，調節pH至5.0，4℃保存，使用時恢復至室溫。底物液B：100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前15 min混合，14.6 mL A溶液和0.45 mL B溶液。

1.4方法

1.4.1恩諾沙星酶標抗原的制備

稱取恩諾沙星半抗原8.9 mg溶于150 μL的無水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中使其完全溶解，在攪拌狀態下加入3.5 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和12.4 mg N，N'-二環已基碳二亞胺（DCC），室溫避光反應4 h～6 h。溶液有渾濁物產生，離心（4℃，10 000 g，5 min）除去沉淀，在冰浴條件下將上層活化酯溶液緩慢逐滴加入到3 mL溶有10 mg HRP的碳酸氫鈉（130 mmol/L，pH 8.1）溶液中，4℃下攪拌反應過夜，然后將反應液吸出裝入透析袋，在4℃下用pH 7.4的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液透析3天，然后將透析液取出，保存備用。

1.4.2封閉膠的制備

1）溶脹：稱取1.00 g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到100 mL的配制好的HCl溶液中，攪拌溶脹10 min。

2）淋洗：將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉移到在具砂板層析柱中，再加入200 mL HCl淋洗，然后用偶聯緩沖液沖洗柱子，調節柱子pH至中性。

3）封閉：加入10 mL甘氨酸封閉液，密封柱子，室溫下震蕩反應2 h。

4）清洗：首先加入10 mL的偶聯緩沖液淋洗1次，然后用10 mL的醋酸鈉緩沖溶液和10 mL的偶聯緩沖液分別沖洗。

5）貯存：待清洗液抽空，制備好的封閉膠用PBS 1∶3（體積比）懸起，約10 mL PBS（含有0.3 ml/L的抑菌素），放置于4℃保存待用。

1.4.3抗體膠的制備

1）溶脹：準確稱取0.50 g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到50mL的配制好的HCl溶液中，攪拌溶脹10min。

2）淋洗：將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉移到在具砂板層析柱中，再加入200 mL HCl淋洗，然后用偶聯緩沖液沖洗柱子，調節柱子pH至中性，將淋洗液全部淋完。

3）偶聯抗體：取0.50 mg/mL抗體，用1 mL的偶聯緩沖液稀釋，然后加入到在具砂板層析柱中，密封柱子，室溫下震蕩反應2 h。

4）封閉：加入10mL的偶聯緩沖液淋洗柱子，然后加入10mL的封閉液，再次密封柱子，室溫震蕩反應2h。

5）清洗：首先加入10 mL的偶聯緩沖液淋洗1次，然后用10 mL的醋酸鈉緩沖溶液和10 mL的偶聯緩沖液分別沖洗。

6）貯存：待清洗液抽空，制備好的抗體膠用PBS 1∶3（體積比）懸起，約5 mL PBS（含有0.3 ml/L的抑菌素），放置于4℃保存待用。

1.4.4檢測柱的制備

質控層是由HRP抗體膠與封閉膠以一定比例混合后，取150 μL混合膠加入到1 mL的SPE固相萃取柱中，用注射器活塞將PBS壓出。檢測層是由恩諾沙星抗體膠與封閉膠以一定的比例混合后，取150 μL加入其中，用注射器活塞將PBS壓出。檢測柱由下到上分別是質控層和檢測層。將聚乙烯墊片加入1 mL的SPE固相萃取柱中，然后加入質控層混合膠，加入第二層聚乙烯墊片，在質控層上方約3 mm處加入第三層聚乙烯墊片，然后加入檢測層的混合膠，最后在頂部加入第四層墊片。

1.4.5檢測柱檢測步驟和檢測限

1）加樣：將1 mL按一定比例稀釋的酶標記物與恩諾沙星標準品或樣品溶液混合液，通過進樣口通過柱子，控制流速在2 min流完。

2）洗柱：用3 mL PBST由進樣口加入沖洗柱子，再用2 mL PBS沖洗去除未與抗體結合的抗原與殘留的Tween-20。

3）顯色：從底端吸入300 μL底物液，反應30 s后，用注射器活塞注入空氣，將底物液完全排出，繼續顯色3 min后，觀察顯色情況。

以檢測層顏色剛好消失時待測物的濃度定義為檢測柱的檢測限。

1.4.6實際樣品的檢測

豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉組織樣品和牛奶樣品處理方法如下：

組織：稱取1 g勻漿好的組織樣品于15 mL離心管中，加1.6 mL乙腈，0.4 mL NaOH（0.1mol/L），3 000 r漩渦混勻2 min，離心（15℃，2 500 r/min，10 min），用pH 7.4PBS稀釋10倍。然后取1 mL的稀釋液與酶標混合后，加入凝膠檢測柱進行檢測。

牛奶：取1 mL牛奶樣品加入離心管中，用pH 7.4 PBS稀釋20倍，然后取1 mL的稀釋液與酶標混合后，直接加入凝膠檢測柱進行檢測。

2結果與分析

2.1檢測柱檢測條件的確定

為了縮短檢測時間，使檢測結果易于判斷，需要對質控層HRP抗體膠的用量、檢測層恩諾沙星抗體膠的用量、酶標記物稀釋度、抗原抗體結合反應時間和酶催化底物反應時間等檢測條件進行優化，從而達到快速可視化檢測的目的。

經優化試驗，質控層HRP抗體膠與封閉膠用量比為1∶49（體積比），檢測層恩諾沙星抗體膠與封閉膠用量比為1∶14（體積比），酶標記物稀釋倍數為1∶100 000，抗原抗體結合反應時間為2 min，酶催化底物反應時間為3 min，此條件下的檢測層與質控層顯色后顯現出清晰的藍色，且質控層和檢測層顏色一致，如圖1所示，圖中上層為檢測層，下層為質控層。

2.2檢測柱檢測限的確定

可視化凝膠檢測柱檢測恩諾沙星結果如圖2所示。

如圖2所示，使用檢測柱分別檢測濃度為0、1、2、5 μg/L的恩諾沙星標準品時，當恩諾沙星濃度為0 μg/L時，檢測柱的質控層和檢測層顏色一致，而隨著恩諾沙星濃度的增加，檢測層的顏色逐漸變淺，當恩諾沙星濃度為5 μg/L時，檢測柱的檢測層顏色完全消失，因此確定該免疫凝膠檢測柱的檢測限為5 μg/L。

圖1　檢測柱檢測條件優化Fig.1Optimization of the gel test column

圖2　可視化凝膠檢測柱檢測恩諾沙星Fig.2Detection of enrofloxacin with the visual gel test column

2.3方法特異性

使用恩諾沙星凝膠檢測柱檢測時，當恩諾沙星濃度為5 μg/L時，檢測柱的檢測層顏色完全消失。對于其他喹諾酮類獸藥和其他種類的獸藥，當其濃度達到500 μg/L時，檢測柱的檢測層仍會出現明顯的藍色，方法與其他藥物沒有交叉反應，說明使用此凝膠檢測柱檢測恩諾沙星殘留具有很好特異性。

2.4實際樣品的檢測

豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉和牛奶樣品分別添加最終濃度為0、20、40、100 μg/kg的恩諾沙星。添加后的樣品經過1.4.6所提到的方法處理后直接用于凝膠檢測柱進行檢測，結果如圖3所示。

檢測沒有添加恩諾沙星的動物源性食品樣品的檢測柱的質控層和檢測層顏色一致，而隨著恩諾沙星添加濃度的增加，檢測層的顏色逐漸變淺，當恩諾沙星添加濃度為100 μg/kg時，檢測柱的檢測層顏色完全消失，因此確定該免疫凝膠檢測柱檢測豬肉、牛肉、雞肉、魚肉、蝦肉和牛奶等動物源性食品樣品的檢測限為100 μg/kg。

圖3　可視化凝膠檢測柱檢測動物源性食品中恩諾沙星Fig.3Detection of enrofloxacin in animal-derived foods with the visual gel test column

3結論

本研究建立了一種檢測動物源性食品中獸藥恩諾沙星殘留的新型可視化免疫凝膠柱方法。該凝膠檢測柱方法的檢測限為5 μg/L，整個檢測過程可以在10 min內完成，針對動物源性食品的恩諾沙星檢測限為100 μg/kg。該方法成本低，操作簡單，結果判斷容易，只需根據檢測柱的檢測層顏色深淺和顏色有無就可以定性或半定量檢測恩諾沙星的含量，適合動物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查。

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Development of A Gel-based Rapid Visual Immunoassay for the Detection of Enrofloxacin

SHENG Wei，WU Xue-ning，HU Gao-shuang，LI Shi-jie，LIU Yue，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

A new gel-based visual immunoassay was developed for the rapid screening of enrofloxacin residues in animal-derived foods.The enrofloxacin was conjugated to HRP accordig to the active ester method.Thegelbased test column in an empty SPE cartridge（1 mL）consisted of a test layer containing anti-enrofloxacin antibody coupled gel，and a control layer with anti-HRP antibody coupled gel.Based on the direct competitive immuno-reaction and the horseradish peroxidase enzymatic reaction，the test results could be evaluated visually according as color development.The limit of detection（LOD）of this gel-based immunoassay was 5 μg/L and the whole procedure was completed within 10 min.The LODs of this assay for enrofloxacin in animal-derived foods were 100 μg/kg.The gel-based visual immunoassay allows for accurate，sensitive，specific，rapid，and lowcost detection of enrofloxacin residues in animal-derived foods.

enrofloxacin；geltestcolumn；visualdetection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.027

2015-11-12

“十二五”國家科技計劃課題（2012BAD28B05）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（13JCQNJC15300）；國家國際科技合作專項項目（2014DFR30350）

生威（1980—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全檢測。