ELISA方法檢測牛奶中葉酸含量

李貞

（內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古呼和浩特010070）

ELISA方法檢測牛奶中葉酸含量

李貞

（內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古呼和浩特010070）

探討牛奶中葉酸檢測的酶聯免疫反應（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法建立及其葉酸本底含量測定。用競爭性酶聯免疫，棋盤法確定最佳抗體包被條件、封閉條件、酶標抗原濃度等，并進行性能評價測定，檢測80例牛奶樣品中的葉酸本底含量。結果表明：①最佳ELISA條件為：葉酸抗體以2 μg/mL濃度，碳酸鹽緩沖液4℃過夜包被，用1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，葉酸-辣根過氧化物酶標記物（葉酸-HRP）工作濃度1 μg/mL。②該方法最低檢測限2.22 ng/mL；精密度測試CV＜5%；特異性檢測與葉酸類似物的交叉反應率均≤0.1%；本方法與對照方法具有良好的樣本測值相關性（r=0.960，P＜0.05）；該方法加標回收率在94.50%～108.00%之間，回收效果良好；樣品基質效應對該方法測值無顯著影響。③牛奶樣本葉酸本底含量范圍為12.55 ng/mL～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL。本研究建立的ELISA方法能夠滿足牛奶樣品中葉酸含量的檢測。

酶聯免疫法；葉酸；棋盤法

葉酸是一種水溶性B族維生素，在人體中發揮重要的生理作用如：參與脫氧核糖核酸（DNA）與核糖核酸（RNA）的合成，防止DNA的變異，預防癌癥［1］；參與氨基酸的代謝，充當甘氨酸與絲氨酸、組氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸與蛋氨酸之間的相互轉化過程中的一碳載體［2］；參與血紅蛋白及甲基化合物如腎上腺素、膽堿、肌酸等的合成，是含鐵血紅蛋白的組分［3］。

葉酸對人體作用重大，但是人體自身不能合成葉酸，只能通過外界補充，因此食品中葉酸含量的高低直接影響著人體葉酸水平的高低。牛奶目前已經成為民眾不可或缺的食品組成部分，因此其葉酸含量的檢測對于指導乳制品企業在合理范圍內強化葉酸的添加量具有重大的意義。目前，牛奶中葉酸的檢測有很多方法［4］：如微生物法、化學發光測定法、離子捕獲法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、高效液相色譜法等，但都有其各自的缺陷，微生物法檢測周期長，菌種傳代保存比較繁瑣；化學發光法與熒光法對儀器要求較高；比色法和紫外分光光度法選擇性較差，容易被干擾；薄層層析法靈敏度較低，且只適合維生素制劑中葉酸的測定；高效液相色譜法靈敏度低，對儀器要求較高，樣本抗干擾能力差。

酶聯免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）具有檢驗靈敏度高、特異性好、樣本處理量大、檢驗時間短、儀器要求低等諸多優點，目前市場上幾乎沒有專門用于食品（牛奶）葉酸檢測的ELISA試劑盒，因此本研究旨在探討自主建立ELISA方法進行牛奶中葉酸含量的檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑以及材料

酶標板：Corning Incorporated（USA）；葉酸標準品：Sigma-Aldrich Co.LLC；葉酸單克隆抗體、葉酸-HRP：北京翰譜醫藥生物研究所；酶標抗原稀釋液、TMB（四甲基聯苯胺）單組份顯色液：北京梅德厚普生物科技有限公司；清洗液（磷酸鹽緩沖液，20 mmol/L，pH 7.4）、終止液（0.5 mol/L硫酸）。

1.1.2主要儀器

洗板機：普朗集團；酶標儀：Thermo Multiskan。

1.2方法

1.2.1競爭ELISA程序［5］

1）包被抗體：將抗體用包被緩沖液稀釋到一定濃度，100 μL/孔，37℃或者4℃包被若干小時，洗板兩次。

2）封閉：每孔加入200 μL封閉液，37℃封閉2 h～4 h，洗板3次。

3）加樣：每孔加入樣品（標準品、待測樣品）50 μL以及稀釋的葉酸-HRP 50 μL，37℃反應1 h，洗板5次。

4）顯色：每孔加入TMB單組份顯色底物100 μL，37℃反應15 min。

5）終止讀數：每孔加入終止液50 μL，酶標儀450 nm讀數，記錄OD450nm。

1.2.2標準品的制備

電子天平準確稱量50mg葉酸，倒入50mL容量瓶，用10mmol/LNaOH定容，搖勻溶解，此時濃度1mg/mL，移液器取上述液體1 mL放入1 L容量瓶，用生理鹽水稀釋至1 μg/mL，再繼續稀釋得到100、50、25、10、5、2.5 ng/mL以及0 ng/mL共7個梯度的標準品。標準品置于棕色瓶中儲存。

1.2.3樣品的制備

5 mL的新鮮牛奶樣品（全脂乳或脫脂乳）置于試管中，2℃～8℃冷藏30 min。隨后樣品在3 000 r/min條件下離心10 min。上部的脂肪層吸出并棄去。剩余的水層以1∶5的體積比稀釋于樣品稀釋液中。

1.2.4抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度的確定

采用棋盤法［6］，同時確定抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度，方法如下：抗體用pH=9.6的50 mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋，共4、2、1、0.5 μg/mL 4個梯度，4℃過夜包被，1%BSA封閉，然后每孔加入50 μL，濃度為10 ng/mL的標準品，再分別加入的1、0.5、0.2 μg/mL 3個梯度的葉酸-HRP，37℃反應1 h，顯色，終止讀數。選取OD450nm最接近2.0的抗體包被濃度與葉酸-HRP稀釋濃度作為最佳工作濃度。

1.2.5抗體包被條件的確定

選擇3種包被液：檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0）、磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.4）、碳酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 9.6）；兩種包被方式：37℃包被4 h、4℃過夜包被（12 h），按照1.2.4確定的最佳工作濃度試驗，比較各組陰陽性對照孔OD450nm值和N/P比，以確定最佳包被條件。

1.2.6封閉劑的確定

選擇3種封閉液：1%BSA、1%明膠、5%的奶粉，按照1.2.4確定的最佳工作濃度與1.2.5確定的最佳包被條件進行試驗，比較各組陰陽性對照孔OD450nm值和N/P比，以確定最佳封閉條件。

1.2.7標準曲線的制作

記標準品濃度為x，記每個標準品對應的OD450nm值為y，作x、y散點圖，采用合適的擬合方法進行數據擬合，計算回歸方程以及回歸系數。

1.2.8本方法性能測定

1）最低檢測限：以0 ng/mL標準品吸光度的3倍標準偏差作為最低檢測限吸光度，根據標準曲線求出對應的濃度即為最低檢測限濃度。

2）精密度測試：定標后平行測試高值與低值樣本各10次，計算測定均值（x）和標準差（s）。按照公式（1）計算變異系數。3）特異性測定［7］：特異性可用交叉反應率來表示。交叉反應率即引起50%抑制的葉酸標準物濃度（葉酸IC50）與引起50%抑制的葉酸類似物濃度（葉酸相似物IC50）值之比。本試驗分別測定了該試劑盒與四氫葉酸、二氫葉酸、5-甲酰四氫葉酸、VB12、亞葉酸等的交叉反應率。按照公式（2）計算交叉反應率。

4）樣本測值相關性：對照方法為國家標準方法中微生物法［8］。本方法與對照方法同步檢測50例樣本，分析測值相關性。

5）加標回收率測定：取兩份相同的樣品，其中一份加入定量的待測成分標準物質，用本方法同時測定兩份樣品結果，加標樣品測值減去未加標樣品測值所得差值同加入標準物質理論值之比即為樣品加標回收率。按照公式（3）計算加標回收率。本研究共加入低、中、高3個濃度的標準品。

6）樣品基質效應測定

取一高值樣品（濃度約為80 ng/mL），用PBS梯度稀釋，分別稀釋為原來濃度的1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/ 32，以理論濃度做x軸，以檢測濃度做y軸，進行曲線擬合，分析曲線斜率與截距，以及檢測濃度與理論濃度的偏差，分析基質效應的影響大小。

1.2.9牛奶樣品中葉酸本底含量的測定

收集市售牛奶樣品80例，用本方法測定樣品中的葉酸，分析市售牛奶樣品中葉酸的本底范圍、平均值，含量分布規律等等。

1.2.10數據處理

采用Minitab16進行數據處理與作圖。

2結果與分析

2.1抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度的確定

棋盤法ELISA結果見表1。

表1　棋盤ELISA結果Table 1The results of checkerboard ELISA

由表1數據分析得出，當包被濃度為2 μg/mL，葉酸-HRP稀釋度為1 μg/mL時，其OD為2.025，最接近2.0，因此選擇此濃度作為最佳工作濃度。

2.2抗體包被條件的確定

不同包被條件下的陰、陽性對照OD450nm值與N/P比見表2。

表2　不同包被條件下的陰、陽性對照的OD450nm值與N/P比Table 2OD450nmand N/P ratio of positive and negative controls in different coating condition

由表2數據分析得出，碳酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 9.6），4℃過夜包被具有最佳的N/P比（38.2），因此選擇此條件作為最佳抗體包被條件。

2.3封閉劑的確定

不同封閉劑條件下的陰、陽性對照OD450nm值與N/ P比見表3。

表3　不同封閉劑條件下的陰、陽性對照的OD450nm值與N/P比Table 3OD450nmand N/P ratio of positive and negative controls in different blocking condition

由表3數據分析得出，1%的明膠封閉具有最佳的N/P比（37.5），1%BSA封閉次之（35.7），5%奶粉封閉效果最差（19.4），考慮到前兩者差距不大，另外由于1%明膠的配制需要加熱，過程略微繁瑣，因此選擇1%的BSA作為封閉劑。

2.4標準曲線的制定

本方法與對照方法（微生物法）的定標曲線見圖1、圖2。

由圖1數據來看，本方法的定標曲線為y=3.441-1.702 log10（x），線性回歸系數R2=0.998，擬合度良好，符合預期。由圖2數據來看，對照方法（微生物法）采用三階多項式進行擬合，擬合回歸系數R2=0.998，擬合度良好，符合預期，定標曲線為y=-0.318 6x3+0.164 7x2+ 0.987 8x+0.009 18。

2.5本研究性能測定

1）最低檢測限：0 ng/mL標準品的OD450nm測定結果見表4。

圖1　本方法定標曲線Fig.1The calibration curve of the ELISA method

圖2　對照方法定標曲線擬合結果Fig.2The calibration curve of the microbiological method

表40　ng/mL標準品OD450nm值Table 4OD450nmof the standard with the concentration of 0 ng/mL

由表4數據計算x-3s=2.997-0.048 4×3=2.773，根據圖1標準曲線計算出對應的濃度=2.22 ng/mL，即為最低檢測限。

2）精密度測試：本方法的精密度測定結果見表5。

表5　精密度測定結果Table 5The results of precision measurement

由表5可以看出低值樣本CV為3.49%，高值樣本CV為1.46%，二者均小于5%，具有良好的精密度。

3）特異性測定：本方法的特異性測試結果見表6。

表6　特異性測定結果Table 6The results of specificity assays

由表6可以看出，本方法與四氫葉酸的交叉反應率為0.033%，與二氫葉酸的交叉反應率為0.036%，與5-甲酰四氫葉酸交叉反應率為0.10%，與VB12的交叉反應率為0.01%，4種葉酸類似物的交叉反應率均小于等于0.10%，特異性良好。

4）樣本測值相關性：本方法與對照方法測值相關性分析結果見圖3。

圖3　本方法與對照方法測值相關性分析Fig.3The correlation analysis between the ELISA method and the comparison method

由圖3看出，線性回歸方程為：對照方法=0.985 6×本方法+1.044，回歸系數r=0.960，本方法與對照方法二者測值存在顯著性相關（P＜0.05）。

5）加標回收率測定：本方法的回收率測定結果見表7。

表7　加標回率收測定結果（n=6）Table 7The results of recovery test（n=6）

由表7可以看出，本方法的加標回收率在94.50%～108.00%之間，具有良好的回收率。

6）基質效應測定：本方法的基質效應測定結果見圖4。

圖4　基質效應測定結果Fig.4The results of matrix effects test

在基質效應的測試中，樣品實測濃度與理論濃度的最大偏差為9.90%，由圖4可以看出，擬合方程為：實測濃度=0.998 4×理論濃度-0.753 4，回歸系數R2= 0.998，線性良好。擬合曲線的斜率=0.994 8≈1，截距-0.753 4，由此說明樣品的基質效應影響微乎其微。

2.6市售牛奶樣品葉酸本底測定

80例牛奶樣品葉酸含量測定結果見圖5。

圖5　80例牛奶樣品葉酸含量測定結果Fig.5The folate concentration of 80 milk samples

由圖5可以得出，80例市售牛奶樣本，葉酸濃度范圍為12.55 ng/mL～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL，中位數38.24 ng/mL。其中，在30 ng/mL～40 ng/mL的樣品具有最高的頻數，葉酸濃度超過60 ng/mL的樣品數量極少（4例），無葉酸濃度低于10 ng/mL的樣品。

3討論

葉酸是一組化學結構相似，生化特性相近的化合物統稱，是由喋啶、對氨基苯甲酸和1個或多個谷氨酸結合而成的維生素。國家食品葉酸檢驗的標準方法是微生物法，該方法檢測限為0.1 ng/mL［9］，具有比本研究更高的靈敏度，但是微生物法試驗周期長，每周一次的菌種傳代保藏比較繁瑣，另外試驗所使用的基礎培養基和酶解液成本高，更易受外界葉酸污染而影響數據準確性。HPLC方法也是食品或藥品葉酸檢測的常用方法，其最低檢出限10 μg/mL［10］，HPLC法在測定成分復雜的食品樣品中的化合物形式葉酸時，結果不準確。本研究所采用的葉酸抗體為小鼠抗葉酸單克隆抗體，其能夠與游離葉酸、化合物形式的葉酸以及葉酸蛋白結合物結合，因此與HPLC方法相比，測值結果更加準確；

本研究所建立的ELISA方法其創新之處在于：

1）原料抗體為葉酸高特異性抗體，交叉反應率低；

2）牛奶樣本基質效應對濃度結果的測定影響微乎其微；

3）檢測時間顯著縮短；

4）操作更加簡便易行，而且試驗試劑、試驗流程更加安全；

另外，本方法的線性范圍為2.5ng/mL～100ng/mL，而經過測量得到的牛奶中的葉酸本底含量為12.55ng/mL～68.72 ng/mL之間，正好在本方法線性范圍之內，樣本檢測過程中，無需經過稀釋或濃縮步驟，試驗誤差大大降低。

本研究檢測的牛奶樣品本底葉酸濃度范圍為12.55 ng/mL～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL，這與劉志楠等［11］的研究結果具有一致性。

綜上所述：本研究建立的ELISA方法具有良好的檢測限、線性范圍、精密度、特異性、樣本測值相關性、回收率以及較低的基質效應，能夠滿足牛奶樣品葉酸含量的檢測，值得推廣。

［1］Kamen B.Folate and antifolate pharmacology［J］.Semin Oncol，1997，24（18）：30-39

［2］Hoffbrand A V，Weir D G.The history of folic acid［J］.Br J Haemato，2011，113（3）：579-589

［3］吳定，高云.食品營養與衛生保健［M］.北京：中國計量出版社，2008：84-85

［4］石丹，賈云虹，包怡紅，等.葉酸檢測方法的研究現狀及發展趨勢［J］.中國乳品工業，2009，37（3）：42-45

［5］焦奎，張書圣.酶聯免疫分析技術及應用［M］.北京：化學工業出版社，2004：98

［6］馮挺財，邵譜，胡珩，等.牛乳鐵蛋白直接競爭ELISA檢測法的建立［J］.安徽農業科學，2008，36（18）：7650-7652，7761

［7］陳勇，施杏芬，魯馬媚，等.食品中呋喃妥因代謝物酶聯免疫檢測試劑盒的研制［J］.畜牧獸醫科技信息，2012（7）：26-29

［8］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.211-2008食品中葉酸的測定［S］.北京：中國標準出版社，2011：1-9

［9］唐靚，李躍中，王晗，等.微生物法與HPLC測定藥品及食品中葉酸含量的比較及應用［J］.藥物分析與檢驗，2009，26（12）：1016-1019

［10］邵生文，王艷.高效液相色譜法測定復合維生素膠囊中葉酸含量［J］.中國民康醫學，2007，19（7）：591-592

［11］劉志楠，趙雅麗，李海礁，等.牛奶中葉酸VB12和生物素本底含量的研究［J］.食品研究與開發，2013，34（24）：1-4

ELISA Method for the Detection of Folate in Milk

LI Zhen
（Food Engineering Department，Inner Mongolia Business&Trade Vocational College，Hohhot 010070，Inner Mongolia，China）

Explored the establish of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method for milk folic acid detection and determine the initial content.Used a competitive enzyme immunoassay，checkerboard method to determine the optimal coating conditions，confinement，HRP labeled-antigen concentration etc.，then evaluated the performance and detect the folic acid content of 80 milk samples.The results showed：①The optimal ELISA conditions：coated the folate antibody with the concentration of 2 μg/mL，at the conditions of carbonate bufferand and 4℃，then blocked with 1%BSA，the working concentration of FA-HRP was 1 μg/mL.②In this study，the detection limit was 2.22 ng/mL，the precision test CV＜5%；the cross-reactivity with folic acid analogs was less than 0.1%；there was a significant correlation（r=0.960，P＜0.05）with the control method in the values of sample measurement；this method had a good recovery effect which was between 94.50%-108.00%；in this method，the sample matrix effects had no significant effect on the detection.③The concentration range of milk folic acid in the samples was12.55 ng/mL-68.72 ng/mL with an average of 37.93 ng/mL.This ELISA method could meet the testing of folic acid in milk.

enzyme-linkedimmunosorbentassay；folicacid；checkerboardmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.032

2015-11-17

內蒙古自治區高等學校科學研究項目（NJZC13407）

李貞（1980—），男（蒙古），講師，碩士研究生，研究方向：食品加工與檢驗方向。