應用響應面法優化普通小球藻的絮凝工藝

馬志欣，胡小麗，成　婕，高　坤，鄧祥元

(江蘇科技大學生物技術學院，江蘇　鎮江　212018)

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應用響應面法優化普通小球藻的絮凝工藝

馬志欣，胡小麗，成婕，高坤，鄧祥元*

(江蘇科技大學生物技術學院，江蘇鎮江212018)

以聚合氯化鋁(Poly aluminium chloride, PAC)為絮凝劑，利用響應面法對普通小球藻Chlorellavulgaris的絮凝工藝進行優化。研究結果表明：影響C.vulgaris絮凝效率的主次因素順序為絮凝時間>C.vulgaris初始OD值>PAC濃度；C.vulgaris的最佳絮凝工藝為：PAC濃度為57 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值為2.06，絮凝時間為18 min。在此絮凝條件下，C.vulgaris的絮凝效率為95.82%。研究結果將為進一步研究C.vulgaris的絮凝采收工藝提供數據參考和技術支持。

普通小球藻；聚合氯化鋁；絮凝工藝；響應面法

普通小球藻Chlorellavulgaris，C.vulgaris是一種球形單細胞藻類，具有光合效率高，生長速度快，種類繁多，分布廣泛，營養豐富，適應性強等特點[1-2]，在光合自養條件下，C.vulgaris還具有高效的CO2固定轉化能力，其對CO2的轉化效率是陸地高等植物的10～50倍[3-4]。目前，C.vulgaris因富含多糖、蛋白質、色素、脂肪酸等多種營養成分，并可人工條件下大規模培養，已被廣泛應用于食品、醫藥和生物能源等領域[5-7]。雖然C.vulgaris具有良好的應用前景，但是其產業化程度仍不高，其中最主要的原因之一就是其采收成本過高，據估算，其采收成本約占整個生產成本的20%～30%[8]。C.vulgaris之所以采收困難，是因為其個體微小，培養濃度低，可以形成穩定的分散體系。因此，尋找一種高效率、低成本、應用廣的采收方法是C.vulgaris產業化的必由之路。目前，用于微藻采收的方法主要有沉降法、離心法、過濾法和絮凝法。沉降法是依靠重力作用進行采收的方法，因其采收效率較低，常與絮凝法結合使用；離心法是借助離心力作用進行采收的方法，其效率較高，但能耗大、成本高[9]；過濾法是利用過濾介質實現采收的方法，該法在實際生產過程中常出現濾膜堵塞和污染等問題；絮凝法是通過添加絮凝劑進行采收的方法，其機理是通過電中和、架橋或/和網捕作用，使分散的帶電荷藻細胞聚集到一起，以達到采收的目的，具有采收效率高、成本低，且既可單獨使用，又可與沉降法、離心法和過濾法聯合使用等優點，其中無機絮凝法是應用最為廣泛的采收方法。丁進鋒等[10]進行了聚合氯化鋁(Poly aluminium chloride, PAC)絮凝小球藻的動力學研究，發現PAC絮凝小球藻時不符合一級動力學方程，但可用二級動力學模型進行擬合，絮凝效率高達98.6%，表明PAC絮凝小球藻前景廣闊。本試驗對PAC絮凝C.vulgaris的影響因素進行了探究，并且利用響應面法對影響因素進行優化，以探索最優絮凝工藝，降低C.vulgaris采收成本，為利用PAC絮凝C.vulgaris的采收工藝提供理論基礎和技術支持，加速C.vulgaris的產業化進程。

1　材料與方法

1.1試驗材料

普通小球藻Chlorellavulgaris購自中國科學院野生生物種質庫(淡水藻種庫)，在無菌條件下，將藻種轉接到BG-11培養基[11]中，并利用本試驗研制的微藻通氣培養裝置進行高密度培養，培養條件為：溫度25℃，光強3 000 lx，光周期為12 h L∶12 h D；通氣速率為1 vvm (L air/Lculture/min)。

聚合氯化鋁(PAC)購自上海麥克林生化科技有限公司，其他試劑，如NaOH、HCl等為上海國藥集團化學試劑有限公司生產的分析純試劑。

本試驗所用儀器有UV-1800PC型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)，光照培養架，微藻通氣培養裝置(本實驗室研制)。

1.2試驗方法

1.2.1小球藻生物量的測定測定小球藻藻液在680 nm波長下的吸光度值，用以間接表示小球藻生物量[12]。

1.2.2絮凝效率的測定在50 mLC.vulgaris培養液中加入一定濃度的PAC，一定時間后，在680 nm波長下測其OD值，根據所得OD值，計算C.vulgaris的絮凝效率。計算公式為絮凝效率=(OD0-ODt)/OD0×100%[13]，其中，OD0表示C.vulgaris初始OD值，ODt表示絮凝時間為t時C.vulgaris的OD值。

1.2.3單因素試驗當絮凝時間為15 min、初始OD680為0.95時，設定PAC質量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70和80 mg·L-1；當絮凝時間為15 min、PAC質量濃度為60 mg·L-1時，設定C.vulgaris初始OD值為0.1、0.5、1、1.5、2、2.5和3；當初始OD680為1.97、PAC質量濃度為60 mg·L-1時，設定絮凝時間為0、5、10、15、20、25和30 min；通過單因素試驗研究其對C.vulgaris絮凝效率的影響。

1.2.4響應面分析試驗在單因素試驗的基礎上，進一步利用Box-Behnken中心組合試驗設計優化影響PAC絮凝C.vulgaris的3個工藝參數，即PAC濃度(X1)、C.vulgaris初始OD值(X2)、絮凝時間(X3)，并以-1、0、+1代表其水平(表1)。

采用Design Expert 8.0.5.0軟件對數據進行回歸分析，獲得各因素一次效應、二次效應及其交互效應的關聯方程，并對PAC絮凝C.vulgaris的工藝條件進行優化。

表1PAC絮凝C.vulgaris工藝的Box-Behnken試驗因素水平設計

Table 1Factors and levels for Box-Behnken experimental design on PAC flocculation ofC.vulgaris

2　結果與分析

2.1單因素試驗

首先研究PAC質量濃度、C.vulgaris初始OD值及絮凝時間對C.vulgaris絮凝效率的影響，結果如圖1、2、3所示。由圖1可知，隨著絮凝劑PAC濃度的增加，C.vulgaris的絮凝效率逐漸遞增，這是由于帶正電荷的PAC不斷中和微藻細胞表面所帶的負電荷，減少了細胞間的靜電排斥作用，使其絮凝[14]。此外，PAC的網捕沉淀作用和吸附架橋作用也進一步促進微藻的絮凝沉降[15]。當PAC質量濃度達到60 mg·L-1以后，絮凝效率基本不變。因此，考慮到生產成本以及下游處理的簡便性，在進行響應面分析時，選擇50、60和70 mg·L-1作為優化PAC質量濃度的3個水平。由圖2可知，隨著C.vulgaris初始OD值的增大，其絮凝效率不斷上升，但當初始OD值大于1.5時，其絮凝效率基本穩定。此外，研究發現：當C.vulgaris的初始OD值處于低水平時，其絮凝效率極低，這可能是由于絮凝劑在藻細胞碰撞成團的過程中作用減弱；也可能是由于藻細胞所帶電荷不足以中和絮凝劑所帶電荷，因而產生了排斥作用，這與曲孟等人[13]的觀點一致。因此在進行響應面分析時C.vulgaris初始OD值選擇1.5、2和2.5三個水平。由圖3可知，前15 min絮凝效率隨絮凝時間的延長而顯著增加，可達到75%左右，15 min以后絮凝效率的增長變得緩慢。理論上來說，隨著絮凝時間的增加，C.vulgaris細胞和PAC之間的接觸越來越充分，絮凝效率會更高，但過長時間的絮凝可能會導致C.vulgaris細胞活性的改變，增加下游處理難度[13,16]。此外，考慮到采收周期成本，在進行響應面分析時，絮凝時間選擇10、15、20 min 3個水平。

2.2響應面分析

2.2.1Box-Behnken中心組合優化在單因素試驗的基礎上，本研究進一步采用3因素3水平的響應面法優化PAC絮凝C.vulgaris的工藝參數，結果見表2。此次Box-Behnken試驗設計方案共有17個試驗點，其中12個為析因試驗，其余5個為中心試驗。析因點為自變量取值在X1、X2、X3構成的三維頂點，零點區域為中心點，零點區域重復5次，用于估計試驗誤差[17]。

表2PAC絮凝普通小球藻(Chlorellavulgaris)工藝的響應面試驗設計方案及結果

Table 2Design and results of response surface experiment on PAC flocculation ofC.vulgaris

2.2.2回歸方程的建立與檢驗利用Design Expert 8.0.5.0分析軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到C.vulgaris絮凝效率對PAC質量濃度(X1)、C.vulgaris初始OD值(X2)、絮凝時間(X3)3個因素的二次多項回歸方程：

表3PAC絮凝C.vulgaris工藝條件優化的回歸方程的方差分析及其系數顯著性檢驗

Table 3Variance analysis and significance test on regression equation of response surface experiment for optimizing PAC flocculatingC.vulgaris

注: * 表示有顯著性差異(P<0. 05)；** 表示有極顯著性差異(P<0. 01)。

2.2.3C.vulgaris絮凝因素間的交互作用分析用Design Expert 8.0.5.0軟件根據回歸方程進行繪圖分析，得到響應面圖4～6。圖4顯示當PAC質量濃度為60 mg·L-1時，絮凝時間與C.vulgaris初始OD值間的交互作用對C.vulgaris絮凝效率的影響，這2個因素的交互作用不顯著，隨著絮凝時間和C.vulgaris初始OD值的增加，絮凝效率先逐漸上升，然后略有下降，表明適當的增加絮凝時間和C.vulgaris初始OD值可有效提高C.vulgaris的絮凝效率。圖5表明當C.vulgaris初始OD值為2時，PAC質量濃度和絮凝時間對C.vulgaris絮凝效率的交互作用不顯著，當PAC質量濃度一定時，隨絮凝時間的增加，C.vulgaris絮凝效率緩慢上升；而當絮凝時間一定時，隨PAC質量濃度的增加絮凝效率先逐漸上升，然后緩慢下降。同時可以看出當PAC質量濃度為中水平，絮凝時間為高水平時，C.vulgaris的絮凝效率處于高水平。圖6顯示當絮凝時間為15 min時，PAC質量濃度和C.vulgaris初始OD值的交互作用極顯著，且在二者均處于中水平時，C.vulgaris絮凝效率最高。

2.2.4最佳工藝條件確定根據Box-Behnken分析模型得知，PAC絮凝C.vulgaris的最佳工藝條件為：PAC質量濃度為56.91 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值為2.06，絮凝時間為18.76 min。在此工藝條件下，所得C.vulgaris絮凝效率的理論值為97.51%。為檢驗響應面法所得最優工藝的可靠性，同時考慮實際操作情況，將PAC絮凝C.vulgaris的最佳工藝條件修正為PAC質量濃度為57 mg·L-1，C.vulgaris初始OD值為2.06，絮凝時間為18 min，實際測得小球藻絮凝效率為95.82%，與理論預測值間誤差為1.73%(<5%)。

3　結　論

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(責任編輯：黃愛萍)

Optimization ofChlorellavulgarisFlocculation Using Response Surface Methodology

MA Zhi-xin, HU Xiao-li, CHENG Jie, GAO Kun, DENG Xiang-yuan*

(CollegeofBiotechnology,JiangsuUniversityofScienceandTechnology,Zhenjiang,Jiangsu212018,China)

Flocculation ofChlorellavulgarisusing Poly aluminum chloride (PAC) was optimized by theresponse surface methodology. The factors that affected the flocculation efficiency were in the order flocculation duration>initial OD value ofC.vulgaris>PAC concentration. The optimized flocculation conditions included a PAC concentration of 57 mg·L-1, an initial OD value ofC.vulgarisof 2.06, and flocculation for 18 min to achieve a maximized efficiency of 95.82%.

Chlorellavulgaris; Poly aluminum chloride; flocculation; response surface methodology

2016-03-20初稿；2016-05-09修改稿

馬志欣(1994-)，男，主要從事微藻生物制品研究(E-mail: 969080860@qq.com)

鄧祥元(1982-)，副教授，博士，主要從事微藻生物學研究(E-mail：dengxy2009@just.edu.cn)

國家自然科學基金(31200381)；江蘇省自然科學基金(BK2011493)

S 216.2

A

1008-0384(2016)07-765-06

馬志欣，胡小麗，成婕，等.應用響應面法優化普通小球藻的絮凝工藝[J].福建農業學報，2016，31(7)：765-769.

MA Z-X，HU X-L，CHENG J，et al.Optimization ofChlorellavulgarisFlocculation Using Response Surface Methodology[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：765-769.