桂花組織基因表達中熒光定量PCR內參基因的篩選

付建新，張　超，王藝光，趙宏波，2

（1.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

桂花組織基因表達中熒光定量PCR內參基因的篩選

付建新1，張超1，王藝光1，趙宏波1，2

（1.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安311300）

為了篩選桂花Osmanthus fragrans不同組織基因表達分析中適合的內參基因，以桂花 ‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhong Gui’花蕾、盛開花序、嫩葉、成熟葉和1年生莖等5個不同組織為材料，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測7個候選內參基因的表達水平，并利用geNorm，NormFinder和BestKeeper軟件對各候選內參基因的表達穩定性進行評價，最后利用桂花不同組織中OfCRTISO1基因相對表達水平驗證篩選的內參基因的可靠性。結果表明：綜合3個軟件的評價排序，確定不同組織中最佳內參基因為OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差內參基因。OfCRTISO1基因相對表達水平分析證實，不同組織中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2個表達最穩定的基因組合，即可獲得更為精確的基因表達結果。旨在為桂花組織間重要基因的定量表達分析提供科學依據。圖4表4參34

植物學；桂花；內參基因；geNorm；NormFinder；BestKeeper

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，qRTPCR）因具有靈敏度高、特異性強、精準性高、檢測范圍廣等優點［1］，已被廣泛應用于植物基因表達的相關研究中。利用qRT-PCR分析基因相對定量表達時，為了消除不同組織細胞間初始模板量、核糖核酸（RNA）制備和反轉錄過程中的偏差，需要引入內參基因（reference gene）對表達結果進行校正［2-3］。實際研究中常選擇的內參基因［4-8］只能在一定的試驗范圍內相對穩定表達，不能保證在所有試驗條件下均能穩定表達［9-11］。如果盲目以一種看家基因作為任何試驗條件下的內參基因，容易得到精確度低甚至錯誤的結果［12］，因此，在利用qRT-PCR進行基因表達分析時，根據試驗處理及不同實驗材料的特點，優化和選擇合適的內參基因就顯得極其重要。桂花Osmanthus fragrans是中國十大名花之一，隨著桂花分子生物學研究的不斷深入和發展，基因表達分析已經廣泛應用于揭示其觀賞性狀形成機制的研究中，因此，篩選穩定的內參基因在桂花重要基因表達分析中起著關鍵的作用。已有研究篩選出桂花不同品種、不同發育狀態花序和不同溫度處理條件中合適的內參基因［13］，卻未對不同組織中適合的內參基因進行篩選。本研究將以桂花 ‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhong Gui’不同組織（花蕾、盛開花序、嫩葉、成熟葉、1年生莖）為材料，利用qRT-PCR檢測7個候選內參基因的表達水平，并利用軟件geNorm［3］，NormFinder［2］和BestKeeper［14］對各候選內參基因的表達穩定性進行評價，篩選出最穩定表達的內參基因，并研究桂花類胡蘿卜素異構酶（OfCRTISO1）在不同組織中的表達模式，驗證篩選得到的內參基因的可靠性，希冀為后續研究不同組織重要基因的定量表達提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

浙江農林大學桂花資源圃10 a樹齡地栽桂花 ‘堰虹桂’為試驗材料，對其花蕾、盛開花序、嫩葉、成熟葉、1年生莖進行取樣，液氮速凍后，于-80℃儲藏備用。

1.2方法

1.2.1不同組織材料總RNA提取與cDNA的第1鏈的合成采用RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）按照說明書步驟提取各樣品的總RNA。紫外分光光度計和10.0 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質量。采用Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大連）按照說明書合成cDNA的第1鏈后，于-20℃儲存備用。

1.2.2內參基因的選擇及特異性引物設計本研究從前期構建的桂花轉錄組數據庫中取肌動蛋白基因（OfACT），延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α），NADP-異檸檬酸脫氫酶基因（OfIDH），GTP結合蛋白RAN1基因（OfRAN1），β微管蛋白基因（OfTUB），泛素結合酶E2基因（OfUBC2）和18S核糖體RNA基因（Of18S）等7種看家基因作為候選的內參基因。根據qRT-PCR引物設計原則，利用Primer Premier 5等軟件設計各候選內參基因的qRT-PCR引物（引物序列見表1），其中Of18S引物引自文獻［5］。

表1　qRT-PCR檢測中7個候選內參基因的引物序列Table 1　Primer sequences of seven candidate reference genes in qRT-PCR analysis

1.2.3內參基因的qRT-PCR分析利用兩步法來進行qRT-PCR分析，在7300實時PCR儀（Applied Biosystems）運行。基于SYBR Green染料的qRT-PCR來檢測內參基因的循環閾值Ct值，所用反應體系和程序參考Takara 公司的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒的說明書。PCR反應體系為20.0 μL，其中2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，上下游定量引物10.0 μmol·L-1各0.8 μL，模板cDNA 2.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用滅菌雙蒸水補齊至20.0 μL。qRT-PCR擴增采用兩步法，即在95℃預變性30 s之后，先運行40個循環的95℃5 s，60℃31 s，再運行溶解曲線階段的95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。通過觀察ABI 7300實時PCR儀在PCR反應后生成的溶解曲線為單一峰判定所用引物無非特異擴增；實驗得到定量Ct值用于后期內參基因穩定性分析。

1.2.4數據處理與分析本研究采用geNorm［3］，NormFinder［2］和BestKeeper［14］軟件對7種候選內參基因在桂花不同組織中的表達穩定性進行統計學分析，從而篩選桂花組織基因表達中最合適的內參基因。

1.2.5桂花OfCRTISO1基因驗證內參基因穩定性利用桂花不同組織中OfCRTISO1基因表達模式驗證篩選的內參基因的穩定性，其表達上游引物為5′-GAAAAACAAGGGATTCTCGGA-3′，下游引物為5′-GCAGATAGTAGGCAAGGGTCAA-3′。

2　結果與分析

2.1候選內參基因引物評價

以桂花嫩葉的cDNA為模板，利用7對引物均能擴增出與各候選內參基因預期大小一致的單一條帶（結果未顯示），說明這7對引物均能特異性地擴增相應片段，可以用于qRT-PCR分析。qRT-PCR溶解曲線分析表明：這7對引物的擴增產物單一，可用于下一步分析。將反轉錄的嫩葉cDNA樣品以5倍濃度梯度稀釋，以此為模板進行qRT-PCR擴增后制作7種內參基因的標準曲線，結果（表2）顯示：各內參基因的線性相關系數 R2≥0.990 0，引物的擴增效率為 97.7%～109.6%，符合qRT-PCR對擴增效率的要求。

表2　7個候選內參基因擴增特性Table 2　Amplicon characteristics of seven candidate reference genes

2.2候選內參基因的表達水平分析

7個候選內參基因在不同組織中的Ct值平均為13.395～26.259（圖1），其中Of18S在所有樣品中的轉錄水平最高，Ct值最小（13.395）；而OfTUB基因的表達水平最低，Ct值最大（26.259）。從表達量變異系數看，OfRAN1最小，然后是OfUBC2，而OfIDH最大。

2.3候選內參基因的表達穩定性分析

本研究首先采用geNorm軟件對7個候選內參基因的表達穩定性進行分析（圖2），結果顯示：在不同組織中，OfRAN1和OfUBC2基因的基因表達穩定值（M）最小（M=0.014 8），表示這2個基因表達最為穩定，其次是OfACT（M=0.038 4）和OfEF1α （M=0.045 3）。OfIDH，OfTUB和Of18S是穩定性排序靠后的3個候選內參基因，其中Of18S的M值最大（M=0.158 1），是最不穩定內參基因。

圖1　不同組織中7個候選內參基因的平均Ct值Figure 1　Mean Ctvalues of seven candidate reference genes in different tissues

利用geNorm程序對內參基因的配對差異值Vn/n+1進行分析（圖3），發現所檢測的V2/3低于程序默認取舍值0.15，說明無需引入第3個基因進行校正，因此選擇表達最為穩定的2個內參基因即OfRAN1和OfUBC2，以兩者的幾何平均值作為參照可更為準確地校正目的基因的表達。

圖2　geNorm軟件分析7個候選內參基因的表達穩定值（M）Figure 2　Expression stability values（M）of seven candidate reference genes as calculated by geNorm

圖3　geNorm軟件分析7個候選內參基因的配對差異值（VPV）Figure 3　Pairwise variation　（VPV）of seven candidate reference genes as calculated by geNorm

此外，為保證結果分析的準確性，本研究還利用NormFinder和BestKeeper分析7個候選內參基因的表達穩定性（表3），結果顯示：NormFinder和BestKeeper的分析結果與geNorm分析的結果整體上一致。通過3個軟件評價得到的穩定性排序中，OfRAN1和O-fUBC2均是表達穩定性最高的2個基因，其次是OfACT和OfEF1α，表明這2個基因在不同組織中的表達較為穩定。而根據3個軟件的分析，OfIDH，OfTUB和Of18S是表達穩定性最差的3個候選內參基因。綜合3個軟件對最佳內參基因和最差內參基因的評價（表4），得到不同組織中最佳內參基因為OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差內參基因。

表3　NormFinder和BestKeeper分析7個候選內參基因的表達穩定性Table 3　Gene expression stability of seven candidate reference genes by NormFinder and BestKeeper

2.4桂花OfCRTISO1基因驗證內參基因穩定性

為了驗證篩選的最佳內參基因穩定性是否準確，我們利用不同內參基因或組合校正桂花不同組織中OfCRTISO1基因的相對表達（圖4）。選擇OfRAN1，OfUBC2，OfRAN1 和OfUBC2基因組合進行校正的OfCRTISO1基因表達模式相同，均在盛開花序中表達量顯著高于其他組織，在花蕾、嫩葉和成熟葉中的表達量相同，而在1年生莖中表達量最低。以穩定性較差的其他內參基因進行校正時，OfCRTISO1基因表達模式產生變化。上述結果表明：3個軟件對內參基因表達穩定性的排序結果可靠，證實OfRAN1和OfUBC2為不同組織中最佳內參基因。

表4　最佳內參基因和最差內參基因綜合結果Table 4　Aggregated result of the optimal and worst reference genes

3　討論

理想的內參基因應在不同的基因型、不同發育階段、不同組織器官、不同脅迫條件下均恒定表達，但事實上，并沒有一個基因在所有試驗條件下能穩定表達［15］，因此，需要根據不同試驗材料和不同試驗處理條件下篩選合適的內參基因。本研究通過對7個候選內參基因在5個不同組織中的表達穩定性進行研究，篩選得到桂花不同組織中最佳內參基因為OfRAN1和OfUBC2，為后續桂花不同組織中目標基因表達規律的研究奠定了基礎。

圖4　不同內參基因或組合校正桂花不同組織中OfCRTISO1基因的相對表達Figure 4　Relative expression levels of OfCRTISO1 in different tissues using different reference genes or reference gene combination for normalization

目前，3個統計分析軟件geNorm，NormFinder和BestKeeper常用于確定不同植物材料或試驗條件下最佳的內參基因［6，13，16-17］。然而，3個軟件在許多物種中的分析結果存在差異，如芝麻Sesamum indicum［6］，黃花蒿Artemisia annua［18］和牛奶子Elaeagnus umbellata［19］。在本研究中，3個軟件的分析結果整體排序一致（圖2和表3）。OfRAN1和OfUBC2基因在geNorm和NormFinder的穩定性排序中并列第一，而Best-Keeper軟件評價OfRAN1為表達最為穩定的內參基因，OfUBC2基因以微弱差距排列第二。綜合3個軟件分析結果確定OfRAN1和OfUBC2基因為桂花不同組織中最佳內參基因。有研究證實：選擇2個或2個以上的內參基因作參照，可以減弱單一內參變化的影響，不同內參表達的相似性有助于增加結果的可靠度及精確度［3，20-21］，因此確定OfRAN1和OfUBC2基因組合為桂花不同組織中表達分析的內參基因可更為準確地校正桂花不同組織中目的基因的表達結果。

RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白家族的一類，在真核生物進化過程中比較保守，在許多細胞生理進程過程中發揮著重要的作用［22-24］。RAN同源基因RAN3，是金魚草Antirrhinum majus中qRTPCR分析常用的內參基因［25-26］。通過對矮牽牛Petunia hybrida開花過程中相關候選內參基因的篩選，證實RAN1是矮牽牛中穩定表達的內參基因之一［27］。與ACT，EF1α和TUB等其他傳統內參基因相比，將RAN基因作為內參基因進行研究和應用的報道較少。本研究證實RAN1在桂花不同組織中穩定表達，是最佳內參基因之一。此外，RAN1被證實是桂花不同品種中表達量最為穩定的內參基因［13］。與RAN基因相同，OfUBC2在桂花不同組織中也穩定表達，是另一個最佳內參基因。作為一個傳統內參基因，UBC基因在擬南芥Arabidopsis thaliana［28-30］，月季Rosa hybrida［31］，側柏Platycladus orientalis［32］等物種的內參基因篩選中均表現最佳。

本研究發現Of18S在桂花不同組織中表達最不穩定，不適合作為內參基因在桂花中應用。同樣，在丹參Salvia miltiorrhiza［33］，牡丹Paeonia suffruticosa［34］，大白菜Brassica rapa ssp.pekinensis［8］和西瓜Citrullus lanatus［16］中，Of18S基因也被證實是表達最不穩定的內參基因。這可能與18S基因在樣品中高豐度表達有關。

［1］BUSTIN S A.Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR（RT-PCR）：trends and problems［J］. J Mol Endocrinol，2002，29（1）：23-39.

［2］ANDERSEN C L，JENSEN J L，?RNTOFT T F.Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets［J］.Cancer Res，2004，64（15）：5245-5250.

［3］VANDESOMPELE J，de PRETER K，PATTYN F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］.Genome Biol，2002，3（7）：research0034.doi：10.1186/ gb-2002-3-7-research 0034.

［4］ZHANG Chao，FU Jianxin，WANG Yanjie，et al.Glucose supply improves petal coloration and anthocyanin biosynthesis in Paeonia suffruticosa‘Luoyang Hong’cut flowers［J］.Postharvest Biol Technol，2015，101：73-81.

［5］BALDERMANN S，KATO M，KUROSAWA M，et al.Functional characterization of a carotenoid cleavage dioxygenase 1 and its relation to the carotenoid accumulation and volatile emission during the floral development of Osmanthus fragrans Lour.［J］.British J Pharmacol，2010，61（11）：2967-2977.

［6］WEI Libin，MIAO Hongmei，ZHAO Ruihong，et al.Identification and testing of reference genes for Sesame gene expression analysis by quantitative real-time PCR［J］.Planta，2013，237（3）：873-889.

［7］WANG Tao，HAO Ruijie，PAN Huitang，et al.Selection of suitable reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction in Prunus mume during flowering stages and under different abiotic stress conditions［J］.J Am Soc Hortic Sci，2014，139（2）：113-122.

［8］XU Xiaoyong，YANG Zeping，SUN Xilu，et al.Selection of reference genes for quantitative real-time PCR during flower bud development in CMS7311 of heading Chinese cabbage（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）［J］.Acta Physiol Plant，2014，36（3）：809-814.

［9］THELLIN O，ZORZI W，LAKAYE B，et al.Housekeeping genes as internal standards：use and limits［J］.J Biotechnol，1999，75（2/3）：291-295.

［10］THELLIN O，ELMOUALIJ B，HEINEN E，et al.A decade of improvements in quantification of gene expression and internal standard selection［J］.Biotechnol Adv，2009，27（4）：323-333.

［11］GUéNIN S，MAURIAT M，PELLOUX J，et al.Normalization of qRT-PCR data：the necessity of adopting a systematic，experimental conditions-specific，validation of references［J］.J Exp Bot，2009，60（2）：487-493.

［12］MUKESH J，AASHIMA N，TYAGI A K，et al.Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time PCR［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345（2）：646-651.

［13］ZHANG Chao，FU Jianxin，WANG Yiguang，et al.Identification of suitable reference genes for gene expression normalization in the quantitative real-time PCR analysis of sweet osmanthus（Osmanthus fragrans Lour.）［J］.PLoS One，2015，10（8）：e0136355.doi：10.1371/journal.pone.0136355.

［14］PFAFFL M W，TICHOPAD A，PRGOMET C，et al.Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity：BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations［J］.Biotechnol Lett，2004，26（6）：509-515.

［15］ARTICO S，NARDELI S M，BRILHANTE O，et al.Identification and evaluation of new reference genes in Gossypium hirsutum for accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data［J］.BMC Plant Biol，2010，10（1）：1-12.

［16］KONG Qiusheng，YUAN Jingxian，GAO Lingyun，et al.Identification of suitable reference genes for gene expression normalization in qRT-PCR analysis in watermelon［J］.PLoS One，2014，9（2）：e90612.doi：10.1371/journal.pone. 0090612.

［17］ZHONG Haiying，CHEN Jianwen，LI Caiqin，et al.Selection of reliable reference genes for expression studies by reverse transcription quantitative real-time PCR in litchi under different experimental conditions［J］.Plant Cell Rep，2011，30（4）：641-653.

［18］周良云，莫歌，王升，等.基于實時熒光定量PCR對鎘處理下黃花蒿內參基因穩定性的分析［J］.中國中藥雜志，2014，39（5）：777-784.ZHOU Liangyun，MO Ge，WANG Sheng，et al.Stability analysis of reference gene based on real-time PCR in Artemisia annua under cadmium treatment［J］.Chin J Chin Mat Med，2014，39（5）：777-784.

［19］成龍平，胡海濤，郭衛東，等.牛奶子實時定量PCR分析中內參基因的評價與驗證［J］.林業科學，2015，51（5）：135-144. CHENG Longping，HU Haitao，GUO Weidong，et al.Evaluation and validation of potential reference genes for quantitative real-time PCR analysis in Elaeagnus umbellata［J］.Sci Silv Sin，2015，51（5）：135-144.

［20］REID K E，OLSSON N，SCHLOSSER J，et al.An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development［J］.BMC Plant Biol，2006，6（1）：27. doi：10.1186/1471-2229-6-27.

［21］MIGOCKA M，PAPIERNIAK A.Identification of suitable reference genes for studying gene expression in cucumber plants subjected to abiotic stress and growth regulators［J］.Mol Breed，2011，28（3）：343-357.

［22］CICIARELLO M，MANGIACASALE R，LAVIA P.Spatial control of mitosis by the GTPase Ran［J］.Cell Mol Life Sci Cmls，2007，64（15）：1891-1914.

［23］DI FIORE B，CICIARELLO M，LAVIA P.Mitotic functions of the Ran GTPase network：the importance of being in the right place at the right time［J］.Cell Cycle，2004，3（3）：303-311.

［24］XU Peipei，CAI Weiming.RAN1 is involved in plant cold resistance and development in rice（Oryza sativa）［J］.J Exp Bot，2014，65（12）：3277-3287.

［25］DELGADO-BENARROCH L，CAUSIER B，WEISS J，et al.FORMOSA controls cell division and expansion during floral development in Antirrhinum majus［J］.Planta，2009，229（6）：1219-1229.

［26］MELANIE B，HURT S，KURT F，et al.Characterization of Antirrhinum petal development and identification of target genes of the class B MADS box gene DEFICIENS［J］.Plant Cell，2004，16（12）：3197-3215.

［27］MALLONA I，LISCHEWSKI S，WEISS J，et al.Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during leaf and flower development in Petunia hybrida［J］.BMC Plant Biol，2010，10（1）：200-203.

［28］REMANS T，SMEETS K K，MATHIJSEN D，et al.Normalisation of real-time RT-PCR gene expression measurements in Arabidopsis thaliana exposed to increased metal concentrations［J］.Planta，2008，227（6）：1343-1349.

［29］SWIEZEWSKI S，LIU Fuquan，MAGUSIN A，et al.Cold-induced silencing by long antisense transcripts of an Arabidopsis polycomb target［J］.Nature，2009，462（7274）：799-802.

［30］DEKKERS B J W，LEO W，BASSEL G W，et al.Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds［J］.Plant Cell Physiol，2012，53（1）：28-37.

［31］KLIE M，DEBENER T.Identification of superior reference genes for data normalisation of expression studies via quantitative PCR in hybrid roses（Rosa hybrida）［J］.BMC Res Not，2011，4（1）：518.doi：10.1186/1756-0500-4-518.

［32］CHANG Ermei，SHI Shengqing，LIU Jianfeng，et al.Selection of reference genes for quantitative gene expression studies in Platycladus orientalis（Cupressaceae）using real-time PCR［J］.PLoS One，2012，7（3）：e33278.doi：10.1371/journal.pone.0033278.

［33］YANG Yanfang，HOU Shuang，CUI Guanghong，et al.Characterization of reference genes for quantitative real-time PCR analysis in various tissues of Salvia miltiorrhiza［J］.Mol Biol Rep，2010，37（1）：507-513.

［34］王彥杰，董麗，張超，等.牡丹實時定量PCR分析中內參基因的選擇［J］.農業生物技術學報，2012，20（5）：521 -528. WANG Yanjie，DONG Li，ZHANG Chao，et al.Reference gene selection for real-time quantitative PCR normalization in tree peony（Paeonia suffruticosa Andr.）［J］.J Agric Biotechnol，2012，20（5）：521-528.

Reference gene selection for quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）normalization in the gene expression of sweet osmanthus tissues

FU Jianxin1，ZHANG Chao1，WANG Yiguang1，ZHAO Hongbo1，2
（1.School of Landscape Architecture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China；2.The Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

To select the suitable reference gene（s）for gene expression analysis in different tissues of Osmanthus fragrans，five tissues：buds，fully-opened inflorescences，young leaves，adult leaves，and one-year-old stems，from O.fragrans‘Yanhong Gui’were used as materials to detect the expression levels of seven candidate reference genes by quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Then，an aggregated analysis of gene expression stability for these candidates was conducted using three software programs：geNorm，NormFinder，and BestKeeper.Finally，the relative expression level of OfCRTISO1 in different tissues was analyzed to verify the reference genes selected in this study.Results of the aggregated analysis showed that OfRAN1 and OfUBC2 were the best reference genes from the different tissues，and Of18S was the worst reference gene.In addition，analysis of the relative expression level for OfCRTISO1 confirmed that OfRAN1 and O-fUBC2 were the two most stable reference genes in the qRT-PCR analysis of the tissues，and the application of OfRAN1 and OfUBC2 was enough to achieve more accurate and reliable results in these tissues.Thus，the pre-sent study has provided an important reference for analyzing the expression of key genes in different tissues of O.fragrans.［Ch，4 fig.4 tab.34 ref.］

botany；Osmanthus fragrans；reference gene；geNorm；NormFinder；BestKeeper

S687

A

2095-0756（2016）05-0727-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.001

2015-09-10；

2016-04-19

國家自然科學基金資助項目（31501790，31170656）；浙江省自然科學基金資助項目（LQ15C160004）；浙江農林大學科研發展基金人才啟動項目（2014FR072）

付建新，講師，博士，從事園林植物遺傳育種和分子生物學研究。E-mail：fujianxin2008@sohu.com。通信作者：趙宏波，教授，博士，從事觀賞植物遺傳育種和植物繁殖生態研究。E-mail：zhaohb@zafu.edu.cn

浙 江 農 林 大 學 學 報，2016，33（5）：727-733

Journal of Zhejiang A＆F University