添加糖化酶和酵母菌對24.0℃條件下啟動豆粕固體發酵的影響

陳雷，李杰*，張劉運，王立群，齊虹，李馬成，徐長躍

（1.東北農業大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省華森畜牧科技有限公司，黑龍江哈爾濱150030）

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添加糖化酶和酵母菌對24.0℃條件下啟動豆粕固體發酵的影響

陳雷1，李杰1*，張劉運2，王立群2，齊虹2，李馬成1，徐長躍1

（1.東北農業大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省華森畜牧科技有限公司，黑龍江哈爾濱150030）

本試驗選用枯草芽孢桿菌發酵豆粕，研究24.0℃條件下添加糖化酶和酵母菌對啟動豆粕固體發酵的影響。試驗分為A（對照）、B、C、D組，A組啟動發酵溫度為32.0℃，B、C、D組啟動發酵溫度分別為23.7、24.4、24.0℃，其中B組不添加升溫物質，C組添加2‰糖化酶，D組添加2‰糖化酶+1‰酵母菌。測定發酵過程中溫度、pH值的變化，以及發酵后豆粕的營養成分和抗營養因子變化。結果表明：D組發酵過程中升溫速度比B、C組快，但低于對照組；D組發酵后粗蛋白質含量較對照組提高1.14%（P＞0.05）；小肽含量降低1.72%（P＞0.05），抗營養因子中脲酶和胰蛋白酶抑制因子含量分別降低48.67%（P＜0.05）和27.71%（P＞0.05）。試驗表明，在24.0℃條件下啟動豆粕固體發酵，通過添加2‰糖化酶＋1‰酵母菌，可以使發酵溫度得到較快提升，能夠節約一定的能源。

發酵豆粕；溫度；營養成分；抗營養因子

發酵豆粕是一種優質的植物性蛋白飼料，與未發酵的豆粕相比，具有抗營養因子明顯降低、常規營養成分得到改善、富含多種活性因子、適口性好、抗菌能力強等營養特性。戚薇和唐翔宇（2008）采用固體發酵法發酵豆粕，菌種為納豆芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌，兩種菌的比例為1∶1，發酵后豆粕的蛋白水解度為20.14%，胰蛋白酶抑制因子比發酵前降低了95%，發酵后豆粕中含有蛋白酶、乳酸、小肽等活性因子。發酵豆粕在畜禽生產中應用廣泛，可以提高畜禽生產性能，改善腸道功能，降低仔豬腹瀉率等。馮杰等（2007）研究發現，在仔豬日糧中添加發酵豆粕，飼料增重比、腹瀉指數、血清尿素氮分別降低8.39%（P＜0.05）、39.96%（P＜0.01）、39.47%（P＜0.01）。

菌種生長繁殖的適宜溫度在35℃左右，所以豆粕發酵的啟動溫度應該在30℃以上，在北方地區由于氣候寒冷，想要達到與南方相同的發酵啟動溫度，就需要消耗更多的能源。本試驗根據北方地區寒冷的氣候特點，用枯草芽孢桿菌啟動豆粕固體發酵，通過在豆粕培養基中添加糖化酶和酵母菌，研究其對24.0℃條件下啟動豆粕固體發酵的影響。

1　材料與方法

1.1試驗材料菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌。豆粕、米糠、糖蜜、菌體蛋白等由黑龍江華森畜牧科技有限公司提供。

液體種子培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖5 g，水1000 mL，121℃滅菌15 min。

豆粕培養基：豆粕870 kg，米糠60 kg，菌體蛋白80 kg，尿素15 kg，糖蜜40 L，水400 L。

1.2試驗方法固體發酵選擇枯草芽孢桿菌為發酵菌種，糖化酶和酵母菌作為升溫物質。試驗共分為4組（A、B、C、D），每組分別添加2‰的芽孢桿菌，A組選擇32.0℃作為發酵啟動溫度，即對照組，B、C、D組發酵啟動溫度分別為23.7、24.4、24.0℃，對照組的啟動溫度為較高溫度水混合豆粕培養基后的溫度，試驗組的啟動溫度為較低溫度水混合豆粕培養基后的溫度，其中B組不添加升溫物質，C組在豆粕培養基中添加2‰糖化酶，D組在添加糖化酶基礎上額外添加1‰的酵母菌。每組進行3個重復，每個重復發酵1 t豆粕。

本試驗先將豆粕、米糠、菌體蛋白、尿素等培養基鋪于地面，培養好的菌種加到水中活化0.5 h，待菌種活化后，將糖蜜、糖化酶加到水中溶解，最后和豆粕培養基混勻。每噸豆粕培養基混勻后分別為長3 m、上寬1 m、下寬1.5 m、高0.8 m的梯形體。每隔4 h測定一次發酵過程中溫度變化，每隔8 h取一次樣，測定發酵過程中pH值的變化。分別于豆粕培養基的正中間取樣，以及距離中間各0.75 m共三個點取三次樣，然后混勻。由于枯草芽孢桿菌屬于好氧菌種，待發酵溫度上升到50℃以上，對豆粕培養基翻一次料，給芽孢桿菌補充氧氣，當發酵溫度再次上升到50℃以上，發酵結束。發酵結束后，測定濕樣的菌數和pH值，然后將濕樣放入烘箱中65℃烘干，粉碎過60目篩，分別測得各組豆粕發酵后的營養成分和抗營養因子的變化。

1.3測定指標及方法粗蛋白質測定方法為采用國家標準GB/T 6432-1994的凱氏定氮法。小肽測定方法為國家飼料大豆肽粉標準QB/T 2653-2004。粗灰分測定方法為采用國家標準GB/T 6438-1992的灼燒法。粗纖維測定方法為采用國家標準GB/T 6434-1994的酸堿法。氨基酸測定方法采用國家標準GB/T 18246-2000。有益菌活菌數采用涂平板法。溫度采用電子溫度計測定。pH值用pH計測定。胰蛋白酶抑制因子采用BAPNA法測定。脲酶活性采用滴定法測定。

1.4數據統計試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，測定結果以“平均值±標準差”表示。

2　結果

2.1豆粕發酵過程中溫度的變化由圖1可知，對照組啟動溫度較高為32.0℃，試驗組啟動溫度較低，分別為23.7、24.4、24.0℃。發酵開始后由于室溫低于20℃，所以發酵溫度有小幅的降低，發酵8 h以后，溫度開始逐漸升高，對照組由于啟動溫度較高，24 h后溫度達到51.4℃，比試驗組提前16 h進行翻料，翻料之后發酵溫度降低到45.2℃，40 h后溫度上升到53.0℃，之后溫度保持穩定；C、D組發酵24 h后溫度到達30℃以上，到達30℃以后，D組比B、C組升溫較快，發酵40 h后D組溫度達到51.2℃，64 h之后發酵溫度上升到56.0℃，發酵時間多于對照組24 h。

圖1　豆粕發酵過程中的溫度變化

2.2豆粕發酵過程中pH值的變化由圖2可知，對照組和試驗組起始pH值分別為6.34、6.20、6.46、6.72。在發酵的開始階段，pH值上升，到16 h之后D組pH值上升到最高，為8.40，B、C組和對照組pH值在32 h后上升到最大，分別為8.06、7.42、7.68。隨著發酵的進行，各組pH值開始下降，其中對照組pH值下降的最快，發酵結束之后pH值分別為5.86、5.78、5.56、5.70，各組之間差異不大。

圖2　豆粕發酵過程中pH值的變化

2.3豆粕發酵后營養成分的變化由表1可知，豆粕發酵后粗蛋白質、小肽含量均極顯著高于發酵前含量（P＜0.01）。D組粗蛋白質含量與對照組相比，提高1.14%（P＞0.05）；各試驗組小肽含量分別較對照組降低6.24%、2.90%、1.72%，其中D組小肽含量高于B組4.82%（P＜0.05）；發酵后各組菌數、粗灰分、粗纖維、水分含量差異均不顯著（P＞0.05）。

表1　豆粕發酵后營養成分的變化

2.4豆粕發酵后氨基酸含量的變化由表2可知，發酵后大部分氨基酸含量均有所提高，其中提高較多的有谷氨酸、蛋氨酸和丙氨酸，而胱氨酸、精氨酸等有小幅降低。發酵后各組氨基酸總量分別提高了5.41%、8.06%、0.72%、4.58%。試驗組和對照組相比，C組氨基酸總量分別低于其他三組4.44%、6.79%、3.69%，B組氨基酸總量最高，高于對照組2.52%，D組低于對照組0.78%。

表2　豆粕發酵后氨基酸含量的變化

2.5豆粕發酵后抗營養因子的變化由表3可知，發酵后豆粕中的脲酶和胰蛋白酶抑制因子的含量均極顯著低于發酵前（P＜0.01）。發酵后各組相比，D組中脲酶含量降低最多，分別低于其他三組48.67%、40.82%、53.23%；發酵后各組中胰蛋白酶抑制因子比發酵前分別降低了32.46%、56.24%、47.95%、51.17%，D組和對照組相比，降低27.71%（P＞0.05）。

表3　豆粕發酵后抗營養因子的變化

3　討論

3.1發酵過程中溫度、pH值的變化本試驗結果表明，對照組的發酵溫度上升速度快于各試驗組，這主要由于對照組啟動發酵的溫度為32.0℃，適于菌種生長和繁殖，各試驗組之間在發酵開始階段升溫變化不大，當發酵溫度上升到30℃以后，C組比B組升溫快，這主要是由于30℃之后，糖化酶將豆粕中的碳水化合物分解為葡萄糖等單糖，釋放能量，從而使發酵溫度升高。王衛國等（1996）研究表明，糖化酶的最適溫度為32℃，加酶量為0.2%，主要發酵周期能夠縮短2～3 d。本試驗D組升溫比B、C組快，這主要是由于酵母菌在呼吸過程中產熱。張紅和褚西寧（1996）認為，由于酵母菌進行呼吸作用，消耗了部分有機物而產生熱量，從而使溫度升高。發酵結束后，D組發酵溫度上升到56.0℃，試驗組的發酵時間多于對照組24 h。豆粕發酵開始階段各組pH值都有所上升，有可能是因為菌體在繁殖代謝過程中產生了一些使pH值升高的物質，隨著發酵的進行pH值開始降低，這是因為芽孢桿菌在繁殖過程中產生有機酸類物質，使發酵豆粕的pH值降低。發酵結束后，各組pH值差異不大。

3.2發酵過程中營養成分的變化發酵豆粕與普通豆粕相比，營養成分得到改善，并且富含多種活性因子。蔡國林等（2008）發現，用酵母菌和乳酸菌發酵豆粕，發酵后粗蛋白質的含量為49.7%，比發酵前提高了3.5%。吳勝華等（2009）用酵母菌發酵豆粕，小肽含量由1.6%上升到8.7%。Hong等（2004）研究發現，發酵后豆粕中的大分子蛋白有一部分降解為小于20 kDa的小分子肽類。本試驗結果表明，豆粕發酵后各組粗蛋白質含量均顯著高于發酵前（P＜0.01），這主要是由于微生物在繁殖代謝過程中利用了豆粕中的碳水化合物，出現了蛋白質的“濃縮效應”（湯紅武等，2003）。試驗組和對照組相比，粗蛋白質含量差異不顯著（P＞0.05）；發酵后各組小肽含量均顯著高于發酵前（P＜0.01），主要是由于在發酵過程中菌體產生蛋白酶，將豆粕中的一部分大分子蛋白分解為小分子肽類，從而提高了發酵豆粕中小肽含量，發酵后各組間相比，試驗D組小肽含量低于對照組1.72%（P＞0.05）；發酵后各組粗纖維、菌數、粗灰分和水分含量相比，并沒有顯著差異（P＞0.05）。

3.3發酵過程中氨基酸含量的變化由于微生物在發酵過程中會產生降解大分子蛋白的酶類，不僅蛋白質含量提高，也增加了氨基酸含量。楊旭等（2008）發現豆粕發酵后，賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸含量分別增加了16.28%、17.01%、56.41%，17種氨基酸總量比發酵前增加了6.58%。馬文強等（2008）研究發現，用枯草芽孢桿菌發酵豆粕后大部分氨基酸含量有所增加，氨基酸總量增加了11.49%。Refstie等（2001）發現，用乳酸菌發酵豆粕，發酵后蛋氨酸、蘇氨酸和纈氨酸含量有所提高，亮氨酸、苯丙氨酸等含量有所下降。本試驗結果表明，發酵后大部分氨基酸含量有所提高，氨基酸總量比發酵前分別提高了5.41%、8.06%、0.72%、4.58%；發酵后各組相比，C組氨基酸總量提高較少，D組低于對照組0.78%，但差異不大。

3.4發酵過程中抗營養因子的變化大量研究表明，豆粕經過微生物發酵后，其中的抗營養因子如胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、植酸等含量大大降低或完全消除。抗營養因子通過微生物降解的途徑主要有兩種：（1）微生物在生長繁殖過程中，消耗利用了一些非蛋白類抗營養因子，如植酸、低聚糖等；（2）微生物自身分泌的蛋白酶可分解豆粕中的蛋白類抗營養因子，如大豆抗原蛋白、胰蛋白酶抑制因子、脲酶等。張麗靖等（2008）研究發現，在適宜的條件下發酵豆粕，脲酶活性比發酵前降低了93%。鄭裴等（2009）用乳酸菌發酵豆粕，測得抗營養因子中脲酶活性由發酵前的0.373 U/g降到發酵后的0.166 U/g，胰蛋白酶抑制因子含量由40.42 mg/g降到18.01 mg/g。本試驗結果表明，發酵后豆粕中的脲酶和胰蛋白酶抑制因子含量均顯著低于發酵前（P＜0.01）；發酵后各組相比，D組脲酶含量低于對照組48.67%（P＜0.05），低于C組53.23%（P＜0.05）；發酵后各組胰蛋白酶抑制因子含量相比，差異不顯著（P＞0.05）。

4　結論

本試驗結果表明，在24.0℃條件下通過添加2‰糖化酶和1‰酵母菌，能使豆粕發酵溫度較快提升，雖然發酵時間多于對照組，但能夠節約一定的能源。

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This experiment was conducted to study the effects of adding glucoamylase and yeast on starting the soybean meal solid fermentation by bacillus subtilis in the condition of 24.0℃.The temperature for starting the fermentation of group A（the control）was 32.0℃，the temperatures of groups B，C，D were 23.7，24.4，24.0℃，group B wasn’t added heating substance，group C was added 2‰glucoamylase，group D was added 2‰glucoamylase＋1‰yeast.The changes of temperature and pH during the fermentation process，nutrient contents and anti-nutritional factors after fermentation were measured.The results showed as follows：The heating rise of group D during the fermentation was faster than group B，C，but lower than the control group；after fermentation，compared with the control group，the crude protein content of group D was increased by 1.14%（P＞0.05），the small peptide content was reduced by 1.72%（P＞0.05）；the urease and trypsin inhibitor content were reduced by 48.67%（P＜0.05）and 27.71%（P＞0.05）.The results indicated that：To start the soybean meal solid fermentation in the condition of 24.0℃，the fermentation temperature had been rapidly increased by adding 2‰glucoamylase＋1‰yeast，it could save some energy.

fermented soybean meal；temperature；nutrient contents；anti-nutritional factors

S816.7

A

1004-3314（2016）05-0021-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160505

提高北方寒區優質蛋白飼料（發酵豆粕）產能關鍵技術和產品開發（2013G0173）