rhBMP-2對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血恢復的促進作用

高巧艷， 王 靖， 邢萬里， 戴 凱， 劉昌勝（華東理工大學材料科學與工程學院，教育部醫用生物材料工程研究中心，上海 200237）

rhBMP-2對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血恢復的促進作用

高巧艷， 王 靖， 邢萬里， 戴 凱， 劉昌勝
（華東理工大學材料科學與工程學院，教育部醫用生物材料工程研究中心，上海 200237）

探究了人重組骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）對再障小鼠的治療作用。采用5-FU聯合白消安建立小鼠再障模型，通過干預rhBMP-2進行治療。考察了各實驗組小鼠白細胞數、骨髓單核細胞數、體重、存活率、脾系數、粒系-巨系細胞集落（CFU-GM）數以及骨髓單核細胞中CD34＋細胞比例，進行股骨、脾臟HE切片分析。結果表明，相較于再障對照組，rhBMP-2治療組小鼠的白細胞數、存活率、CFU-GM集落數及骨髓單核細胞數顯著提高，并且骨髓單核細胞中的CD34＋細胞含量也提高，顯著改善脾臟功能和緩解骨髓抑制，證實rhBMP-2能夠促進再障小鼠造血損傷的修復。

重組人骨形態發生蛋白-2；再生障礙性貧血；造血損傷修復

再生障礙性貧血（Aplastic Anemia，AA）簡稱再障，是一種嚴重的血液病。它是由多種因素引發的造血障礙，導致造血組織減少，骨髓造血功能衰竭，以骨髓造血細胞增生減低和全血細胞減少為主要表現。再障可分為先天性再障和獲得性再障。據統計國內的再障發病率為7.4×10－6，其中急性重型再障（SAA-I）發病率為1.4×10－6，慢性重型再障（SAA-Ⅱ）為6.0×10－6［1-2］。目前治療再障的方法有造血干細胞移植、骨髓移植、免疫抑制治療、免疫支持治療、細胞因子治療法等。但造血干細胞移植和骨髓移植來源有限，并且要考慮移植物抗宿主疾病，所以應用很有限。所以尋找對人體毒副作用小、治療效果好的治療再障藥物具有重要的意義。

重組人骨形態發生蛋白-2（rh BMP-2）作為已被美國FDA批準用于脊柱融合和脛骨骨折臨床治療［3］的轉化生長因子，因其具有優異的誘導間質細胞分化為骨和軟骨細胞的特性［4］而備受關注。近年來的相關研究表明，BMP-2在機體造血發生過程中也有作用。田瓊等［5-6］研究表明，rhBMP-2可減輕γ射線輻射及化療藥物CTX所致的急性造血損傷，具有治療修復造血損傷的潛能；同時趙瑋欽等［7］研究發現重組人骨形成蛋白成熟肽-4及重組人骨形成蛋白-4二連體對損傷造血系統修復有明顯的促進作用。本文通過建立小鼠再障造血損傷模型，探究了rhBMP-2在再障造血損傷修復中的作用。

1　材料和方法

1.1主要試劑

rh BMP-2購自上海瑞邦生物材料有限公司；FITC Rat Anti-Mouse CD45、PE Rat Anti-Mouse CD34購自優寧維生物科技有限公司；小鼠單系集落甲基纖維素培養基購自北京安普生化科技有限公司；五氟尿嘧啶、白消安購自西安科創藥業有限公司；紅細胞裂解液（Tris-NH4Cl）購自碧云天生物科技有限公司；多聚甲醛購自上海凌峰化學試劑有限公司；溶血素、HB含酶清洗液購自南京普朗醫用設備有限公司。

1.2主要儀器

FACs Calibur流式細胞儀購自美國BD公司；TE2000-U倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；XFA 6130血細胞分析儀購自南京普朗醫療設備有限公司；5415R低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；AB104-N電子分析天平購自梅特勒托儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1再生障礙性貧血動物模型建立 Balb/C小鼠腹腔注射五氟尿嘧啶（5-FU）200μL（150 mg/kg），2 d后腹腔注射白消安200μL（15 mg/kg），每周1次，連續3周，建立小鼠再生障礙性貧血模型。1.3.2 實驗動物及分組 SPF級Balb/C小鼠90只，雄性，18～20 g，鼠齡6～8周，購自上海中醫藥大學。所有動物適應性飼養觀察3 d后隨機分為3組，每組30只，正常飼養，自由攝食和飲水。其中A組（Normal）：空白對照組，腹腔注射磷酸緩沖溶液（PBS）；B組（BMP）：rhBMP-2組，按1.3.1節的方法造模1周后，連續2周腹腔注射rhBMP-2（BMP），每只小鼠每天的劑量為50μg；C組（AA）：再障對照組，按1.3.1節的方法造模1周后，連續2周腹腔注射PBS；各小鼠注射體積均為每天100μL。

各組小鼠在建模4周后全部處死檢測。

1.3.3外周血白細胞（WBC）檢測 造模前取1次血，造模后每周取1次血，檢測白細胞數。方法如下：使用毛細玻璃管在小鼠右眼眼眶取血約50μL，采用質量分數3%的EDTA-K2溶液抗凝，然后用血細胞分析儀檢測WBC數量。

1.3.4脾系數的檢測 造模后第4周，檢測脾系數。方法如下：處死前對小鼠先稱重記錄，處死后解剖取出脾臟并稱重，脾系數=脾臟質量/體重。

1.3.5股骨骨髓單核細胞數（BMNC）檢測 脫頸法處死小鼠，在體積分數為75%乙醇中浸泡5 min，在無菌環境下取出股骨，用5 m L的注射器吸取PBS，從股骨一端沖洗，沖洗液用4號針頭過濾，再用400目（38μm）的無菌紗布過濾，離心去上清后加入Tris-NH4Cl，室溫靜止5 min，再次離心，棄上清，PBS重懸，過濾后調整濃度，顯微鏡下計數。

1.3.6粒系-巨系細胞集落（CFU-GM）形成測定

將1.3.5節中制備的骨髓單核細胞懸液在無菌環境下，離心加入100μL培基，制成細胞懸液。于1 m L甲基纖維素培養基中加入10μL細胞懸液，分散均勻后，轉移至24孔板，于37℃、φ=5%CO2、培養箱中培養14 d后，顯微鏡下計數，超過50個細胞的細胞簇為一個集落。

1.3.7小鼠骨髓細胞中CD34＋細胞比例變化分析

將1.3.5節中制備的骨髓單核細胞懸液調整濃度至2×106～5×106個/m L，離心去上清，加入CD34抗體10μL。4℃孵育30 min后，用PBS清洗一遍，抗體保存液固定，采用流式細胞儀檢測。

1.3.8小鼠脾臟和股骨組織形態學觀察 實驗取出小鼠雙側股骨，用甲醛（w=10%）固定，脫鈣，浸蠟包埋；脾臟，迅速用甲醛固定，浸蠟包埋，矢裝面切片（3 μm），HE染色，觀察骨髓細胞的變化。

2　統計學分析

應用Origin 8.0進行數據處理，兩組間比較采用卡方檢驗，檢測數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。

3　實驗結果

3.1rhBMP-2對再障小鼠體重、存活率和外周血WBC的影響

表1示出了各實驗組造模后的體重、存活率、WBC變化情況。由表1可看出，造模后1周內，各組均未給予rhBMP-2，此時B組和C組WBC、體重、存活率都顯著低于A組，且B組與C組相比沒有顯著差異，表明建模成功。B組從第2周干預rhBMP-2治療后，WBC和體重都出現上升的趨勢，至第4周時，B組WBC已恢復至正常組的50%左右，體重也達到正常的70%左右。相比較而言，C 組2～4周，體重并未增加，同時WBC不斷下降，死亡率升高。至第4周時，B組的存活率接近C組的2倍。上述結果顯示，rhBMP-2能夠促進再障小鼠的WBC和體重的恢復，同時能提高小鼠的存活率。

表1　各實驗組造模后的體重、存活率和WBC變化Table 1 Weight，survival ratio and WBC change after modeling

3.2rhBMP-2對再障小鼠骨髓單核細胞數和CD34+細胞含量影響

造模4周各組小鼠骨髓單核細胞數如圖1所示。由圖1可以看出，C組小鼠的骨髓單核細胞數只有A組小鼠的20%左右，rhBMP-2干預治療的B組已恢復到A組的50%左右，是C組的2倍左右，B和C兩組間存在顯著性差異（P＜0.05）。同時，骨髓單核細胞中CD34＋細胞的含量見圖2。

圖1　造模4周各組小鼠骨髓單核細胞數（P＜0.05）Fig.1 BMNC values on the fourth week after modeling（P＜0.05）

造模4周后，C組中CD34＋細胞數量只有A組的20%左右，而B組經rh BMP-2治療后已恢復到A組的50%左右，是再障對照組的2.5倍，表明rhBMP-2不但能夠促進再障小鼠的骨髓單核細胞數的提升，而且可以提高再障小鼠骨髓單核細胞中CD34＋細胞的含量。

圖2　造模4周各實驗組的骨髓單核細胞中CD34＋細胞含量（P＜0.05）Fig.2 BMNCs CD34＋ratio in each group on the fourth week after modeling（P＜0.01）

3.3 rhBMP-2對再障小鼠骨髓CFU-GM形成的影響

造模4周骨髓CFU-GM集落計數如圖3所示。由圖3可以看出，注射rhBMP-2的B組小鼠骨髓細胞體外培養的CFU-GM集落數已恢復到A組的25%左右，而C組只有A組的14%左右，B組是C組的1.8倍，兩者有明顯差異（P＜0.05）。同時圖4示出了各組骨髓細胞體外培養CFU-GM的照片。可以看出正常組A組的集落形貌明顯比B組和C組大，且細胞分散也比較集中。B組雖然比A組小，但是細胞分布仍比較集中。而C組的集落不僅小，細胞也較為分散。CFU-GM集落的數量和形貌反應了機體造血干/祖細胞的增殖分化能力。綜合圖3和圖4表明，rhBMP-2能夠促進造血干/祖細胞數量的提高和功能的恢復，促進再障小鼠的骨髓造血功能的改善和重建。

圖3　造模4周骨髓CFU-GM集落計數（P＜0.05）Fig.3 Number of CFU-GM BM on the fourth week after modeling（P＜0.05）

圖4　骨髓細胞體外培養CFU-GM的照片Fig.4 CFU-GM morphology of bone marrow cells

3.4rhBMP-2對再障小鼠脾系數的影響

各組小鼠造模4周脾系數變化如圖5所示。B、C兩組脾系數較A組均下降，B組為A組的53%，C組為A組的38%，表明小鼠脾臟出現損傷，處于萎縮狀態。脾臟的萎縮直接影響小鼠的造血功能，同時還會導致小鼠的免疫力變差，容易感染，這與造模4周后小鼠的存活率變化情況一致。但同時可以發現，rhBMP-2治療組的脾系數是再障對照組的1.4倍，兩者有顯著差別（P＜0.05），說明rh BMP-2在一定程度上提高了再障小鼠的脾系數，促進改善脾臟功能恢復。

3.5組織形態學評價

造模4周后，小鼠股骨HE組織切片的染色結果見圖6。圖6（a）顯示正常小鼠股骨HE染色，骨髓各系分布正常。當骨髓中出現大量脂肪泡時預示著骨髓受到抑制，功能在退化。圖6（b）和（c）示出了B組和C組小鼠的骨髓生長都明顯受到了抑制，骨髓的功能也在退化，但是B組脂肪泡明顯少于C組，說明B組的骨髓抑制程度比C組輕。

圖5　造模4周脾系數值變化（P＜0.05）Fig.5 Spleen coefficient values of each group on the fourth week after modeling（P＜0.05）

圖7示出了造模4周后各實驗組小鼠的脾臟切片。圖7（a）示出的是正常小鼠的脾臟HE切片，未見明顯異常；圖7（b）是注射rhBMP-2的小鼠的脾臟照片，從圖中可以看出脾臟出現局灶性增生；圖7 （c）是再障組的小鼠脾臟切片，可以看出脾臟不僅出現局灶性增生，而且脾臟淋巴組織還出現萎縮。脾臟是人體最大的周圍淋巴樣器官，由紅髓和白髓兩部分構成，發揮著造血和濾血的功能，更是重要的免疫應答、產生免疫效應分子的場所。

圖6　小鼠股骨骨髓組織切片Fig.6 Femoral BM histological evaluation

圖7　小鼠脾臟組織切片Fig.7 Spleen histological evaluation of each group

由組織切片檢查結果可以發現，通過干預rhBMP-2治療，能夠緩解再障小鼠的骨髓抑制造血損傷和改善脾臟功能。

4　分析與討論

距Ehrlich［8］1888年首次報道再障已有100多年的歷史，目前的研究表明再障的發病機制涉及造血微環境異常、造血干/祖細胞缺陷和免疫功能紊亂［9］，同時AA的發生、發展與T細胞功能亢進引起的造血組織損傷也密切相關［10］。目前對再障病因的研究主要集中在關于造血干細胞和造血微環境兩方面［11］。

再障治療一直是血液系統疾病中的難題。SAA的標準療法為有移植治療和聯合免疫抑制治療，首選與人類白細胞抗原（HLA）相合的同胞供體進行同種異體骨髓移植或造血干細胞移植。其中，造血干細胞移植仍是目前兒童和青年重型再生障礙性貧血的一線治療選擇，但存在供體來源有限、費用高等突出問題，且有約5%～15%的患者因為慢性移植物抗宿主病而影響療效和生活質量。當SAA患者無合適供體或者自身不適合移植時主要采用聯合抗人胸腺細胞免疫球蛋白（ATG/ALG）和環孢菌素A（Cs A）的免疫抑制治療（IST）［1，12-13］。聯合IST的強化治療一方面能提高療效，同時可減輕大劑量單一藥物的毒副作用［12］。王方方等［14］研究了使用國產豬抗人淋巴細胞免疫球蛋白（p-ALG）聯合Cs A治療SAA的療效，結果表明此方法作為初診SAA的首次治療方案，在治療期間予以成分輸血、干預細胞因子G-CSF、IL-11及抗感染等輔助支持治療手段，療效顯著，且治療費用較馬或兔抗胸腺免疫球蛋白（ATG）聯合Cs A的方案更為經濟。此外，成分輸血、干預雄性激素、細胞因子以及抗感染治療等作為輔助支持治療手段對再障的治療也發揮著重要的作用，近年來在強化免疫抑制方案基礎上加用造血細胞生長因子［HGFs，包括粒巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）或粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和紅細胞生成素（EPO）］治療SAA 28例，有效率達到85.7%［15］。可見目前的治療方案以強化免疫并輔以細胞因子或其他手段的聯合作用為主。但臨床研究表明，大多數集落細胞因子使用后伴隨發熱、惡心、低血壓、水腫、胸痛、骨痛等不良反應。目前尚未研發出安全有效并可長期應用于治療再障的細胞生長因子［16］。

BMP-2作為TGF-β超家族成員，其在成骨領域的應用已經相當成熟。近年來研究表明BMP對造血的發生和調控也有重要作用［17］，但鮮有將其用于再生障礙型貧血治療的報道。因此，本文對rhBMP-2在再障造血損傷修復中的作用進行了探究。通過5-FU聯合白消安用藥建立小鼠再障造血損傷模型。治療組在建模1周后連續2周腹腔注射rh BMP-2，劑量為50μg/d。本文研究對比了rhBMP-2治療組和再障對照組在造血表征相關指標方面的差異和變化。結果表明，治療4周后，rhBMP-2治療組WBC相比再障對照組提高了3倍，存活率提高了2倍，同時治療組骨髓單核細胞數是再障對照組的2倍，CD34＋含量是對照組的2.5倍；集落培養的結果也顯示rhBMP-2治療組的CFU-GM集落計數結果是對照組的1.8倍，而且集落形態更好；4周后，rhBMP-2治療組的脾系數是對照組的1.4倍，而且從脾臟的HE染色切片上可以觀察到rh BMP-2治療組的脾臟功能好于再障組。上述結果一致性地顯示，通過干預rhBMP-2治療，能夠有效地降低再障小鼠的骨髓抑制程度，同時促進各項造血功能的恢復，具有促進再障造血損傷的修復作用，因而使得小鼠的存活率提高。盡管本文結果顯示，采用rhBMP-2治療的結果與正常水平仍存在差異，但在再障的治療方案中，仍可作為一種輔助的治療手段，發揮積極的作用。下一步的工作將更細致地研究BMP-2的不同劑量、給藥方式等對于再障模型的治療效果，以及與其他治療手段的輔助作用。

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Promoting Effects of rhBMP-2 on Aplastic Anemia Mice Bone Marrow Hematopoietic Recovery

GAO Qiao-yan， WANG Jing， XING Wan-li， DAI Kai， LIU Chang-sheng
（Engineering Research Center of Medical Biomaterials，Ministry of Education，School of Materials Science and Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai，200237，China）

Aiming to explore the promoting effects of rh BMP-2 on aplastic anemia mice bone marrow hematopoietic recovery，we built the hematopoietic injury model by 5-FU and busulfan with the interventional treatment of rhBMP-2.We analysed the number of mice peripheral white blood cells，bone marrow mononuclear cells，BM CD34＋cells，weight index，survival rate，spleen coefficient，CFU-GM colony as well as the HE sections of femur and spleen tissue.The results showed that rh BMP-2 can improve the index of peripheral white blood cell amount，mice survival rates，CFU-GM colony number，the bone marrow mononuclear cells number and CD34＋cells ratio；rh BMP-2 can also improve the function of the spleen and reduce bone marrow suppression compared with the AA control group.All results above confirmed that rh BMP-2 can effectively promote the restoration of hematopoietic injury in aplastic anemia mice.

human bone morphogenetic protein-2（rhBMP-2）；aplastic anemia；hematopoietic damage repair

R318.08

A

1006-3080（2016）01-0042-06 DOI：10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.01.007

2015-05-14

納米研究重大科學研究計劃（2012CB933600）

高巧艷（1989-），女，陜西延安人，碩士生，主要從事rhBMP-2與造血相關的研究。E-mail：roxygao@163.com

劉昌勝，E-mail：liucs@ecust.edu.cn