不同骨密度人群外周血單核細胞的基因表達譜分析

趙和平，蔣文艷，王冀邯，于燕

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院檢驗科，陜西 西安　710054)

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不同骨密度人群外周血單核細胞的基因表達譜分析

趙和平，蔣文艷，王冀邯*，于燕*

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院檢驗科，陜西 西安710054)

目的探討不同骨密度人群外周血單核細胞基因表達譜的變化。方法運用R語言對公共數(shù)據(jù)平臺NCBI下的基因芯片數(shù)據(jù)集GSE7158進行差異基因表達分析、DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)注釋工具對差異基因進行功能注釋、Medcalc統(tǒng)計軟件進行受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析。結(jié)果與高骨密度組相比，低骨密度組外周血單核細胞中61個基因表達改變(倍數(shù)大于1.5，P<0.05)，且多數(shù)基因呈上調(diào)模式。表達差異基因分別參與了71個生物學(xué)過程(biological process，BP)條目、4個細胞組分(cellular component，CC)條目、6個分子功能(molecular function，MF)條目以及1個KEGG通路。基因CXCL10、IFI44L、IGKV4-1作為生物標志物鑒別兩組樣本具有較好的特異性、敏感度及準確性，且CXCL10&IGKV4-1基因聯(lián)合檢測能夠增加鑒別診斷的準確性。結(jié)論運用高通量組學(xué)與相關(guān)數(shù)據(jù)庫結(jié)合有助于全面的解析病理狀態(tài)下生物樣本中的組學(xué)改變，為后續(xù)骨質(zhì)疏松癥研究提供系統(tǒng)的分子學(xué)機制基礎(chǔ)。

骨質(zhì)疏松；骨密度；基因表達譜；功能注釋；受試者工作特征

骨質(zhì)疏松癥是一種威脅人類健康的全球性疾病，以骨質(zhì)量下降伴隨低創(chuàng)傷性骨折風(fēng)險增加為主要特征[1]。破骨細胞數(shù)量增多及骨吸收活性增強促進了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與進展。單核細胞為破骨細胞的前體，能夠在合適微環(huán)境下分化成為破骨細胞，且分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等多種破骨細胞因子，直接影響了骨質(zhì)代謝，因此也常被視為骨質(zhì)疏松癥研究的靶細胞[2-3]。本研究以公共數(shù)據(jù)庫NCBI中的數(shù)據(jù)信息為基礎(chǔ)，分析了不同骨密度人群單核細胞基因的表達模式變化及差異表達基因所參與的生物學(xué)功能，并且分析了差異表達顯著基因在不同骨密度人群中鑒別診斷的應(yīng)用價值，為探討骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的細胞學(xué)機制奠定了基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源下載公共數(shù)據(jù)庫NCBI-GEO DataSets-GSE7158數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集為26 例外周血單核細胞基因表達譜芯片。在此研究中，研究者招募了878 例健康中國女性(年齡分布在20～45 歲，平均年齡27.3 歲)，檢測個體的峰值骨量(peak bone mass，PBM)。依據(jù)峰值骨量的Z-分數(shù)對人群進行分布，在前100位峰值骨量的人群中選取14 例作為高骨密度個體，在后100位峰值骨量人群中選取12 例作為低密度個體。提取所篩選26 例個體的單核細胞總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)進行后續(xù)芯片實驗，所用芯片為昂飛公司產(chǎn)品，芯片類型：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2篩選差異表達基因經(jīng)公眾數(shù)據(jù)平臺下載芯片實驗的原始數(shù)據(jù)，運用R語言進行數(shù)據(jù)分析[4]。具體步驟包括：采用affy包的魯棒多芯片平均法(robust multichip average，RMA)方法對芯片原始數(shù)據(jù)進行背景校正和標準化處理；運用R/Bioconductor中的limma包選取差異表達基因[5]，判定差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)大于1.5，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；運用R/Bioconductor中的pheatmap包對差異表達基因進行雙聚類分析。

1.3基因的功能注釋對選取的差異表達基因進行功能注釋，所用注釋工具為DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)[6]。具體步驟為：在網(wǎng)站首頁“upload”標簽下提交差異基因列表，接著選取輸入基因列表的ID類型，最后確定所提交列表的類型并選取物種進入分析。對基因本體論(gene ontology，GO)和通路Pathways模塊進行功能注釋，選取GO以及KEGG中P<0.05條目為功能顯著性條目。

1.4受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析運用MedCalc 15.2.2統(tǒng)計分析工具進行ROC曲線分析，以基因在各樣本中的表達值為數(shù)據(jù)信息，評估其在不同骨密度組中鑒別診斷的應(yīng)用效果。采用多元邏輯回歸分析多基因聯(lián)合檢測對兩組樣本的鑒別效果。分別獲取特異性、敏感度及曲線下面積(area under curve，AUC)等指標進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)　　果

2.1芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測研究首先對公共數(shù)據(jù)平臺NCBI-GEO DataSets中的GSE7158數(shù)據(jù)集進行初步質(zhì)量檢測，結(jié)果：數(shù)據(jù)集中一張芯片(高骨密度1)的原始信號強度圖，提示灰度較均勻(見圖1a)；數(shù)據(jù)集所有樣本總RNA的降解曲線圖，曲線斜率較小，提示樣本總RNA降解較少(見圖1b)；原始數(shù)據(jù)經(jīng)RMA方法標準化后信號強度分布圖，可見經(jīng)標準化后所有的曲線重合度高(見圖1c)；RMA標準化處理后的箱線圖，可見各樣本的中值十分接近(見圖1d)。以上質(zhì)量控制分析結(jié)果提示所選芯片數(shù)據(jù)可用，能夠進行下一步的基因差異表達分析。

2.2差異表達基因分析運用R/Bioconductor中的Limma包對低骨密度組和高骨密度組的探針數(shù)據(jù)進行差異分析，將差異倍數(shù)大于1.5，P<0.05的基因定義為差異基因。結(jié)果顯示，與高骨密度組相比，低骨密度組中存在著61個差異基因，其中52個基因在低密度組中呈高表達，9個基因呈低表達。差異表達基因進行的雙聚類分析結(jié)果(見圖2)。

圖1　芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢測結(jié)果

2.3差異表達基因的功能注釋運用DAVID對差異基因進行功能注釋，結(jié)果顯示：差異基因共參與了71個生物學(xué)過程(biological process，BP)條目、4個細胞組分(cellular component，CC)條目、6個分子功能(molecular function，MF)條目以及1個KEGG通路，其中有顯著性(P<0.05)的分別為58個BP條目、3個CC條目、4個MF條目以及0個KEGG通路。表1總結(jié)了前五位顯著性強的BP條目、有顯著性的CC條目、有顯著性的MF條目以及1個KEGG通路(見表1)。

2.4ROC曲線分析為了判斷基因表達水平對兩組不同骨密度群體的鑒別效果，我們篩選出倍數(shù)改變顯著的基因?qū)ζ溥M行了ROC分析。差異基因結(jié)果顯示，共有5個基因在兩組中的差異倍數(shù)FC>2，分別為IFI44L、CXCL10、STAT1、IGKV4-1、SOCS3。ROC分析結(jié)果表明，基因IFI44L、CXCL10、IGKV4-1作為生物標志物鑒別兩組樣本的ROC曲線下面積在0.7以上，具有較好的鑒別準確性；進一步運用二元回歸得到基因聯(lián)合檢測的回歸方程，表達式為：Y=1/[1+e13.1024-3.00976(CXCL10)+1.0674(IGKV4-1)]，運用CXCL10+IGKV4-1聯(lián)合檢測能夠增強鑒別診斷的準確性，曲線下面積達0.9以上，結(jié)果見圖3及表2所示。

3　討　　論

隨著人口老齡化日趨發(fā)展，骨質(zhì)疏松己成為日益嚴重的全球性問題。骨密度作為骨質(zhì)疏松的風(fēng)險因子，是研究骨質(zhì)疏松疾病機制的主要替代表型。單核細胞是與骨代謝密切相關(guān)的細胞，分析不同骨密度群體單核細胞基因表達譜的改變，有助于系統(tǒng)的探索單核細胞對骨代謝的影響機制。對疾病相關(guān)基因進行高通量數(shù)據(jù)分析也是當下醫(yī)學(xué)研究的大趨勢[7]。本研究收錄了公共數(shù)據(jù)平臺NCBI中高骨密度與低骨密度人群外周血單核細胞的基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE7158)，對兩組基因表達進行了差異分析及功能注釋，并進一步檢測了差異表達顯著基因在兩組群體鑒別診斷中的應(yīng)用價值。分析顯示，與高骨密度組相比，低骨密度組外周血單核細胞基因表達譜發(fā)生改變，且大多數(shù)基因表達活躍(52/61)。差異基因所參與的生物學(xué)過程主要涉及對細胞凋亡及細胞死亡的調(diào)控；主要參與了胞外區(qū)細胞組分的組成；分子功能包含了抗原結(jié)合、酶的調(diào)節(jié)/抑制活動。差異基因參與了趨化因子信號通路。

注：橫坐標為樣本名稱，Low為低骨密度，High為高骨密度；縱坐標為差異基因名稱

類型 條 目 名 稱P 值 基 因BPimmuneresponse1.95E-08IL1RN,RSAD2,SERPING1,IFI44L,IGHM,CXCL10,IGHD,FCGR1B,IGKV4-1,RNF19B,XCL1,THBS1,IFI6,IGLV3-21,GBP1anti-apoptosis5.05E-05SERPINB9,SOCS3,BCL2A1,NRG1,THBS1,IFI6,SOD2negativeregulationofapoptosis1.32E-04SERPINB9,CDKN1A,SOCS3,BCL2A1,NRG1,THBS1,IFI6,SOD2negativeregulationofprogrammedcelldeath1.44E-04SERPINB9,CDKN1A,SOCS3,BCL2A1,NRG1,THBS1,IFI6,SOD2negativeregulationofcelldeath1.46E-04SERPINB9,CDKN1A,SOCS3,BCL2A1,NRG1,THBS1,IFI6,SOD2CCextracellularspace0.00LGALS3BP,ADM,IL1RN,SERPING1,XCL1,NRG1,THBS1,CX-CL10extracellularregion0.00IL1RN,SERPING1,IGHM,CXCL10,SIGLEC1,LGALS3BP,ADM,IGLV2-23,IGHD,IGKV4-1,NRG1,XCL1,THBS1,IGLV3-21extracellularregionpart0.02LGALS3BP,ADM,IL1RN,SERPING1,XCL1,NRG1,THBS1,CX-CL10MFantigenbinding6.22E-04IGHD,IGKV4-1,IGHM,IGLV3-21proteinkinaseregulatoractivity0.00CDKN1A,SOCS3,NRG1,CXCL10kinaseregulatoractivity0.00CDKN1A,SOCS3,NRG1,CXCL10enzymeinhibitoractivity0.05SERPINB9,CDKN1A,SOCS3,SERPING1KEGGChemokinesignalingpathway0.09XCL1,STAT1,CXCL10

圖3　不同基因的ROC曲線

基 因敏感性(%)特異性(%)曲線下面積P值CXCL1083.3100.00.881<0.0001IFI44L66.7100.00.8210.0008IGKV4-1100.064.30.7920.0022CXCL10+IGKV4-183.3100.00.917<0.0001

ROC分析提示基因CXCL10、IFI44L、IGKV4-1的表達水平有助于鑒別低骨密度組與高骨密度組人群，且CXCL10+IGKV4-1聯(lián)合檢測能夠提高鑒別診斷的準確性，ROC曲線下面積在0.9以上。CXCL10是一種趨化因子，屬于CXC類非ELR亞族。CXCL10主要介導(dǎo)Th型炎癥反應(yīng)，能夠趨化單核細胞，參與多種疾病的免疫調(diào)控。國外研究顯示，CXCL10具有促進破骨細胞分化和溶骨性骨轉(zhuǎn)移作用，內(nèi)源性CXCL10是形成溶骨性骨轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子[8-9]。本研究也顯示低骨密度人群外周血單核細胞中CXCL10呈高表達。與此類似，IFI44L在低骨密度人群中表達升高。干擾素誘導(dǎo)蛋白44(interferon-inducible-protein 44，IFI44)是IFN-α的誘導(dǎo)基因之一，其主要參與了自身免疫性疾病、IFNα/介導(dǎo)的抗病毒過程、某些炎癥反應(yīng)等過程[10]。與CXCL10及IFI44L相反，IGKV4-1在低骨密度人群中呈低表達。目前，IFI44L、IGKV4-1與骨質(zhì)代謝之間的相關(guān)性尚無文獻報道，有待進一步研究。

綜上所述，該研究在全基因?qū)用娣治霾煌敲芏热巳和庵苎獑魏思毎幕蚋淖儯M一步發(fā)現(xiàn)運用基因表達值作為檢測指標能夠較好的將兩組人群鑒別開來，且基因聯(lián)合檢測可提高鑒別的準確性，為骨質(zhì)疏松癥的研究提供理論依據(jù)。

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Gene Expression Analysis of PBMC in Different BMD Groups

Zhao Heping，Jiang Wenyan，Wang Jihan，etal

(Clinical Laboratory of Honghui Hospital，Xi′an Jiaotong University College of Medicine，Xi′an710054，China)

ObjectiveTo explore gene expression profile of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in different bone mineral density(BMD) groups.MethodsWe performed R language to analyze the gene expression profile based onGSE7158 dataset from NCBI；DAVID online tools was utilized for gene functional annotation；Medcalc statistical software was used for ROC evaluation.Results61 genes were dysregulated and most of them were up-regulated in low BMD compared with high BMD group.The differentiate expressed genes involved in 71 GO-BP，4 GO-CC，6 GO-MF terms and 1 KEGG Pathway.CXCL10，IFI44L，IGKV4-1 were good markers for differential diagnoses between the two groups，and combination examination of CXCL10 &IGKV4-1 was better for ROC evaluation.ConclusionHigh-throughput dataset and bioinformatics tools is help for genomic analysis under different pathological conditions，which will provide more comprehensive molecular mechanisms for further osteoporosis study.

osteoporosis；bone mineral density；expression profile；functional annotation；receiver operator characteristic

1008-5572(2016)09-0810-04

西安市紅會醫(yī)院科研基金資助課題；*本文通訊作者：王冀邯，于燕

R580

A

2016-04-26

趙和平(1967- )，男，副主任技師，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院檢驗科，710054。