蠶豆根尖微核技術的方法學新論

王五香，高丹，廖芬，周芙蓉，封少龍,*

1.南華大學公共衛生學院，衡陽421001

2.南華大學圖書館，衡陽421001

蠶豆根尖微核技術的方法學新論

王五香1,2，高丹1，廖芬1，周芙蓉1，封少龍1,*

1.南華大學公共衛生學院，衡陽421001

2.南華大學圖書館，衡陽421001

雖然蠶豆根尖微核技術已是一個成熟規范的檢測污染物遺傳毒性的方法，但其中仍涉及一些重要的方法學問題值得深入探討和研究。本文在圖示正確觀測蠶豆根尖細胞內微核和染色體畸變，如染色體斷裂、丟失及染色體橋等的基礎上，提出應該對蠶豆根尖分裂相細胞及其染色體畸變進行觀測，以便更加準確、細致地反映污染物作用的劑量-效應關系和分子機制。同時還就該方法的其他重要問題提出了自己的觀點，供同行們深入探討和研究，使之不斷完善，更好地服務于環境監測和風險評價等領域。

蠶豆；微核；染色體畸變；形態學；方法學

王五香,高丹,廖芬,等.蠶豆根尖微核技術的方法學新論[J].生態毒理學報，2016,11(3):86-91

Wang W X,Gao D,Liao F,et al.New views on the methodology of micronucleus assay withVicia fabaroot tip cells[J].Asian Journal of Ecotoxicology, 2016,11(3):86-91(in Chinese)

環境污染物的遺傳毒性一直是人們最關心的問題[1-2]。微核是環境污染物誘導細胞染色體結構和數目變異的結果，被廣泛用作指示污染物遺傳毒性的細胞生物標志物[3-6]。

蠶豆根尖微核技術由于準確、快速、有明顯的劑量-效應關系等特點，操作簡便、適于大批量樣品的檢測等優點，特別是可以直接檢測或監測實際環境樣品的遺傳毒性，樣品不需要復雜的前處理，沒有濃縮，直接反映了實際環境的本來情況，被廣泛應用于輻射損傷、化學誘變、環境監測及風險評價等領域[6-9]。許多國家和世界組織，如中國、美國、日本、歐盟成員國、聯合國環境規劃署及世界衛生組織等，都把它作為一種常規的環境污染檢測指標[9-11]。

雖然發展到現在，蠶豆根尖微核技術已是一個成熟規范的方法，但筆者根據10多年從事該技術的經驗，覺得其中仍涉及一些問題值得深入探討和研究。

1 染色體畸變與微核（Chromosome aberration and micronucleus）

染色體畸變是指生物細胞染色體數目和結構的變異。由于環境遺傳毒物作用所引起的細胞DNA或染色體損傷，如得到不及時正確的修復，在有絲或減數分裂過程中將形成染色體斷裂片或雙著絲點染色體。這些染色體斷片由于缺少著絲點，在分裂過程中，得不到紡錘絲的牽引，不能運動到達兩極的子核中去，留在細胞質中形成微核[3]。通過這種方式形成的微核通常體積小(圖1A)。而雙著絲點的染色體則在細胞分裂的后期和末期形成染色體橋，最終形成染色質橋連接兩子細胞(圖1D-G)。Fenech等[12]認為染色體(質)橋是檢測染色體重排的敏感指標。此外，環境污染物也可能干擾有絲分裂器的正常生理功能，影響部分染色體的正常分離到子細胞中去，使一個或幾個染色體滯后(或稱染色體丟失)，不能進入兩極的子細胞核，留在細胞質中，形成微核。通過這種方式形成的微核通常較大或形成幾個微核(圖1B、C)。

為使初學者建立染色體畸變與微核的直觀認識，本文首先圖示了中期、后期和末期染色體斷裂和丟失，并聯系了微核的形成(圖2)。如圖2，A、D和G分別示出了中期、后期和末期染色體斷裂，其中的染色體斷裂片經有絲分裂后，可形成如圖1A所示的微核；B為兩極各有一染色體丟失的中期相細胞，經有絲分裂后，可在兩個子細胞中都形成微核(圖2C)；E和H分別為后期和末期染色體丟失，經有絲分裂后，可形成圖1B、C或圖2C、F樣的微核。

雖然微核的形成是染色體畸變的結果，但現有蠶豆根尖微核試驗的規范中，只要求觀察計錄處于細胞分裂間期的微核細胞，而忽視了分裂期細胞的遺傳損傷，沒有要求計錄和統計上述的染色體畸變(圖2)，現有文獻也未見報道。從劑量-效應關系上來看，現有的蠶豆根尖微核試驗可能“減輕”了環境污染物的遺傳毒性。因此，在蠶豆根尖微核試驗中，是否計錄和統計分析染色體畸變(如染色體斷裂、染色體丟失和染色體橋等)，以及這些數據所能反映出的污染物作用機理及劑量關系等，值得討論和深入研究。

圖1 蠶豆根尖微核與染色體橋

圖2 染色體斷裂、丟失與微核形成

圖3 蠶豆根尖細胞有絲分裂特征

2 細胞分裂與微核（Cell dividion and micronucleus）

細胞周期是指細胞一次分裂結束開始生長，到下一次分裂終了所經歷的過程。細胞周期是生長與繁殖的周期，一個生物體通過細胞分裂，才能達到生長與繁殖的目的。因此，細胞分裂對生物的個體維持與種族綿延都有著十分重要的意義[13]。生物對其細胞周期的調控是非常嚴密的，受多種效應-抑制因子的平衡調節，如：cyclins,cyclin-dependent kinase及cdk inhibitors:p27Kip1,p21Waf1/Cip1,p15INK4B,p16INK4A等[14-16]。有多少個細胞進入下一次有絲分裂及細胞分裂所經歷的時間等都是相對穩定的，不同種類和功能的細胞不同。在環境條件穩定的情況下，蠶豆根尖分生組織在各生理時期，分裂相細胞數及其各分裂期(前、中、后和末期，圖3)細胞數的比率是在一個相對恒定的范圍內。但在污染的協迫下，細胞周期會發生改變[7-9,17]。分裂相細胞數或各時期細胞頻率的變化，從一定的側面反映了污染物對細胞周期的影響。而且蠶豆根尖細胞的染色體或DNA受損傷之后，只有經過至少一次的有絲分裂才能形成微核，因此，進入有絲分裂的細胞數直接影響著微核率的高低。我們的研究表明，當污染物的濃度高，影響蠶豆根尖細胞分裂時，其微核率反而降低[7-9]。而現有的蠶豆根尖微核技術的規范中沒有要求記錄有絲分裂相的細胞數，在現有的應用蠶豆根尖微核技術進行研究的文獻中，也沒有記錄其試驗中分裂相細胞數，或者只是定性描述。因此，在蠶豆根尖微核試驗中，是否應該定量記錄并統計分析分裂相各個時期細胞數，值得我們深入研究和探討。

3 其他方法學問題（Other methodological issues）

3.1 微核的識別

特別重要的是微核的識別，這直接關系到數據的可靠性。微核是一種在細胞核(主核)以外，游離于細胞質中的小核，其中含有小塊染色質斷片或完整的染色體。在形態上：比主核?。蝗旧|的密度、著色方式和折光等與主核相似；周圍形態清晰可辨，表示核膜的存在；近圓形，與主核完全分離；與主核在同一個光學平面；與主核共處一個細胞質中[9](如圖1，2)。因此，微核的識別應從大小、著色深淺、有無染色質顆粒和折光率等幾方面進行判斷，但初學者憑文字的描述是難于進行判斷的，要在熟練技術人員的指導下學習一段時間才能掌握。如圖4，A是微核細胞，而B不是微核細胞。

圖4 微核的識別

3.2 染毒劑量

染毒劑量要根據預試驗的結果來定，預試驗的目的不僅在于保證染毒的最高劑量不會使根尖細胞產生致死效應，也在于確定劑量-效應關系最敏感的受試物濃度范圍。有試驗證明，不同誘變機理的誘變劑在蠶豆根尖微核試驗中誘發的微核率與濃度、時間等參數的曲線關系也不一樣，既有S-型曲線，又有非S-型曲線[2]。因此，預試驗是相當必要的。

3.3 蠶豆品種、本底微核率與統計分析

選用對污染物敏感的蠶豆品種，是檢出污染物遺傳毒性的重要條件。華中師大生物系金波等[17]從14個蠶豆品種中篩選出了敏感品種松滋青皮豆；農業部環保所從30個蠶豆品種篩選出了敏感品種上于田雞青等。松滋青皮豆和上于田雞青都是試驗中值得選用的蠶豆品種。

本底微核率是試驗成功的關鍵之一。有人提出在正常情況下，本底微核率不應高于千分之十[18]?？字久鹘淌诤凸P者[7-9]采用松滋青皮豆為材料(華中師大生命科學院金波提供)，通過多年的研究發現，所有試驗的微核本底都小于千分之五。本底以千分之十為上限是否合適，還有待于進一步的研究。本底太高，可能反映出試驗條件、方法或試劑等需要重新檢查，而微核判斷的標準也應在考慮之列。

陳光榮等[19]在利用蠶豆根尖微核技術監測水質污染時，引入化學監測中“污染指數”(Pollution Index,PI)的概念，用水質污染指數=樣品實測MN‰平均值/對照組MN‰平均值的大小來劃分水質污染的程度，并在實地監測中得出：PI在0～1.5為基本沒有污染；1.5～2.0為輕度污染；2.0～3.5為中度污染；3.5以上為嚴重污染。用“污染指數”來表示水質污染程度，大大簡化數據的統計處理，又可防止本底微核率的波動性帶來的影響。

通過微核率的多少來反映環境中污染物的量，對于指示環境質量具有重要意義。但微核率的計算是：(含微核的細胞數÷觀察細胞總數)×1 000，不論細胞中微核大小和個數的多少都作一個細胞計。一個細胞中含有多個微核或含有一個大微核(如圖1)所反映的作用于該細胞的污染物量與只引起細胞產生一個小微核的污染物量是否相同？有待進一步的研究。如前所述，引起細胞產生多個微核或大微核與只引起產生一個小微核的作用機理可能存在差異[2]。有關細胞中含有多個微核或大微核是否應該與一個細胞中只含一個小微核分別統計和處理，在當前蠶豆根尖微核技術的規范中并沒有對其加以說明或解釋，有待進一步的討論和研究。

4 結論與展望（Conclusion and perspective）

蠶豆根尖微核技術自建立，經過學者們的共同努力和國際社會的多方合作，到現在已經是一個成熟規范的檢測污染物遺傳毒性的方法。如前所述，筆者認為蠶豆根尖微核技術能告訴我們的不僅僅是微核細胞率，還應該包括染色體畸變數、細胞分裂周期變化等反映污染物不同作用機制方面的信息，是一個綜合性的試驗方法。因此，在方法學上還有許多問題值得人們深入思考和研究。特別是，如能與現代生命科學新理論與技術(如基因組學、功能基因組學及代謝組學等)相結合，它將在環境監測、風險評價和污染物的作用機制等方面發揮更大的作用。當然，這其中還需要青年工作者的投入和不懈努力。

（References）：

[1] Araldi R P,de Melo T C,Mendes T B,et al.Using the comet and micronucleus assays for genotoxicity studies: A review[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2015,72: 74-82

[2] Guerard M,Baum M,Bitsch A,et al.Assessment of mechanisms driving non-linear dose-response relationships in genotoxicity testing[J].Mutation Research-Review,2015,763:181-201

[3] Fenech M.Cytokinesis-block micronucleus cytome assay [J].Nature Protocols,2007,2(5):1084-1104

[4] Bolognesi C,Bonassi S,Knasmueller S,et al.Clinical application of micronucleus test in exfoliated buccal cells:A systematic review and metanalysis[J].Mutation Research -Review,2015,766:20-31

[5] Xu X,Huang Z,Wang C,et al.Toxicological effects, mechanisms,and implied toxicity thresholds in the roots ofVicia fabaL.seedlings grown in copper-contaminated soil[J].Environmental Science and Pollution Research Internatinal,2015,22(18):13858-13869

[6] Iqbal M.Vicia fababioassay for environmental toxicity monitoring:A review[J].Chemosphere,2015,144:785-802

[7] Feng S,Mai B,Wei G,et al.Genotoxicity of the sediments collected from Pearl River in China and their polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)and heavy metals [J].Environmental Monitoring and Assessment,2012,184 (9):5651-5661

[8] Feng S,Cao Z,Yang Y,et al.Polycyclic aromatic hydrocarbons,heavy metals,and genotoxicity of the suburban soils from Guangzhou,China[J].Polycyclic Aromatic Compounds,2013,33(5):501-518

[9] Feng S,Wang X,Wei G,et al.Leachates of municipal solid waste incineration bottom ash from Macao:Heavy metal concentrations and genotoxicity[J].Chemosphere, 2007,67(6):1133-1137

[10] Ma T H.The international program on plant bioassays and the report of the follow-up study after the hands-on workshop in China[J].Mutation Research,1999,426(2): 103-106

[11] EPA.Current Status of Bioassays in Genetic Toxicology (Gene-Tox)[M].USEPA Publication,1980:1-69

[12] Umegaki K,Fenech M.Cytokinesis-block micronucleus assay in WIL2-NS cells:A sensitive system to detect chromosomal damage induced by reactive oxygen species and activated human neutrophils[J].Mutagenesis,2000, 15(3):261-269

[13] 楊撫華.醫學細胞生物學(第6版)[M].北京:科學出版社,2010:176-183

[14] Kareta M S,Sage J,Wernig M.Crosstalk between stem cell and cell cycle machineries[J].Current Opinion in Cell Biology,2015,37:68-74

[15] Dalton S.Linking the cell cycle to cell fate decisions[J]. Trends in Cell Biology,2015,25(10):592-600

[16] Eichmann R,Schafer P.Growth versus immunity--A redirection of the cell cycle[J].Current Opinion in Plant Biology,2015,26:106-112

[17] 王映雪.微核技術在環境監測中的應用概況[J].云南環境科學,2000,19(4):53-55

Wang Y X.Application of micronucleus technology on environmental monitoring[J].Yunnan Environmental Sciences,2000,19(4):53-55(in Chinese)

[18] 臧宇,薛開先.蠶豆根尖微核試驗的應用與發展[J].癌變畸變突變,1999,11(3):158-160

Zang Y,Xue K.The application and development of micronucleus assay ofVicia faba[J].Carcinogenesis,Teratogenesis and Mutagenesis,1999,11(3):158-160(in Chinese)

[19] 胡振東.蠶豆微核測定技術及應用[J].淮北煤師院學報：自然科學版,2000,21(4):65-69

Hu Z.The study and applicaion of micronucleus test technique inVicia faba[J].Journal of Huaibei Coal Industry Normal College:Natural Sciences Edition,2000,21(4): 65-69(in Chinese)◆

New Views on the Methodology of Micronucleus Assay with Vicia faba Root Tip Cells

Wang Wuxiang1,2,Gao Dan1,Liao Fen1,Zhou Furong1,Feng Shaolong1,*

1.The School of Public Health,University of South China,Hengyang 421001,China
2.The Library,University of South China,Hengyang 421001,China

26 November 2015 accepted 8 January 2016

Although the micronucleus assay withVicia fabaroot tip cells is a canonical way to detect the genotoxicity of environmental pollutants,there are still some important issues that are worth in-depth discussion and investigation in its methodology.After illustrating how to correctly observe the micronucleus and chromosome aberrations,including chromosome fragment,chromosome loss and chromosome bridge,in theVicia fabaroot tip cells we suggested that the dividing-phase cells and their chromosome aberrations should been taken account of in this assay, in order to more precisely and delicately determine the dose-effect relationship and potential molecular mechanisms than before.Other important issues about its methodology were also presented for our colleagues to discuss and explore deeply.The aim is to improve this assay to better serve the environmental monitoring and risk assessment.

Vicia faba;micronucleus;chromosome aberration;morphology;methodology

2015-11-26 錄用日期：2016-01-08

1673-5897（2016）3-086-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151126003

簡介：封少龍(1971—)，男，環境科學博士，教授，主要研究方向環境毒理學，發表學術論文30多篇。

湖南省教育廳重點項目(12A118)；南華大學歸國學者啟動基金(2012XQD44)；南華大學研究生教育教改項目(2014JG015)

王五香(1970-)，女，中級職稱，研究方向為環境污染物的生態與健康影響機制，E-mail:wxwang_feng@126.com;

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:slfeng71@usc.edu.cn