不同微藻對典型行業廢水急性毒性響應的敏感性研究

張瑛，王斯揚，張錫龍，王東洲，周斯蕓，周集體

大連理工大學化工與環境生命學部環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連116024

不同微藻對典型行業廢水急性毒性響應的敏感性研究

張瑛*，王斯揚，張錫龍，王東洲，周斯蕓，周集體

大連理工大學化工與環境生命學部環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連116024

研究考察了不同行業廢水對4種微藻24 h和72 h的急性毒性效應。以斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、海水小球藻(Chlorellaspp.)以及等鞭金藻(Isochrysis galbana)為指示生物，采用COD濃度較高的焦化廠實際生產廢水和制藥廠實際生產廢水、COD濃度較低的印染廠生化處理后出水和城市污水處理廠進出水作為受試水體，以微藻的生長抑制率為測試指標，評價微藻對不同行業廢水的急性毒性效應和敏感性。結果表明，不同行業廢水對4種微藻的急性毒性效應有所不同：焦化廢水對等鞭金藻的生長抑制作用最強，制藥廢水對斜生柵藻的毒性效應最為明顯，印染廢水及城市污水處理廠的進出水對海水小球藻的毒性較為顯著，說明不同微藻對不同行業廢水毒性的敏感性存在差異。上述研究結果為廢水毒性評價中受試物種的選擇提供了基礎數據。

焦化廢水；印染廢水；制藥廢水；城市廢水；微藻；生物毒性評價

張瑛,王斯揚,張錫龍,等.不同微藻對典型行業廢水急性毒性響應的敏感性研究[J].生態毒理學報，2016,11(3):92-100

Zhang Y,Wang S Y,Zhang X L,et al.Comparative study on acute toxic effect response of four microalgae to typical industrial wastewaters[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):92-100(in Chinese)

我國排放到河流和海洋中的廢水，其中有毒有害污染物并沒有得到完全的去除，可能對受納水體中的生物產生毒害作用，造成水質惡化、富營養化等現象，帶來潛在的水生態風險，并有可能通過食物鏈進一步對人類健康產生危害[1-8]。工業廢水組分復雜、有毒有害物質濃度高，因此，其排放對受納水體的生態環境帶來的潛在風險則更為受到人們的關注。由于我國特殊的產業結構，焦化廢水、印染廢水等已經成為具有中國特色的典型行業廢水。

目前我國廢水的排放標準中主要的控制指標為化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)、氨氮等理化指標，缺乏表征廢水毒性的相關指標。有研究表明，即使工業廢水的出水COD等化學指標達到污水排放標準，仍然顯示出生物毒性效應[9-10]。為控制水體的毒性及其相關的生態風險，有必要對廢水的毒性進行監測和表征。

關于廢水毒性的測試方法，國內外已有應用生物毒性測試評價廢水生態風險性的相關方案[11]，如美國環保局于2002年提出的全廢水毒性測試(whole effluent toxicity,WET)[12]法。廢水急性毒性實驗中，多采用發光細菌(費希爾弧菌)、藻類、水蚤類和魚類等作為指示生物。藻類由于其個體小、繁殖世代時間短[13]、對環境影響相對敏感，被國內外很多研究者用于毒性實驗研究[14-15]，有研究表明它對某些毒性污染物的敏感性要優于無脊椎動物和魚類[11,16]。

以微藻類作為指示生物的毒性實驗，目前的研究多集中在考察化學品及環境樣品中的毒性效應及其相對敏感性等方面[14-15,17-23]。因此，在評價廢水的綜合毒性時，如果選用藻類作為受試生物，必須考慮受試藻類對污水的敏感性。但是，目前關于廢水對不同微藻的毒性效應及藻類相對敏感性的研究還鮮有報道。

為了解不同行業廢水可能帶來的生態風險，本研究考察了不同行業廢水對微藻的急性毒性效應：受試藻類選用國內外研究者常用的[20-23]、在我國河流及近海海岸常見的淡水微藻(斜生柵藻Scenedesmus obliquus、蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa)和海洋微藻(等鞭金藻Isochrysis galbana、海水小球藻Chlorellaspp.)各2種，典型行業廢水選用具有中國特色的4類廢水(焦化廢水、制藥廢水、印染廢水和城市污水處理廠進出水)，考察不同微藻對不同行業廢水的毒性響應及其對不同組分廢水的敏感性，從而為廢水急性毒性評價中受試藻種的選擇提供基礎數據和實驗依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

實驗用水：焦化廢水(2014年5月取自大連某鋼鐵廠生產工段的蒸氨廢水，COD濃度為2 000 mg· L-1左右)；制藥廢水(2014年7月取自福建莆田某制藥廠生產廢水，該廠主要產品為核糖核酸，COD濃度為2 000 mg·L-1左右)；印染廢水(2014年6月取自廣東佛山某印染廠生化處理后出水，廢水中有毒成分以染料、助劑為主，COD濃度為370 mg·L-1左右)；城市污水處理廠廢水(2014年12月取自大連某城市污水處理廠進出水，該廢水以生活污水為主，COD濃度分別為218 mg·L-1和40 mg·L-1)。

實驗用藻：斜生柵藻(Scenedesmus obliquus，標號為FACHB-417)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa，標號為FACHB-9)購自中國科學院水生生物研究所；等鞭金藻(Isochrysis galbana)和海水小球藻(Chlorellaspp.)由國家海洋環境檢測中心友情提供。

1.2 廢水理化指標測定方法

COD采用重鉻酸鉀滴定法，氨氮采用納氏試劑光度法，硝氮采用酚二磺酸光度法，亞硝氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法，總磷采用鉬銻抗分光光度法，色度采用稀釋倍數法，溶解氧使用便攜式溶解氧測定儀(METTLER TOLEDO FG4)，pH使用德國Sartorius PB-20型pH測定儀。

1.3 藻類毒性實驗方法

淡水微藻選擇水生四號培養基，海水微藻選擇CONWAY培養基。接種海水微藻時，營養鹽與滅菌海水的比例為1:1 000，等鞭金藻還需按千分之一的比例加入維生素營養液(VB120.5 mg+VH 0.5 mg+ VB1100 mg+l 000 mL蒸餾水）。培養條件按OECD 201指南進行：溫度25℃，光照比12 h:12 h，平均光照強度5 000 lux，每天定時搖動3次。微藻的接種和毒性實驗均在無菌操作下進行。

藻類的毒性實驗過程按照OECD 201指南進行：實驗在500 mL的錐形瓶中進行，測試液體積總和為100 mL。選擇處于對數生長期的微藻作為實驗用藻；先通過預實驗確定實驗用水的濃度范圍，正式實驗設置至少5個梯度濃度和1個空白，每一濃度設置3組平行；分別在微藻暴露24 h和72 h取樣測定藻液的吸光值(optical density,OD)。通過微藻的吸光度與細胞數的標準曲線確定微藻細胞數。微藻的生長抑制率按照OECD 201指南中的公式(1)、(2)計算：

式中，Nt，t時間微藻細胞數；N0，微藻初始細胞數。

1.4 數據處理

利用EC50軟件(藍宙軟件開發公司，1.01版本)計算半數效應濃度(concentration for 50%of effect，EC50)；利用SPSS軟件，nonpara-mtric tests中的Mann-Whitney U檢驗進行差異性分析(P>0.05)。

2 結果（Results）

2.1 廢水理化指標

實驗用各行業廢水相關理化指標見表1。

2.2 焦化廢水對4種微藻的急性毒性效應

根據預實驗結果，選用不同稀釋濃度的水樣(對于斜生柵藻與蛋白核小球藻：22.2%、25%、28.6%、33.3%和40%；對于海水小球藻：14.3%、16.7%、20%、25%和3.3%；對于等鞭金藻：8.3%、9.1%、10%、11.1%和12.5%)對4種微藻進行急性毒性實驗，微藻在24 h和72 h的生長抑制情況如圖1和2所示。

焦化廢水對斜生柵藻、蛋白核小球藻、海水小球藻、等鞭金藻的24 h和72 h急性毒性的EC50見表2。

由表2可見，焦化廢水對斜生柵藻、蛋白核小球藻、海水小球藻在24 h和72 h的EC50值比較接近，而等鞭金藻在24 h和72 h的EC50值最低，說明在所用受試微藻中等鞭金藻對焦化廢水的敏感性最強。

另外，對微藻在24 h和72 h的生長抑制情況數據進行差異性檢驗，結果表明，隨著暴露時間的延長，微藻對焦化廢水在24 h和72 h的毒性效應無顯著性差異。

2.3 制藥廢水對4種微藻的急性毒性效應

根據預實驗結果，選用濃度為50%、25%、16.67%、12.5%、10%、5%、3.33%和2.5%的水樣進行急性毒性實驗，不同微藻在24 h和72 h的生長影響情況如圖3所示。

圖1 焦化廢水對4種微藻生長抑制率（24 h）

圖2 焦化廢水對4種微藻的生長抑制率（72 h）

圖3 制藥廢水對4種微藻的生長抑制率（24 h和72 h）

表2 焦化廢水對4種微藻的EC50（24 h和72 h）Table 2 EC50of the four microalgae in coking wastewater after 24 h and 72 h

圖4 印染廢水對4種微藻的生長抑制率（24 h和72 h）

圖5 城市污水處理廠進出水對4種微藻的生長抑制率（24 h和72 h）

由圖3可見，制藥廢水對不同微藻的影響情況不同，并且差別較大。隨著水樣濃度的增大，水樣對斜生柵藻、蛋白核小球藻和海水小球藻的影響情況基本呈現先增強后減弱的趨勢，其中濃度為16.67%和12.5%的水樣對微藻的影響最大。在所用的4種受試藻類中，斜生柵藻的生長抑制情況隨水樣濃度的變化最為顯著，其對制藥廢水的毒性最為敏感；而等鞭金藻的生長抑制情況隨水樣濃度的變化最不明顯，其對制藥廢水毒性的敏感性相對穩定。

隨著暴露時間的增長，4種微藻的生長變化情況也有所不同。由圖3可見，在水樣濃度為16.67%、12.5%和10%時，廢水對海水小球藻的生長促進作用在72 h和24 h有明顯的差異，而對其他3種受試藻類的影響差異較小。

2.4 印染廢水對4種微藻的急性毒性效應

根據預實驗結果，選用濃度為100%、25%、12.5%、6.25%和3.125%的水樣進行急性毒性實驗，不同微藻在24 h和72 h的生長影響情況如圖4所示。

由圖4可見，實驗用低濃度的印染廢水對4種微藻的生長起促進作用，但影響效果較小。隨著水樣濃度的降低，印染廢水對斜生柵藻和等鞭金藻24 h和72 h的生長影響作用變化不大(生長抑制率在-10%左右)，而對蛋白核小球藻和海水小球藻24 h和72 h的生長影響呈逐漸減弱的趨勢。

同時，對比24 h和72 h的實驗數據可以發現：印染廢水對斜生柵藻、蛋白核小球藻、等鞭金藻的促進生長影響作用隨暴露時間的增加變化不大，而對海水小球藻的生長促進作用隨暴露時間的增加變化比較明顯，這表明海水小球藻對印染廢水的毒性效應較為敏感。

2.5 城市污水處理廠進出水對4種微藻的急性毒性效應

選擇馬欄河城市污水處理廠的進出水進行藻類急性毒性實驗，不同微藻在24 h和72 h的生長影響情況如圖5所示。

由圖5可見：污水處理廠進水對4種微藻的生長影響作用較為明顯(24 h時的影響作用范圍為-13.53%～-51.38%，72 h時的影響作用范圍為-15.96%～51.32%)。進水對等鞭金藻的生長影響與其他3種藻類有所區別：72 h時，污水處理廠進水對其的生長影響作用由24 h的促進作用變為抑制作用(抑制率達到55%)。污水處理廠出水對4種微藻的生長影響作用較小(24 h時的影響作用范圍為-27.3%～4.11%，72 h時的影響作用范圍為-23.88%～3.51%)。出水對4種微藻的生長影響無明顯差別。

對比進出水對藻類的生長影響作用可以看出，出水對4種微藻的生長影響作用都有所降低，這說明城市污水處理廠能在一定程度上去除廢水對微藻的毒性。同時，對比4種微藻的生長影響作用結果可以看出，進出水對海水小球藻的影響作用有較大差異，這表明海水小球藻對于城市污水處理廠進出水的毒性效應相對敏感。

3 討論（Discussion）

3.1 廢水對藻類生長的影響

在本文中是這樣定義藻類的毒性作用的：藻類在廢水暴露過程中的生長情況跟控制組有顯著性差異，就認為廢水對藻類有毒性。本實驗選用的焦化廢水和制藥廢水，屬于高COD濃度有機廢水，但是對4種微藻的生長表現出不同的影響作用：焦化廢水表現出抑制生長作用，而制藥廢水表現出促進生長作用。其中，由于本研究所用焦化廢水中的氨氮含量較高，而總磷含量偏低(具體數據見表1)，N與P的比例不能提供適合微藻生長的條件；同時，其中含有的大量誘變毒性和致癌毒性的有機物會抑制微藻生長，所以焦化廢水對微藻的生長影響表現為抑制生長作用，并且其對數濃度與微藻生長抑制率表現出較好的線性相關性(圖1和2所示)。而本研究所用的制藥廢水中含有一定比例的N、P等營養元素(具體數據見表1)，可供微藻迅速生長，對微藻的促進生長作用遠遠超過水樣中有毒物質對微藻的抑制生長作用，因此制藥廢水對微藻的生長影響表現為促進生長作用，且隨著濃度的增加，制藥廢水對微藻生長的促進作用表現為先增加后減弱的趨勢(圖3所示)。

本實驗所用的印染廢水和城市污水處理廠廢水，屬于低COD濃度廢水，其對各微藻基本表現出促進生長作用。這是因為本研究所用的廢水為某印染廠生化處理后出水和城市污水處理廠污水，水樣中的致毒有機物的含量較低，并且N、P等營養物質的濃度適合微藻生長(具體數據見表1)，在污染物和營養物質共同作用下，廢水對微藻的生長表現為促進效應[6,24-25]。微藻的過度繁殖，雖然有可能提供給人類蛋白質、生物能源等可利用資源，但是也可能產生危害人類健康的藻毒素[26]或者造成水體的富營養化。因此，合理控制廢水的生物毒性，對于控制微藻的過度繁殖以及接受水體的水生態安全具有至關重要的意義。

3.2 色度對藻類生長的影響

大多數的行業廢水都具有一定的色度，而色度是影響藻類生長的因素之一。在水樣色度較大的情況下，水樣吸收了來自外界的光源，使微藻無法得到正常生長所需的光線，從而影響微藻的光合作用，因此在研究廢水對微藻的毒性效應時，要注意水樣色度對實驗結果的影響。例如，本實驗在研究制藥廢水對蛋白核小球藻的毒性效應時，濃度為50%的制藥廢水對蛋白核小球藻的生長抑制率高達106%，而濃度為25%的制藥廢水對蛋白核小球藻表現出促進生長作用，促進生長率達到35.86%，這說明水樣濃度達到25%時，色度對微藻生長的影響明顯減弱。同時，采用吸光度法來測定微藻的細胞濃度時，由于制藥廢水色度的存在會干擾吸光度的測定結果，因此本研究中采用離心的方法，減少了色度對水樣吸光度測定的干擾，從而減少了由于實驗方法引起的相對誤差。另外，也可考慮用其他的指標如葉綠素含量、蛋白質含量、酶的活性[27]等來表征微藻的生物量。

3.3 廢水排放指標的控制

目前的排放標準中，缺乏表征水質毒性的相關指標。例如，排放標準中規定排放廢水的COD濃度在40 mg·L-1～50 mg·L-1左右，因此有些企業采用簡單的稀釋法來降低排放廢水的COD濃度使其達標。但是，本研究的實驗結果表明，簡單的稀釋法只能部分降低廢水對微藻的急性毒性。例如，本研究中制藥廢水濃度為2.5%時COD濃度達到50 mg· L-1左右，達到排放標準，但是其對蛋白核小球藻的促進生長率仍然達到20%。綜上所述，工業廢水通過稀釋的方式并不能完全消除廢水對生物(微藻)的急性毒性，必須結合深度處理技術對其毒性做進一步的去除。如劉薇等[28]利用光電催化技術對水中五氯酚的毒性特征進行了研究，結果表明光電催化降解五氯酚的過程中溶液毒性逐步降低。目前，本研究小組利用Fenton氧化技術對焦化廢水進行處理，與簡單的稀釋法相比，Fenton氧化法可以有效去除焦化廢水對微藻的急性毒性。

3.4 受試藻種的選擇

對于廢水毒性試驗中受試物種的選擇，藻類作為受試物種之一，被廣泛應用于廢水的急性毒性實驗研究。對于同一行業廢水的藻類毒性評價，本研究所采用的4種微藻中，等鞭金藻對焦化廢水的敏感性最強，原因可能是等鞭金藻沒有細胞壁，細胞裸露，更容易被污染物侵染而死亡；而海水小球藻對低濃度的印染廢水和城市污水廠的進出水都表現出較強的敏感性，其原因可能是由于海水小球藻個體小，細胞呈球形，光合作用極強，更容易吸收水樣中的營養物質而迅速繁殖。對于不同行業廢水毒性的對比研究，受試微藻的選擇是影響評價結果的主要因素之一。在本研究中，等鞭金藻對焦化廢水敏感性最強，但其對于制藥廢水和印染廢水卻相對穩定，而海水小球藻不僅對印染廢水和城市污水相對敏感，對不同濃度的焦化廢水和制藥廢水也表現出較好的毒性響應，因此海水小球藻可以用于本研究中選用的行業廢水的毒性比較。綜上可知，為獲得快速有效的廢水毒性測試方法，必須要考慮所選用的受試微藻對不同行業廢水的敏感性。本研究的結果為行業廢水急性毒性評價中受試藻種的選擇提供了基礎數據和實驗依據。

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Comparative Study on Acute Toxic Effect Response of Four Microalgae to Typical Industrial Wastewaters

Zhang Ying*,Wang Siyang,Zhang Xilong,Wang Dongzhou,Zhou Siyun,Zhou Jiti

Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering(MOE),School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology,Dalian 116024,China

13 August 2015 accepted 26 October 2015

To evaluate the sensitivity of varied microalgae to typical wastewater,acute toxicity tests with four species of microalgae-Scenedesmus obliquus,Chlorella pyrenoidosa,Chlorellaspp.andIsochrysis galbanawere investigated using the algal growth inhibition test during 24 h and 72 h.Coking wastewater and pharmaceutical wastewater were used as the representative ones with high concentration of COD,while dying wastewater and municipal wastewater as the ones with low concentration of COD in this study.The results revealed thatIsochrysis galbanaexpressed the highest growth inhibition in coking wastewater,whileScenedesmus obliquusin the pharmaceutical wastewater,andChlorellaspp.in both dying wastewater and municipal wastewater.It can be seen that there are differences in sensitivity to the toxicity of different wastewaters among these four microalgae.It aids to the choice of test aquatic organisms in the toxicity evaluation of wastewater.

coking wastewater;dying wastewater;pharmaceutical wastewater;municipal wastewater;microalgae; bio-toxicity evaluation

2015-08-13 錄用日期：2015-10-26

1673-5897（2016）3-092-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150813001

國家自然科學基金重大國際合作研究項目(NSFC-JST,21261140334)；國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07202-006)

張瑛（1972-），女，博士，副教授，研究方向為水生態風險評價及健康風險評價，E-mail:yzhang@dlut.edu.cn