殺蟲劑三唑磷在室內淡水微宇宙中的生態(tài)效應

袁丙強，李少南

浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

殺蟲劑三唑磷在室內淡水微宇宙中的生態(tài)效應

袁丙強，李少南*

浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

作為一種中等毒性的有機磷殺蟲劑，三唑磷在稻區(qū)的使用十分普遍。為弄清其對淡水生態(tài)系統(tǒng)的影響，選擇5組濃度(0、0.35、1.75、17.5、52.5 μg·L-1)，在以藻類作為營養(yǎng)源的室內微宇宙系統(tǒng)內進行研究，采用多變量分析軟件CANOCO 5對數(shù)據(jù)進行分析。非限制性排序和多重比較的結果表明，給藥后0～6 d，三唑磷對于浮游動物群落的最高無作用濃度(NOECcommunity)和最低有效濃度(LOECcommunity)分別為17.5 μg·L-1和52.5 μg·L-1。給藥后第9天，最高濃度組(52.5 μg·L-1)的群落結構開始恢復，此刻三唑磷在水中的實測濃度平均值為4.35 μg·L-1。對于單個物種種群密度做差異顯著性分析和多重比較，結果顯示浮游動物當中受影響最大的是綠色湖灣介Strandesia viridis。給藥30 d后，該物種在52.5 μg·L-1處理組的種群密度明顯下降，歷時57 d的試驗結束時，種群密度仍未恢復到對照水平。對于藻類，非限制性排序和多重比較的結果顯示三唑磷在群落層次的影響未達到能夠明顯區(qū)分NOECcommunity和LOECcommunity的程度。在單物種層面，在給藥后9～12 d，三唑磷對單細胞的羊角月牙藻Selenastrum capricornutum種群有刺激作用。其NOECspecies和LOECspecies分別為1.75 μg·L-1和17.5 μg·L-1。沒有跡象表明三唑磷的引入能夠明顯改變水體pH、電導、濁度和水體C循環(huán)狀況。結合暴露評估軟件GNEEC(Version 2.0)輸出的環(huán)境濃度(峰值為2.44 μg·L-1)，本研究結果顯示三唑磷在正常使用劑量下有可能對稻田周邊浮游動物群落的內部結構造成擾動，但是它不會對整個系統(tǒng)造成不可恢復的影響。

三唑磷；水生微宇宙；多元分析；主效應曲線

袁丙強,李少南.殺蟲劑三唑磷在室內淡水微宇宙中的生態(tài)效應[J].生態(tài)毒理學報，2016,11(3):101-114

Yuan B Q,Li S N.Ecological effects of insecticide triazophos in indoor microcosms[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):101-114 (in Chinese)

三唑磷(triazophos)，化學名稱為O,O-二乙基-O-(1-苯基-1,2,4-三唑-3-基)硫代磷酸酯，屬于硫代磷酸酯類殺蟲劑，對許多重要農業(yè)害蟲，如螟蟲、稻飛虱、蚜蟲、紅蜘蛛、棉鈴蟲、菜青蟲和線蟲等都有良好的防治效果。由于對哺乳動物毒性相對較低，在全面禁止高毒有機磷農藥的背景下，三唑磷的需求量反而呈上升的趨勢，目前主要被加工成乳油、可濕性粉劑、微乳劑等劑型，用于水稻害蟲的防治[1]。

對于三唑磷的生態(tài)毒性，國內外有較多的研究報導，但大多是基于個體水平的研究結果。如，國內資料顯示，三唑磷對各種魚類的48 h LC50介于0.008 ～8.66 mg·L-1之間[2]，對各種甲殼綱動物的48～96 h LC50介于0.4～16.26 μg·L-1之間[2-4]。譚亞軍等[5]測得三唑磷對于大型溞Daphnia magna繁殖量的21 d最高無作用濃度(NOEC)和最低有效濃度(LOEC)分別為0.05 μg·L-1和0.10 μg·L-1。

采用PANNA(Pesticide Action Network North A-merica)數(shù)據(jù)庫中所提供的理化性質參數(shù)和環(huán)境行為數(shù)據(jù)，以數(shù)學軟件GNEEC(Version 2.0)估測三唑磷在水環(huán)境中的殘留水平(estimated environmental concentrations,EEC)。結果顯示，用于防治水稻螟蟲的三唑磷，當以450 g·公頃-1的量使用后，其在稻田周邊池塘中的峰值以及4 d、21 d、60 d、90 d殘留平均值分別為2.44、2.25、1.37、0.63和0.44 μg·L-1。可見三唑磷在正常使用下有可能對稻田周邊水生動物造成危害，因此有必要對其生態(tài)效應做進一步探究。

界定農藥水污染的生態(tài)效應，最直接也最能夠令人信服的證據(jù)，理應來自天然池塘中開展的試驗。然而天然生態(tài)系統(tǒng)十分復雜，試驗過程費時費力，另外人們也難以找到從規(guī)格到內含具有相當程度一致性的一系列天然池塘可供試驗。人工水生生態(tài)系統(tǒng)(水生微宇宙)雖然只在一定程度上保留了天然池塘的結構和功能，但其具有可操控性，并且可以根據(jù)要求設置多個重復，因此成為農藥水生生態(tài)毒理學研究的得力工具[6-7]。作者選用人工組合的水生生態(tài)系統(tǒng)，在室內條件下對三唑磷的生態(tài)效應開展研究，了解三唑磷對構成微宇宙的生物和非生物要素的直接和間接影響，確定三唑磷在群落層面的最高無作用濃度(NOECcommunity)和最低有效濃度(LOECcommunity)，希望研究結果有助于三唑磷的風險評估和風險管理。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 受試物(Test substance and reagents)

受試物：三唑磷原藥(精制)(浙江新農化工股份有限公司生產，純度96.6%)。

試劑：三唑磷標準品(純度98%)購自美國Sigma-Aldrich?，其他試劑除特別指出的之外，均為國產分析純產品。

1.2 試驗容器(Test units)

容積5 L的玻璃廣口瓶(直徑16.0 cm，高25.0 cm，瓶口直徑10.6 cm)。

1.3 稀釋水(Diluents)

參照國際材料試驗協(xié)會(International Association for Testing Materials,ASTM)試驗準則E 1366-02，采用T82MV培養(yǎng)液作為稀釋水[8]。

1.4 基底(Sediments)

取大約4 kg石英砂(40～60目)，放入25 L塑料桶中，加10%鹽酸浸泡，2 h后倒出鹽酸，先用自來水再用蒸餾水沖洗(直至沖洗液pH為7)，烘干，冷卻，稱重備用；幾丁質用蒸餾水沖洗，風干后用粉碎機粉碎，過40目篩備用；纖維素粉直接使用。

1.5 受試生物(Organisms)

1.5.1 藻類(Algae)

參照E 1366-02，選用柱孢魚腥藻Anabaena cylindrica、纖維藻Ankistrodesmussp.、萊哈依藻Chlamydomonas reinhardii(又稱“萊茵衣藻”)、普通小球藻Chlorella vulgaris、鞘絲藻Lyngbyasp.、菱形藻Nitzschiakutzigiana、斜生柵藻Scenedesmus obliquus、羊角月牙藻Selenastrum capricornutum、毛枝藻Stigeocloniumsp.和絲藻Ulothrixsp.作為構成微宇宙的藻類植物。藻種購自中國科學院淡水藻種庫。購回的藻種按照供方提供的方式保存。試驗開始前2周，將藻種轉接到T82MV培養(yǎng)液，在與試驗相同的溫度和光照條件下擴大培養(yǎng)。

1.5.2 浮游動物(Zooplanktons)

選用大型溞Daphnia magna、萼花臂尾輪蟲Brachionus calyciflorus和綠色湖灣介Strandesia viridis作為構成微宇宙的浮游動物。

溞種購自中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關產品安全所，屬于62DM生物株。購回的溞種置于OECD M4培養(yǎng)液[9]中，在水溫22℃，光強1 000～ 2 000 lux(16 h光照:8 h黑暗)的環(huán)境下培養(yǎng)傳代。試驗開始前2周，將懷卵母溞轉移到T82MV培養(yǎng)液中，在與試驗相同的溫度和光照條件下馴養(yǎng)。

輪蟲和介形蟲均采自浙江大學華家池校區(qū)試驗農田的田邊池塘。采回的輪蟲置于T82MV培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中的水溫和光照條件與溞相同。試驗開始前2周，收集懷卵輪蟲進行馴養(yǎng)。

采回的介形蟲置于T82MV培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中的水溫和光照條件與溞相同。試驗開始前4周，收集懷卵成體進行馴養(yǎng)。

1.6 系統(tǒng)的組裝(Microcosm setup)

稱量200 g石英砂、0.5 g幾丁質和0.5 g纖維素，混勻，倒入試驗容器作為基底，然后加入3 L T82MV作為稀釋水。

以受試物三唑磷加入的日期作為試驗的第0天。藻類在加藥前6天接種。藻類每個物種接種到微宇宙中的初始濃度為103cells·mL-1。接種前在熒光顯微鏡(尼康TE2000，日本)下用血球計數(shù)板(型號：0.1 mm，上海華壹生物科技有限公司)對擴大培養(yǎng)的藻種進行計數(shù)(計數(shù)前，多細胞的柱孢魚腥藻、絲藻、毛枝藻、鞘絲藻和纖維藻在裝有玻璃珠的無菌三角瓶中劇烈搖動)，根據(jù)計數(shù)結果算出需要接種的培養(yǎng)液體積(0.1～1.0 mL·L-1)。

輪蟲在加藥前3天引入。引入數(shù)量為30只·L-1。引入前在體視顯微鏡(尼康SMZ645，日本)下用小型浮游生物計數(shù)框(型號：0.1 mL、1.0 mL，北京普力特儀器公司)對培養(yǎng)液中的輪蟲進行計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果算出需要引入的培養(yǎng)液體積(大約0.05 mL·L-1)。

溞和介形蟲在加藥前3天引入。溞按照16只·容器-1(其中6只為體長大于0.7 mm的懷卵母溞，10只為小于0.7 mm的幼溞)，介形蟲按照6只·容器-1的數(shù)量引入

1.7 加藥(Dose administration)

微宇宙試驗共設置0.35、1.75、17.5和52.5 μg· L-14個濃度組和1個溶劑對照組。每組設6個重復。準確稱取0.0158 g三唑磷原藥，溶于丙酮，定容到10 mL，配制成濃度為1.53 mg·mL-1的母液。加藥時取不同體積的母液加入到3 L稀釋水中，對照組加丙酮103.2 μL，加藥之后各濃度組補加丙酮，使其達到與對照組相同的體積。

1.8 試驗條件(Ambient conditions)

光照強度2 000～3 000 lux(16 h光照:8 h黑暗)，試驗溫度控制在(22±1)℃。

1.9 采樣(Sampling)

采樣器參照ASTM試驗準則E 1366-02制作。所采水樣的量視浮游動物計數(shù)以及水體理化參數(shù)和受試物濃度測量的需求而定。

用于濁度、pH、電導率、受試物濃度和浮游生物種群密度測量的水樣在16 h光照開始前1小時采集。用于溶解氧測量的水樣，每天分2次采集：第1次在16 h光照開始前1小時；第2次在8 h黑暗開始前1小時。

整個試驗歷時63 d。試驗過程中每3天采1次水樣。

1.10 樣品測量與分析(Sample observations and analysis)

1.10.1 浮游動物(Zooplanktons)

溞和介形蟲：將水樣倒入培養(yǎng)皿中，用計數(shù)器記數(shù)。必要時使用5 mL或10 mL大型浮游動物計數(shù)框，在體視顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)結果以“只·(100 mL)-1”表示。計數(shù)完成之后的溞和介形蟲重新植入微宇宙當中。

輪蟲：將水樣移入0.1 mL或1.0 mL小型浮游動物計數(shù)框，在體視顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)結果以“只·mL-1”表示。

1.10.2 藻類(Phytoplanktons)

將水樣移入0.1 mm血球計數(shù)板，在熒光顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)結果以“×104cell·mL-1”表示。

1.10.3 水體理化參數(shù)(Water quality parameters)

濁度測量參照中華人民共和國國家標準GB 13200—91[10]。溶解氧測量參照中華人民共和國國家標準GB 11913—89[11]。pH測量參照中華人民共和國國家標準GB 6920—86[12]。電導率測量參照中華人民共和國地質礦產行業(yè)標準DZ/T 0064.6—93[13]。每次測量按照“對照組”→“低濃度組”→“高濃度組”的順序進行，以減少交叉污染。

1.10.4 受試物濃度測定(Pesticide analysis)

取大約20 mL水樣，除去其中的懸浮物，轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯震蕩萃取，收集上層有機相于平底燒瓶，在40℃下減壓濃縮近干，用丙酮定容，過0.2 μm濾膜，待測。

經過前處理的樣品用氣相色譜儀(島津GC-2010，日本)進行檢測。儀器配備FPD檢測器和30 m×0.32 mm×0.25 μm RtxR-5交聯(lián)鍵合型石英毛細管柱。檢測條件：柱溫80℃，保持1 min，以50℃· min-1的速率升至200℃，保持1 min，再以10℃· min-1的速率升至250℃，保持5 min；進樣口溫度230℃；檢測器溫度280℃；不分流進樣；載氣高純氮(99.999%)，恒壓180 kPa；空氣流量100 mL· min-1；氫氣流量120 mL·min-1；進樣體積1 μL。

1.11 數(shù)據(jù)處理(Data procession)

1.11.1 光合作用氧生產量和呼吸作用氧消耗量（Oxygen production and consumption）

光合作用氧生產量(DOP)和呼吸作用氧消耗量(DOR)是反映水體C循環(huán)特征的代謝參數(shù)(mg·L-1)。DOP和DOR可以由如下公式[8]計算：

DOP=DO2-DO1

DOR=DO2-DO3

式中，DO1為16 h光照開始前1小時水中溶解氧量(mg·L-1)；DO2為8 h黑暗開始前1小時水中溶解氧量(mg·L-1)；DO3為16 h光照重新開始前1小時水中溶解氧量(mg·L-1)。

1.11.2 生物可利用藻體積(Bioavailable volumes of algae)

藻類對于濾食者的可利用性與其細胞體積和形狀有關。單位容積內藻類細胞的可利用體積(BAA) (單位：104μm3·mL-1)可以由如下公式[8]計算：

式中，CDi為藻種i的細胞濃度(104cells·mL-1)；CVi為藻種i的細胞體積(μm3·cell-1)；Fi為藻種i的可利用程度。此處的Fi以對大型溞作為參照；CVi和Fi的取值均參照E 1366-02。

1.11.3 排序與方差分析(Ordinations and ANOVAs)

以受試物濃度和時間作為解釋變量(explanatory variable)，以物種種群密度(或水體理化參數(shù)測量值)作為應變量(response variables)，對試驗數(shù)據(jù)做冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)——一種基于限制性排序(constrained forms of ordination)的多元分析。排序結果以主效應曲線(principle response curves, PRC)的方式表達[14]。在排序的基礎上做蒙特卡羅排列檢驗(Monte Carlo permutation tests)，通過檢驗來確認解釋變量濃度、時間，以及兩者交互作用對于群落結構影響的統(tǒng)計顯著性。

分別以受試物的配制濃度和實測濃度作為解釋變量，以群落內所有物種種群密度(或表征水質的所有理化參數(shù)的測量值)作為應變量，對數(shù)據(jù)做非限制性排序(unconstrained forms of ordination)，然后主成分分析(principle components analysis,PCA)或降趨對應分析(detrended correspondence analysis,DCA)，以判斷受試物作為解釋變量能夠解釋的變異在應變量特征向量值(即樣本分值sample scores)總變異中所占的比例。

在PCA或DCA的基礎上，按照時間順序對樣本分值做差異顯著性分析和多重比較，根據(jù)多重比較的結果確定受試物的NOECcommunity和(或)LOECcommunity[15]。

對涉及單物種的試驗數(shù)據(jù)做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。對于檢驗結果顯示受三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用影響顯著的物種，分別以受試物的配制濃度和實測濃度作為解釋變量，以種群密度測量值作為應變量，對數(shù)據(jù)做非限制性排序，采用PCA(或DCA)結果來判斷受試物在試驗過程中對于種群密度總的影響趨勢，以及受試物作為解釋變量能夠解釋的變異在種群密度總變異中所占的比例。如果PCA(或DCA)圖解顯示解釋變量和應變量伸展方向相同，說明受試物對所涉種群有刺激作用，反之說明受試物有抑制作用。按照時間順序對種群密度做差異顯著性分析和多重比較，根據(jù)多重比較的結果確定受試物的最高無作用濃度(NOECspecies)和最低有效濃度(LOECspecies)。冗余分析和蒙特卡羅檢驗結果顯示受三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用影響顯著的水質參數(shù)也經歷同樣的分析操作。

對于多重比較的結果，以連續(xù)2次或2次以上與對照組差異顯著作為劑量“有效”的判斷標準[16]。

排序和蒙特卡羅檢驗以及PCA(或DCA)均由數(shù)學軟件CANOCO 5[17]來完成。對于應變量測量值和應變量特征向量值的差異顯著性分析和多重比較由數(shù)學軟件DPS[18]來完成。

采用公式Ln(Ax+1)對應變量數(shù)據(jù)進行轉換。公式中的x是需要轉換的應變量數(shù)據(jù)。在應變量數(shù)據(jù)組中尋找大于0的最小數(shù)據(jù)xmin，A的取值應該使Axmin約等于2[19]。當應變量包含多組數(shù)據(jù)時，上述轉換可降低絕對值高的數(shù)據(jù)的權重，使應變量數(shù)據(jù)分布更加符合正態(tài)模型。

2 結果（Results）

2.1 浮游動物(Zooplankton communities)

以對數(shù)轉化浮游動物種群密度作為應變量，以受試物濃度和時間作為解釋變量，對試驗數(shù)據(jù)做冗余分析和蒙特卡羅排列檢驗。前者的結果顯示，樣本分值28.2%的變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示F=124，P=0.004，這表明三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于浮游動物群落結構有顯著影響。基于蒙特卡羅檢驗結果的PRC如圖1所示。PRC的x軸顯示時間進程，y軸顯示處理效果的第一主成分(PRC.1)。PRC顯示三唑磷對浮游動物的影響以抑制為主。圖1右側的物種權重(weights)排列結果顯示，相比于萼花臂尾輪蟲，大型溞和綠色湖灣介種群密度受三唑磷影響更大。

以對數(shù)轉化后的種群密度作為應變量，以受試物配制濃度和實測濃度分別作為解釋變量，對于試驗數(shù)據(jù)做非限制性排序。后續(xù)的PCA結果顯示，作為解釋變量，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異在群落結構特征向量值總變異中所占比例分別為7.9%和3.5%。按照時間順序，對不同濃度下的群落結構特征向量值做差異顯著性分析和多重比較，其結果如表1所示。

從表1可以看出，在給藥后的當天、第3天、第6天、第18天、第51天，群落結構特征向量值隨給藥濃度而發(fā)生改變且改變的方向一致。表1還顯示52.5 μg·L-1處理組的向量值與對照組差異顯著。若以連續(xù)2次或2次以上的顯著差異作為劑量“有效”的判斷標準，可以認定三唑磷對浮游動物的0～6 d NOECcommunity和LOECcommunity分別為17.5和52.5 μg· L-1，進而可以計算出浮游動物群落對于三唑磷的0～6 d耐受濃度MATC=LOECcommunity×NOECcommunity= 30.3 μg·L-1。

圖1 基于浮游動物資料組的主效應曲線及應變量分值示意圖

對于單個物種種群密度做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。前者的結果顯示，對于大型溞、綠色湖灣介、萼花臂尾輪蟲，其種群密度分別有27.4%、52.0%、28.7%的變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于大型溞、綠色湖灣介、萼花臂尾輪蟲種群密度影響顯著(F值分別為189、543、201，P值分別為0.002、0.002、0.002)。

為確認受試物濃度、時間，以及兩者交互作用的齡期效應，對于大型溞母溞和幼溞種群密度測量值分別做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。冗余分析結果顯示，對于種群密度，母溞和幼溞分別有22.1%和17.1%的變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于母溞種群密度影響顯著(F值和P值分別為142和0.016)，上述因素對于幼溞種群密度影響不顯著(F值和P值分別為103和0.194)。

對于種群密度受三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用影響顯著的大型溞、綠色湖灣介、萼花臂尾輪蟲分別做非限制性排序和PCA。后者的結果顯示，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異在大型溞種群密度總變異中所占比例分別為3.6%和1.0%；兩者在綠色湖灣介種群密度總變異中所占比例分別為23.4%和0.2%；兩者在萼花臂尾輪蟲種群密度總變異中所占比例分別為0.5%和1.8%。PCA結果顯示三唑磷對上述3個物種的影響方式均為抑制。

對于上述3個物種，按照時間順序，對不同濃度下的種群密度做差異顯著性分析和多重比較，其結果如表2所示。

表1 浮游動物群落結構特征向量多重比較aTable 1 Multiple comparisons of eigenvector values of zooplankton communitiesa

表2 大型溞、綠色湖灣介和萼花臂尾輪蟲種群密度多重比較aTable 2 Multiple comparisons of population densities ofDaphnia magna,Strandesia viridis, andBrachionus calyciflorusa

圖2 基于藻類植物資料組的主效應曲線及應變量分值示意圖

表3 藻類植物群落結構特征向量多重比較aTable 3 Multiple comparisons of eigenvector values of algal communitiesa

從表2第2列可以看出，溞的種群密度在給藥后第3天沿濃度提高方向呈階梯式下降，在第18天呈波動式下降。但這些變化未能夠持續(xù)，因此認定三唑磷在所測濃度下均未達到“有效”水平，即三唑磷對溞的NOECspecies>52.5 μg·L-1。

從表2第3列可以看出，介形蟲的種群密度在給藥后第9天、第24天和第27天沿濃度提高方向先增后降。自給藥后第30天開始，52.5 μg·L-1處理組的種群密度顯著低于對照組，直至試驗結束，這一處理組的種群密度也未恢復到對照水平，由此認定三唑磷抑制介形蟲生長的30～57 d NOECspecies和LOECspecies分別為17.5 μg·L-1和52.5 μg·L-1。

從表3第4列可以看出，輪蟲的種群密度在給藥后的第12天沿濃度提高方向連續(xù)下降，第18天先下降，后又部分回升，第24呈上下波動，第57天先升后降。但這些變化未能夠持續(xù)，因此認定三唑磷對輪蟲的NOEC>52.5 μg·L-1。

2.2 藻類(Algal communities)

以對數(shù)轉化藻類植物種群密度作為應變量，以受試物濃度和時間作為解釋變量，對試驗數(shù)據(jù)做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。冗余分析結果顯示，樣本分值16.5%的分變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示F=28.4，P=0.006，這表明三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于藻類群落結構有顯著影響。基于蒙特卡羅檢驗結果的PRC如圖2所示。圖2右側的物種權重排列結果顯示，相比于單細胞藻類(月牙藻、斜生柵藻等)，多細胞藻類(毛枝藻、柱孢魚腥藻等)種群密度受三唑磷影響更大。

以對數(shù)轉化后的種群密度作為應變量，以受試物配制濃度和實測濃度分別作為解釋變量，對于試驗數(shù)據(jù)做非限制性排序。后續(xù)的DCA結果顯示，作為解釋變量，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異，在群落結構特征向量值總變異中所占比例分別為0.6%和2.3%。按照時間順序，對不同濃度下的群落結構特征向量值做差異顯著性分析和多重比較，其結果如表3所示。

從表3可以看出，藻類植物群落結構特征向量值只在給藥后第21天沿濃度提高方向上下波動。

對于單個物種種群密度做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。前者的結果顯示，對于菱形藻、毛枝藻、斜生柵藻、羊角月牙藻、柱孢魚腥藻、萊茵衣藻、普通小球藻、鞘絲藻、絲藻、纖維藻，其種群密度分別有22.8%、20.2%、19.2%、30.1%、19.2%、14.7%、11.2%、16.0%、17.4%、14.8%的分變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于菱形藻、毛枝藻、斜生柵藻、羊角月牙藻、柱孢魚腥藻種群密度影響顯著(F值分別為148、127、119、215、119，P值分別為0.004、0.014、0.05、0.006、0.01)，其對于萊茵衣藻、普通小球藻、鞘絲藻、絲藻、纖維藻種群密度影響不顯著(F值分別為85.9、63.1、95.4、105、87.0，P值分別為0.37、0.768、0.174、0.098、0.31)。

對于藻類的生物可利用體積(BAA)做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。冗余分析結果顯示，對于BAA，有11.9%的分變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于BAA影響不顯著(F值和P值分別為67.4和0.588)。

表4 藻類種群密度多重比較aTable 4 Multiple comparisons of population densities of algaea

對于種群密度受三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用影響顯著的5個物種分別做非限制性排序和PCA。后者的結果顯示，單細胞藻類當中，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異，在菱形藻種群密度總變異中所占比例分別為<0.1%和2.0%，影響方式均為刺激；兩者在斜生柵藻種群密度總變異中所占比例分別為0.3%和14.3%，影響方式前者為抑制后者為刺激；兩者在羊角月牙藻種群密度總變異中所占比例分別為<0.1%和23.3%，影響方式均為刺激；多細胞藻類當中，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異，在毛枝藻種群密度總變異中所占比例分別為1.6%和0.9%，影響方式均為抑制；兩者在柱孢魚腥藻種群密度總變異中所占比例分別為3.0%和0.8%，影響方式均為抑制。

對于上述5個物種，按照時間順序，對不同濃度下的種群密度做差異顯著性分析和多重比較，其結果如表4所示。

從表4第2列可以看出，菱形藻種群密度在給藥劑后的第33天沿濃度提高方向先降后升，第57天呈波動式下降。

從表4第3列可以看出，毛枝藻種群密度在給藥后第21天沿濃度提高方向上下波動，第24天沿濃度提高方向呈波動式下降。

從表4第4列可以看出，斜生柵藻種群密度在給藥后第9天沿濃度提高方向呈階梯式下降。

從表4第5列可以看出，在給藥后第9天和第12天，羊角月牙藻種群密度沿濃度提高方向先增后降。在這一時段，在17.5 μg·L-1處理組，藻的種群密度顯著高于對照組，因此可以認定三唑磷在給藥后9～12 d刺激羊角月牙藻生長的NOECspecies和LOECspecies分別為1.75 μg·L-1和17.5 μg·L-1；在同一時段，當三唑磷濃度提高到52.5 μg·L-1時，種群密度雖與對照組差異不顯著但是顯著低于17.5 μg·L-1處理組，故可以認定三唑磷抑制羊角月牙藻生長的NOECspecies=17.5 μg·L-1，LOECspecies=52.5 μg·L-1。

從表4第6列可以看出，在給藥后第24天，柱孢魚腥藻種群密度沿濃度提高方向呈波動式上升。

2.3 水體理化參數(shù)及C循環(huán)參數(shù)（Water quality and C circulation parameters）

以對數(shù)轉化的水體理化參數(shù)(pH、電導率、濁度、溶解氧)測量值作為應變量，以受試物濃度和時間作為解釋變量，對試驗數(shù)據(jù)做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。冗余分析結果顯示，樣本分值27.0%的分變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示F=138，P=0.002，這表明三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對水體理化參數(shù)特征向量值有顯著影響。基于蒙特卡羅檢驗結果的PRC如圖3所示。圖3右側的參數(shù)權重排列結果顯示，pH、電導率和溶解氧受三唑磷影響較小，濁度受三唑磷影響相對較大。

圖3 基于水質資料組的主效應曲線及應變量分值示意圖

以對數(shù)轉化的水體理化參數(shù)測量值作為應變量，以受試物配制濃度和實測濃度分別作為解釋變量，對于試驗數(shù)據(jù)做非限制性排序。后續(xù)的PCA結果顯示，作為解釋變量，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異，在水體理化參數(shù)特征向量值總變異中所占比例分別為<0.1%和2.8%。按照時間順序，對不同濃度下的水體理化參數(shù)特征向量值做差異顯著性分析和多重比較，其結果如表5所示。

從表5可以看出，在整個試驗過程中，水體理化參數(shù)特征向量值無顯著變化。

對于單個參數(shù)測量值做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。前者的結果顯示，對于pH、濁度、電導率、溶解氧，分別有22.9%、26.6%、22.8%、15.3%的分變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于pH和濁度影響顯著(F值分別為149和182，P值分別為0.004和0.004)，其對于電導率和溶解氧影響不顯著(F值分別為147和90.0，P值分別為0.064和0.288)。

對于介質的光合作用氧生產量(DOP)和呼吸作用氧消耗量(DOR)分別做冗余分析和蒙特卡羅檢驗。冗余分析結果顯示，對于DOP和DOR，分別有11.4%和10.8%的分變異能夠被解釋變量所解釋；蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于DOP和DOR無顯著影響(F值分別為67.6和63.9，P值分別為0.856和0.928)。

表5 水質特征向量多重比較aTable 5 Multiple comparisons of eigenvector values of water qualitya

表6 水體理化參數(shù)測量值多重比較aTable 6 Result of multiple comparisons of water quality parametersa

對于測量值受三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用影響顯著的2個參數(shù)(即pH和濁度)分別做非限制性排序和PCA。PCA的結果顯示，對于pH，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異在總變異中所占比例分別為<0.1%和0.5%，兩者均導致pH下降；對于濁度，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異在總變異中所占比例分別為<0.1%和6.4%，前者導致濁度下降，后者導致濁度上升。

對于上述2個參數(shù)，按照時間順序，對不同濃度下的測量值做差異顯著性分析和多重比較，其結果如表6所示。

從表6第2列可以看出，在給藥后第33天，介質的pH沿濃度提高方向先降后升。從表6第3列可以看出，在整個試驗過程中，介質的濁度無顯著變化。

2.4 暴露濃度(Exposure concentrations)

三唑磷在微宇宙系統(tǒng)中的濃度變化如圖4所示。從圖4中可以看出，三唑磷在微宇宙中降解較快。施藥后第7天，52.5 μg·L-1濃度組中的三唑磷，其實測濃度降到10 μg·L-1以下；施藥后第57天，低濃度組(0.35μg·L-1和1.75 μg·L-1)中的三唑磷未能檢出。

圖4 三唑磷在微宇宙系統(tǒng)中的濃度變化

3 討論（Discussions）

本論文采用排序的方法分析三唑磷對構成水生微宇宙的生物和非生物要素的直接和間接的影響。該方法在農藥群落效應分析中的作用近年來逐漸得到認可[20]。

3.1 浮游動物(Zooplankton communities)

限制性排序和蒙特卡羅檢驗結果顯示三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對浮游動物群落結構有顯著影響。從PCA結果中可以看出，三唑磷配制濃度和實測濃度能夠解釋的變異，在群落結構特征向量值總變異中所占比例分別為7.9%和3.5%。這表明比起濃度試驗過程中的即時變化，三唑磷起始濃度對浮游動物群落結構的影響更大。這從一個側面揭示出浮游動物屬于三唑磷脅迫的“直接”承受者。對基于非限制性排序的群落結構特征向量值做差異顯著性分析和多重比較，結果顯示三唑磷對浮游動物的NOECcommunity和LOECcommunity分別為17.5和52.5 μg·L-1。從表1中可以看出，在52.5 μg·L-1處理組，三唑磷對浮游動物群落結構的“顯著”影響始于給藥當天而止于給藥后第9天，其中的第3天和第6天均保持著影響，這相當于Zafer等[19]定義的第3級(class 3)效應。

濃度測定結果表明，給藥當天、第3天、第6天和第9天，三唑磷在52.5 μg·L-1處理組的實測濃度平均值分別為50.24、10.33、6.14和4.35 μg·L-1。可見三唑磷濃度降低到4.35 μg·L-1或以下，有可能是群落結構恢復的必要條件。

對單個物種的種群密度做差異顯著性分析和多重比較，發(fā)現(xiàn)三唑磷抑制綠色湖灣介的NOECspecies和LOECspecies分別為17.5和52.5 μg·L-1(表2)。在52.5 μg·L-1處理組，三唑磷對介形蟲的抑制始于給藥后第30天并一直延續(xù)至試驗結束，這相當于Zafer等[19]定義的第4級(class 4)效應。對照表1，人們不難發(fā)現(xiàn)兩者之間的差別。這種差別提示人們，受試物與群落之間的關系有別于受試物與種群之間的關系。

微宇宙試驗開始前，作為預試驗，我們檢測了三唑磷對浮游動物單個物種急性毒性。結果顯示三唑磷對于大型溞、萼花臂尾輪蟲和綠色湖灣介的24 h LC50分別為8.38×10-2、9.48×101和1.85×10-1mg·L-1。值得注意的是，基于NOECspecies/LOECspecies的視角，在本項微宇宙試驗中，受影響最大的不是單物種試驗中顯示對三唑磷敏感性最強的大型溞，而是敏感性次強的綠色湖灣介(表2)。這可能是因為相比于大型溞，綠色湖灣介生命周期長，種群接觸毒物后恢復緩慢(室內環(huán)境下尤其如此)。從這一角度看，介形蟲比溞更適合作為殺蟲劑脅迫的指示生物。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，輪蟲對殺蟲劑的反應常因為物種、環(huán)境條件，以及分析方法的不同而有所差異。例如在室外研究中，Zafar等[19]測得毒死蜱對腹棘管輪蟲Mytilina ventralis和等刺異尾輪蟲Tricho-cerca similis有刺激作用而對瓷甲異尾輪蟲Trichocerca porcellus有抑制作用。又如在室內研究中，劉福光等[21]發(fā)現(xiàn)毒死蜱對晶囊輪蟲Asplachnasp.、多肢輪蟲Polyarthrasp.、龜紋輪蟲Anuraeopsissp.有刺激作用而對單趾輪蟲Monostylasp.有抑制作用。對于臂尾輪蟲Brachionus，前人研究顯示殺蟲劑可以刺激它們的生長[22-24]，但也有研究顯示了相反的結果[25]。

鑒于萼花臂尾輪蟲對三唑磷的敏感性遠低于大型溞和綠色湖灣介。三唑磷不大可能會直接抑制萼花臂尾輪蟲的生長。不僅如此，在作為食物競爭者的大型溞和作為捕食者的綠色湖灣介受到三唑磷抑制的條件下，萼花臂尾輪蟲的種群生長反而有可能加快。然而單物種PCA和表2的結果均顯示這種情況并未發(fā)生。這說明萼花臂尾輪蟲在本項微宇宙試驗中遭受的食物競爭和捕食壓力并不強大。

3.2 藻類(Algal communities)

限制性排序和蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對藻類植物群落結構有顯著影響。從DCA結果中可以看出，三唑磷實測濃度能夠解釋的變異在藻類植物群落結構特征向量值總變異中所占比例明顯高于配制濃度(兩者分別為0.6%和2.3%)。這說明相對于起始濃度，三唑磷濃度在試驗過程中的即時變化對于藻類植物群落結構的影響更為明顯。這種表象與藻類的“機會主義”生長策略相吻合，也揭示出藻類作為三唑磷脅迫“間接”承受者的角色特征。差異顯著性分析和多重比較結果顯示，三唑磷影響藻類植物群落結構特征向量值，其程度尚未達到統(tǒng)計學意義上的顯著水平(表3)。

預試驗結果顯示三唑磷抑制藻類生長的72 h EC50介于1.16～2.11×101mg·L-1之間，遠高于本項微宇宙試驗的給藥濃度。由此推斷三唑磷不會抑制藻類的生長。相反，在本項微宇宙試驗中，藻類的生長有可能因為作為濾食者的大型溞和萼花臂尾輪蟲受到三唑磷的抑制而加快。實際情況究竟如何呢？構建本項微宇宙中所用的10種藻類當中，羊角月牙藻、斜生柵藻、菱形藻、萊茵衣藻、普通小球藻、纖維藻屬于單細胞藻類。從理論上講，它們適合作為溞和輪蟲的食物來源[23]。圖2右側的物種權重排列結果顯示三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于單細胞藻類種群密度影響不大。針對BAA的蒙特卡羅檢驗結果從側面證實了這一點。然而單物種PCA結果顯示羊角月牙藻、斜生柵藻、菱形藻因為三唑磷的引入而生長加快。差異顯著性分析和多重比較的結果顯示，三唑磷對羊角月牙藻的“刺激”效應始于給藥后第9天而止于第15天，這相當于Zafer等[19]定義的第3級效應。對于另外2種單細胞藻類，三唑磷的效應(無論是刺激還是抑制)未超過Zafer等[19]定義的第2等級(表4)。這說明雖然幅度有限，單細胞藻類在試驗過程中的生長仍有加速。這種恢復顯然與浮游動物，特別是溞和介形蟲在本項微宇宙試驗中所受的壓制有關。

3.3 水體理化參數(shù)及C循環(huán)參數(shù)（Water quality C circulation parameters）

限制性排序和蒙特卡羅檢驗結果顯示，三唑磷濃度、時間，以及兩者交互作用對于水體理化參數(shù)特征向量值影響顯著。PCA結果顯示，相對于配制濃度，實測濃度在這方面的影響更大。這說明水體理化參數(shù)在較大程度上受到三唑磷濃度在試驗過程中即時變化的影響。差異顯著性分析和多重比較結果顯示，三唑磷影響水體理化參數(shù)特征向量值，其程度尚未達到統(tǒng)計學意義上的顯著水平(表5)。

在以藻類植物作為初級生產者的水生生態(tài)系統(tǒng)中，殺蟲劑的引入有時會導致水體pH值升高。究其原因，殺蟲劑對濾食者的抑制使藻類生長加速，結果導致溶解氧產率上升，CO2吸收加快[14,26]；除草劑則會導致相反結果[27-28]。在本項微宇宙試驗中，PCA結果顯示三唑磷導致水體pH下降。但這一點未能得到針對pH值的差異顯著性分析和多重比較結果的證實(表6)。這說明對于pH值，三唑磷的影響盡管存在，其程度卻十分微弱。作為整個微宇宙系統(tǒng)營養(yǎng)基礎的藻類，其生長未能夠因三唑磷的引入而明顯加速，可能是造成這一結果的直接原因。此外微宇宙系統(tǒng)與外界的O2和CO2交換也會在一定程度上掩蓋水體pH的瞬時變化[26,28]。

三唑磷對浮游動物群落的0～6 d NOECcommunity和LOECcommunity分別為17.5和52.5 μg·L-1。受藥后第9天，52.5 μg·L-1處理組的群落結構開始恢復。三唑磷在此刻的實測濃度平均值為4.35 μg·L-1。浮游動物當中受三唑磷影響最大的是綠色湖灣介，試驗結束時，該物種仍然未能夠從三唑磷的抑制中恢復。

在所測濃度范圍內，三唑磷對單細胞藻類羊角月牙藻Selenastrum capricornutum的生長有微弱刺激。

在所測濃度范圍內，三唑磷未能明顯改變水體pH、電導、濁度和水體C循環(huán)狀況。

從起始濃度和試驗過程中的濃度變化對系統(tǒng)內生物和非生物要素變化的影響程度上推斷，三唑磷對大型溞和綠色湖灣介有“直接”影響，其對萼花臂尾輪蟲、藻類和水質參數(shù)具有一定程度的“間接”影響(即這些影響主要通過種間關系而實現(xiàn))。

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Ecological Effects of Insecticide Triazophos in Indoor Microcosms

Yuan Bingqiang,Li Shaonan*

Institute of Pesticide and Environmental Toxicology,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China

2 September 2015 accepted 23 October 2015

As a type of organophosphorus compound with moderate toxicity,triazophos is widely used in areas of rice production.To clarify the impact of the insecticide on freshwater ecosystems,five concentrations(0,0.35,1.75, 17.5,and 52.5 μg·L-1)of the insecticide were tested in a set of algal-dominated indoor aquatic microcosms.The data were analyzed by CANOCO 5,a type of software for multivariate data analysis.Results of the unconstrained ordination and the followed multiple comparisons indicated that the highest no-effective concentration and the lowest effective concentration with respect to the eigenvectors of zooplankton communities(i.e.NOECcommunityand LOECcommunity)was 17.5 μg·L-1and 52.5 μg·L-1,respectively,from 0 to 6 d.The communities being exposed to thehighest concentration(i.e.52.5 μg·L-1)recovered at 9 d,and the average value of the actual concentrations at the date was found to be 4.35 μg·L-1.Results of the multiple comparisons with respect to population densities of single-species indicated that the species that was mostly affected wasStrandesia viridis.In group of 52.5 μg·L-1,the populations began to shrink at 30 d and they did not recover at the end of the 57 d exposure.For algae,results of the unconstrained ordination and the followed multiple comparisons showed that the impact of triazophos at community level was not so obvious as to identify the value of NOECcommunityand LOECcommunity.The insecticide was found to induce the population of unicellular speciesSelenastrum capricornutumfrom 9～12 d,with NOECspeciesand LOECspeciesbeing 1.75 μg·L-1and 17.5 μg·L-1,respectively.There was no evidence that the insecticide altered pH,conductivity, turbidity,and carbon cycle of the dilutions.To take the environmental concentrations that was estimated from GNEEC (Version 2.0),which show the peak value of 2.44 μg·L-1,into consideration,results of the study suggest that the triazophos may disturb the intrinsic structure of zooplankton communities close to paddy fields even it was applied at recommended rates,but the insecticide was unlikely to cause unrecoverable damage to the systems.

triazophos;aquatic microcosm;multivariate data analysis;principal response curves

2015-09-02 錄用日期：2015-10-23

1673-5897（2016）3-101-14

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150902001

簡介：李少南(1963-)，農學博士，副教授，主要研究方向農藥生態(tài)毒理，1996年以來發(fā)表相關領域論文80余篇，擁有發(fā)明專利兩項。

浙江省自然科學基金(LY12B07008)

袁丙強(1985-),男，碩士，農藝師，研究方向為農藥環(huán)境毒理，現(xiàn)就職于浙江大學新技術研究院有限公司，E-mail:yuanbingqiang@gmail.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:snli@zju.edu.cn