廣州河涌水體中食蚊魚肝臟性激素相關基因的表達水平研究

張曉嬋，溫茹淑，方展強,*

1.華南師范大學生命科學學院，廣東省高等學校生態與環境科學重點實驗室，廣州510631

2.嘉應學院生命科學學院，梅州514015

廣州河涌水體中食蚊魚肝臟性激素相關基因的表達水平研究

張曉嬋1，溫茹淑2，方展強1,*

1.華南師范大學生命科學學院，廣東省高等學校生態與環境科學重點實驗室，廣州510631

2.嘉應學院生命科學學院，梅州514015

應用食蚊魚細胞色素P450芳香化酶基因(CYP19α)、卵黃蛋白原基因(VTGα)和雌/雄激素受體基因(ERα/ARα)mRNA轉錄水平為指標，評價廣州海珠涌和黃埔涌食蚊魚受環境激素物質干擾產生雌/雄性化效應的現狀。結果顯示，海珠涌寶崗大道段(BG)、洪德路段(HD)和黃埔涌赤崗路段(CG)、苗藝路段(MY)采樣點雌魚性腺CYP19α mRNA表達水平顯著降低。雌魚肝臟VTGα mRNA的表達水平在夏冬兩季CG點都顯著升高，但在BG、HD和MY點的表達水平在冬季則顯著下降；夏冬兩季雌魚雄激素受體ARα mRNA表達水平在各點都顯著升高。雄魚性腺CYP19α mRNA表達水平在各點都無明顯差異，但CG點在夏季顯著升高，而MY點在冬季則顯著下降；雄魚肝臟VTGα和雌激素受體ERα mRNA表達水平分別在各點都顯著升高，但夏季MY點和冬季HD、MY各點無明顯差異。結果表明，雌性食蚊魚的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ERα較對照REF明顯升高，表現出雄激素效應；雄性食蚊魚VTGα和ERα轉錄水平較對照REF顯著升高，CYP19α基因無顯著性差異，表現出雌激素效應。生活在廣州海珠涌和黃埔涌中的食蚊魚受雌/雄激素物質干擾明顯，表明河涌中環境激素污染嚴重。

環境激素；食蚊魚；廣州河涌；目標基因；mRNA表達；生物化學

張曉嬋,溫茹淑,方展強.廣州河涌水體中食蚊魚肝臟性激素相關基因的表達水平研究[J].生態毒理學報，2016,11(3):115-123

Zhang X C,Wen R S,Fang Z Q.Transcription levels of sex hormone genes in liver of mosquitofish in the creek of Guangzhou City[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):115-123(in Chinese)

國內外對城市污水中存在的環境內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)所展開的監測與毒性評價是目前環境科學研究的熱點之一，尤其針對環境激素污染的監測及對生物體的危害效應評價已經做了不少工作，如開發斑馬魚(Danio rerio)、稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)、唐魚(Tanichthys albonubes)、劍尾魚(Xiphophorus helleri)等小型淡水魚類作為模式動物開展相關方面的研究，但多數研究主要以采集生活污水進行室內暴露為主，究其原因主要是這些魚類都不能在城市周邊受污染的溪流或河涌中存活，而不能直接投放到野外受污染的水域中進行生物監測的研究[1-4]。食蚊魚(Gambusia affinis)是一種原產北美洲的熱帶性卵胎生小魚[5]，其入侵性非常強，因體形小、食性雜、繁殖周期短、產仔量大，已廣泛分布于國內各地水域，尤其受污染的城市河涌中也可以生存。因此，直接觀察野外河涌中生活的食蚊魚，研究其受城市污水暴露后的生長發育、骨骼形態學及器官組織病理學變化，開發其在器官、組織、細胞及基因各級水平作為生物標志物監測城市水環境中可能存在的環境激素類物質污染的研究具有重要的學術意義和實際應用價值。

廣州河涌的成分復雜，有機及無機組分種類繁多，導致水體中具有雌激素及雄激素活性的污染物濃度及組分千差萬別。這使得以食蚊魚為模式生物，對實際水體所受到的污染開展相關生態安全評價具有重要的現實意義。本實驗選用分子生物學標志物監測廣州市海珠涌和黃埔涌中存在的EDCs致食蚊魚的生物學效應。用雌魚性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ARα基因表達水平的變化檢測雄性化效應；用雄魚性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ERα基因表達水平的變化檢測雌性化效應。本研究以食蚊魚為指標對廣州市部分河涌的污染狀況進行較全面地監測與評價，其結果能為環保有關部門提供有參考價值的數據，有利于科學的保護和開發利用城市河涌的水環境系統，并且將有助于發展將食蚊魚作為內分泌干擾效應研究的模式實驗動物。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 采樣點

根據食蚊魚生長的情況和捕魚的便利性，本研究選取了對照點(REF)、寶崗大道段(BG)、洪德路段(HD)、赤崗路段(CG)、苗藝路段(MY)等5個采樣點，BG、HD分別位于廣州市海珠涌中下游的路段；CG、MY分別位于黃埔涌中下游的路段。REF為不受城市廢水污染的地點，設在華師內的中心湖。在對照點采集的食蚊魚先在實驗室馴養2周后進行實驗，馴養魚用水為曝氣除氯后的自來水。采集食蚊魚的同時，使用GPS測定采樣點的位置，并使用水質監測儀(YSI556MPS)測定各采樣點的水質參數，如pH值、溫度、電導性和溶解氧。

1.2 實驗動物

食蚊魚采集分別于2013年6月(夏季)和2012年12月(冬季)進行，在不同的采樣點用大型魚網隨機捕撈，并保證每個采樣點食蚊魚的總尾數在200以上。采集的食蚊魚放入編號的大型塑料桶中，每個塑料桶盛裝10 L原采樣點的河涌水，并在桶中放入適量的水草，以減少食蚊魚在運輸過程中造成的損傷。食蚊魚于當日運回實驗室并進行各組實驗。

正常的雌、雄個體鑒別及其性成熟的鑒定參照Leusch等[6]的方法：A.未成年雄性，臀鰭的第3鰭條長度延長，基部寬度加寬，但生殖足未發育完全；B.成年雄性，鰭條生殖足端部出現鉤和肘；C.未成年雌性，體長＜20 mm，第3鰭條長度未延長，基部寬度未加寬；D.成年雌性，體長≥20 mm，第3鰭條長度未延長，基部寬度未加寬；E.懷孕雌魚，腹部下端出現黑色孕斑。但由于本研究中雌性食蚊魚受到城市廢水的影響出現一定的雄性化現象，第3臀鰭條有所延長，故為了避免雄性化作用對性別區別造成干擾，因此本文參考正常的雌雄鑒別方法外，同時把第3臀鰭條長度延長且交接器具有鉤狀結構的食蚊魚定義為成熟的雄性食蚊魚，第3臀鰭條長度延長但不帶鉤狀結構的且體長≥20 mm定義為雄性化的雌性食蚊魚。

實驗魚用大型水族網捕撈后放入裝有采樣點水樣的塑料桶中運回實驗室后，分別篩選成年雄性食蚊魚(B，體全長18.88～23.74 mm；體重54.12～98.77 mg)和成年雌性食蚊魚(D，體全長21.43～25.20 mm；體重99.12～442.78 mg)，設定各個試驗組，并在當天解剖提取食蚊魚的目標器官(肝臟、性腺、臀鰭)50～100 mg裝入有標簽的離心管，迅速放入液氮中速凍后統一轉入-80℃超低溫冰箱中暫存，直至RNA提取試驗。

1.3 試劑與儀器

超低溫冰箱(Revco,美國)，Nanodro-1000型分光光度計(Thermo Fisher Scientific,美國)，PCR儀(Bio-rad,美國)，超凈臺(蘇州安泰)，BG-Power600型電泳儀(北京)，烘烤箱(上海森信)，滅菌鍋(蘇州安泰)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信)。

RNAisoPlus(TAKARA，Dalian，China)， FastQuant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN,China)，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGRN, China)。其他生化試劑盒化合物均為符合實驗要求的國產試劑。

1.4 實驗方法

登錄NCBI網站，找到西部食蚊魚(Gambusia affinis)的VTGα、ERα、ARα、CYP19α cDNA的序列，利用Primer 3軟件(http://frodo.-wit.Edu/)，由生物工程(上海)公司合成需要的引物。本研究相關基因擴增引物名稱及其序列見表1。

總RNA提取：分別將肝臟和性腺組織勻漿，臀鰭條則研磨成粉末，分別加入1 mL的Isoplus RNA (RNAiso Plus)提取液(TakaRa)進行總RNA提取。RNA提取后進行基因組DNA的去除，并檢測RNA濃度及其完整性，保證A260/A280的比值在1.8～2.0 (TakaRa)。

使用TakaRa Code：DRR037 PrimScriptTMRT reagents Kit(Perfect Real Tome)產品。RT反應液配制如下：5×PrimeScript Buffer(2 μL)，PrimeScript PT Enzyme Mix I(0.5 μL)，Random 6 mers(100 μmol· L-1,0.5 μL)，Oligo dT Primer(50 μmol·L-1,0.5 μL), Total RNA(1 μL)，Rnase Free dH2O(5.5 μL)，總共10 μL。反轉錄反應條件如下：37℃15 min(cDNA合成)，85℃5 s(酶失活)。

表1 相關基因擴增引物名稱及其序列Table 1 Name and sequence of the target gene amplified with primers

使用TakaRa Code：DRR081A SYBR?Premix ExTaqTMII(2×)10.0 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX References Dye(50×)or ROX References Dye(50×)0.4 μL,cDNA模板2.0 μL，H2O (滅菌)6.0 μL，總共20.0 μL。按照兩步法PCR擴增標準程序進行RT-PCR反應。兩步法PCR擴增標準程序：95℃預變性15 min；95℃變性10 s、60℃退火32 s共40個循環。

RT-PCR擴增結果數據的處理采用相對定量法，內參基因選用β-actin。經熒光定量PCR分析儀分析，得出精確的Ct值后，然后根據計算公式求得相對值即為相對表達量。

校正值=目的基因定量結果/管家基因定量結果

相對值=待測樣品的校正值/對照樣品的校正值

即倍數(Folds)=2-△△Ct=2-((Ct A-Ct A actin)-(Ct B-Ct B actin))

式中，A為對照點的樣品；B為廣州河涌各采樣點樣品；Ct值為閾值循環數。

1.5 數據統計與處理

使用SPSS 19.0統計軟件對所得數據進行統計學分析，采用單因素方差分析(One wey-ANOVA)法對數據進行差異性分析。用Excel 2013做柱形圖。設置P<0.05時，表示差異顯著；當P<0.01時，表示差異極其顯著。

2 結果（Results）

2.1 各采樣點的水質參數

對各采樣點水質的監測結果顯示，夏季及冬季各采樣點的pH均處于正常范圍(6～9)內，變化不大。各采樣點冬季水溫在17～21℃之間；夏季在28～29℃之間。對照點的溶解氧為(9.76±0.13)mg· L-1(夏季)、(10.91±0.15)mg·L-1(冬季)，魚類正常生長所需溶解氧為5 mg·L-1及以上，可見對照點中氧氣充足，適于食蚊魚正常生長。而采樣點中只有苗藝采樣點(冬季)的溶解氧高于5 mg·L-1，其余采樣點溶解氧處于1～3 mg·L-1波動，食蚊魚供氧不足。對照點的電導率最低，分別為(204±3.77)μs·cm-1(夏季)、(234±2.17)μs·cm-1(冬季)，金屬離子和酸根離子的含量則相對比較低，水質較為純凈。而采樣點中苗藝采樣點電導率較高，(549±3.83)μs·cm-1(夏季)、(447±2.73)μs·cm-1(冬季)，金屬離子和酸根離子的含量相對較高，水體的導電率較大。其余采樣點的電導率在300～400 μs·cm-1左右波動。

2.2 雌性食蚊魚雄激素效應相關基因表達水平的變化

圖1 不同采樣點和不同季節雌性食蚊魚雄激素效應相關基因表達水平的比較

夏季生活在受城市廢水污染的廣州河涌中的雌性食蚊魚性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ARα基因mRNA的表達水平如圖1A所示。與對照點相比，海珠涌和黃埔涌的所有采樣點的成年雌性食蚊魚的性腺CYP19α mRNA的表達水平顯著降低(寶崗大道段：0.084倍，P<0.01；洪德路段：0.136倍，P <0.01；赤崗路段：0.598倍，P<0.05；苗藝路段：0.258倍，P<0.01)。而肝臟VTGα mRNA的表達水平除了赤崗路段點(赤崗路段：1.61倍，P<0.05)升高外，其余各點變化不明顯。但不同采樣點變化趨勢不一致，在寶崗大道段、洪德路段點呈下降趨勢，而在赤崗路段、苗藝路段點呈上升趨勢。與對照點相比，雄激素受體ARα mRNA表達水平顯著升高(寶崗大道段：5.34倍，P<0.01；洪德路段：4.22倍，P <0.01；赤崗路段：1.52倍，P<0.05)，其中在寶崗大道段、洪德路段點顯著上升(P<0.01)，在苗藝路段點無明顯差異。

冬季生活在廣州城市廢水中雌性食蚊魚性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ARα mRNA的基因表達水平如圖1B所示。與對照點相比，廣州海珠涌和黃埔涌的除赤崗路段點外，其余各點的成年雌性食蚊魚性腺CYP19α mRNA表達水平顯著降低(寶崗大道段：0.285倍，P<0.01；洪德路段：0.112倍，P<0.01；苗藝路段：0.422倍，P<0.01)。而肝臟VTGα mRNA的表達有2種變化趨勢，其中在寶崗大道段、洪德路段、苗藝路段點呈下降趨勢(BG：0.273倍，P<0.01；洪德路段：0.260倍，P<0.01；苗藝路段：0.64倍，P>0.05)，在赤崗路段點呈上升趨勢(赤崗路段：1.95倍，P<0.01)。與對照點相比，雄激素受體ARα mRNA表達水平除了赤崗路段點外，其余各點有明顯升高的趨勢(寶崗大道段：1.60倍，P <0.01；洪德路段：2.06倍，P<0.01；苗藝路段：4.57倍，P<0.05)，其中在苗藝路段點差異最顯著(P<0.01)。

結果顯示，夏、冬季生活在受廢水污染的河涌中雌性食蚊魚的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ERα較之REF明顯升高，雌性食蚊魚表現出雄激素效應。

2.3 雄性食蚊魚雌激素效應相關基因表達水平的變化

夏季生活在廣州城市廢水中的雄性食蚊魚性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ERα mRNA的表達水平如圖2A所示。與對照點相比，除了赤崗路段點有上升的趨勢(赤崗路段：6.04倍，P<0.05)外，廣州海珠涌和黃埔涌中的成年雄性食蚊魚性腺CYP19α mRNA基因表達水平沒有明顯變化。而肝臟VTGα mRNA表達水平都顯著升高(寶崗大道段：6.04倍，P<0.01；洪德路段：5.68倍，P<0.01；赤崗路段：26.65倍，P<0.01；苗藝路段：8.27倍，P< 0.01)，其中在赤崗路段點變化最明顯。而雌激素受體ERα mRNA表達水平除了苗藝路段點外，其余各點有升高的趨勢(寶崗大道段：1.98倍，P<0.05；洪德路段：4.64倍，P<0.01；赤崗路段：1.76倍，P<0.05)，但升高幅度不大，其中在洪德路段點變化最明顯。

圖2 不同采樣點和不同季節雄性食蚊魚雌激素效應相關基因表達水平的比較

冬季生活在廣州城市廢水中雄性食蚊魚性腺CYP19α、肝臟VTGα和臀鰭ERα mRNA的表達水平如圖2B所示。與對照點相比，廣州海珠涌和黃埔涌中的成年雄性食蚊魚的性腺CYP19α mRNA表達水平都沒有明顯變化，苗藝路段點則有下調趨勢(苗藝路段：0.494倍，P<0.05)。而肝臟VTG α mRNA表達水平顯著升高(寶崗大道段：5.68倍，P <0.01；洪德路段：2.54倍，P<0.01；赤崗路段：20.34倍，P<0.01；苗藝路段：6.74倍，P<0.01)，其中在赤崗路段點變化最明顯，其余各點都在10倍以下。而雌激素受體ERα mRNA的表達水平在寶崗大道段、赤崗路段點有明顯升高的趨勢(寶崗大道段：1.68倍，P<0.05；赤崗路段：1.51倍，P<0.05)，其余各點無明顯變化。

結果顯示，夏、冬季生活在受廢水污染的河涌中雄性食蚊魚VTGα和ERα轉錄水平較REF顯著升高，CYP19α基因則無顯著性差異，雄性食蚊魚表現出雌激素效應。

3 討論（Discussion）

3.1 廣州河涌城市廢水暴露致雌性食蚊魚雄激素效應

在生物體中，芳香化酶可以催化雄激素轉化成雌激素，促進肝臟合成卵黃蛋白原，從而保證卵子的發育可以正常進行。而本研究中雌魚CYP19α表達水平顯著降低，推測體內雌激素合成通路受阻，雄激素水平則上升，性腺轉向雄性方向發育，從而出現雄性化征狀。不少研究表明CYP19α表達下調是雌性退化的反饋性調節結果，是雌性性腺退化的分子標記之一。Kitano等[7]認為睪酮(MT)誘導日本鰈的機制同芳香化酶抑制劑一樣，抑制日本鰈性腺芳香化酶的表達，導致雌二醇(E2)總量降低，從而誘導雌魚轉變為雄魚。楊雋等[8]研究發現，壬基酚(NP)誘導比目魚幼魚雌性化的同時伴隨著CYP19α表達的上調，而用芳香化酶抑制劑法倔唑(fadrozole)喂食以及用MT染毒都能誘導遺傳學雌性比目魚性別轉換為雄性，同時檢測到對CYP19α表達的抑制。李廣麗等[9]發現埋植MT后性腺芳香化酶活性和血清中E2濃度變化不顯著，但CYP19α表達卻顯著降低，并誘導赤點石斑魚發生性逆轉。舒琥等[10]給2齡雌性赤點石斑魚3次埋植雄烯二酮(AED)后引起了性別逆轉，并發現發生性別逆轉的個體性腺CYP19表達水平和活性顯著降低。汪奇[11]研究表明芳香化酶抑制劑來曲唑(LE)可導致基因型雌魚發生雄性化逆轉，形成有功能的精巢；該階段CYP19α表達下調和DMRT1表達上調是雄性化逆轉的標志。本研究與上述研究結果相一致，食蚊魚雌魚CYP19α表達水平顯著降低，從而導致內源激素平衡被改變。推測廣州河涌中城市廢水存在某些化合物抑制卵巢中CYP19α的表達，從而誘導雌魚雄性化。本研究發現，除了赤崗路段點外，其他采樣點雌魚VTGα mRNA的表達水平都呈下降趨勢。有研究表明，雌魚暴露在雄激素中會導致VTGα mRNA的表達水平下降[12]。這與作者發現的寶崗大道段、洪德路段采樣點中雌魚的形態出現了第4臀鰭條長度延長、第3臀鰭條分節數增多，第14、15、16椎體脈棘向前彎曲等雄性化現象是一致的[13]。因此推測雌魚VTGα的表達水平下降表明廣州河涌城市廢水中可能存在類雄激素相關的化合物，抑制了食蚊魚VTG α的表達，從而出現不同程度的雄激素效應。而赤崗路段點雌魚VTGα的表達水平呈上升趨勢，一方面可能因為此采樣點的雌魚處于卵黃生成期，在此期間生成大量卵黃蛋白原；另一方面也可能因為黃埔涌中雌激素/類雌激素效應較強，導致VTGα表達上升，致使性腺發育提前。具體原因仍需作進一步探究。但結合作者同期的研究發現海珠涌及黃埔涌的雌魚出現雄性化征狀，可以推斷廣州城市廢水中存在雄激素或類雄激素化合物，促使雌魚雄性化[13]。

食蚊魚具有兩個由不同基因編碼的雄激素受體，稱之為ARα和ARβ。Sone等[14]研究表明臀鰭中ARα mRNA的轉錄水平與雄激素物質的含量之間具有較好的劑量效應曲線，雄魚受到雄性激素的作用之后，臀鰭中AR的表達增加，促使臀鰭變成了生殖足。Ogino[15]認為雌魚臀鰭的延長依賴于臀鰭上基因的表達，自然條件下這些基因受魚體內源激素的調控，但也可以受到外界激素的影響，水體中的雄激素物質可以直接結合臀鰭上的受體發揮作用。Larsson等[16]研究認為，造紙廢水中含有大量性腺雄激素受體的配體，能激活雄激素受體，引起魚類的雄性化。因此，ARα mRNA的表達水平可以作為生物標記物監測水體雄激素污染。本研究結果表明，與對照點相比，雌魚ARα的表達水平有升高的趨勢，其中海珠涌的采樣點寶崗大道段、洪德路段顯著升高，而黃埔涌的采樣點有升高趨勢但差別不明顯。結合實地觀察分析，海珠涌附近有大量工業區、居民區，日排污量大，水質烏黑甚至發出惡臭，污染程度嚴重；而黃埔涌的河涌寬大，水質較為清澈，除了食蚊魚外還能見到大量其他品種如鯽魚、羅非魚、鯉魚，污染程度較低。另外在同期的研究中，作者也發現海珠涌的寶崗大道段、洪德路段點及黃埔涌苗藝路段點中雌魚的形態出現了第4臀鰭條長度延長、第14、15、16椎體脈棘向前彎曲等雄性化現象，但黃埔涌赤崗路段點無明顯差異[13]。實際上水環境中的雄激素含量并不高，但生活在其中的魚是世代暴露的，在長期的不斷暴露下，低劑量的雄激素經過時間累積可以對食蚊魚產生了影響。初步推測海珠涌存在某些化合物具有雄激素配體的結構，直接與食蚊魚臀鰭的AR進行結合，誘導其發生表達，從而引起了雌魚臀鰭的延長、分節數增多。而黃埔涌上游赤崗路段及下游苗藝路段具有差異性，則可能因為水環境中除了存在雄激素物質外，還存在其他大量的抗雄激素物質(雄激素受體抑制劑)及雌激素。化學物成分復雜，具體差別仍需要進一步檢測黃埔涌中內分泌干擾物的含量[13]。

本研究結果發現，生活在受廢水污染的河涌中雌性食蚊魚的VTGα和CYP19α基因受到不同程度的抑制，ARα較之對照點明顯升高。根據目標基因表達的結果同時結合作者同期的研究發現，海珠涌及黃埔涌的雌魚出現形態雄性化征狀，推測廣州城市廢水中存在雄激素或類雄激素化合物，致使雌性食蚊魚表現雄激素效應。

3.2 廣州河涌城市廢水暴露致雄性食蚊魚雌激素效應

本研究中，廣州海珠涌和黃埔涌中除苗藝路段點外，其余各點的成年雄性食蚊魚性腺中的CYP19α表達水平沒有明顯的變化。Carreau等[17]對10多種魚類芳香化酶的分布進行比較總結，發現P450aromA主要在這些魚的卵巢中表達，在睪丸和腦中僅微量存在。同時Tong[18]也發現CYP19α主要在卵巢表達，雄魚在精巢間質細胞中僅有少量表達，合成的雌激素參與維持精原細胞增殖。故因其微量存在表達水平沒有明顯變化。芳香化酶的調節機制較為復雜，目前的研究結果不相一致，還沒有形成統一的認識。本研究中雄性食蚊魚性腺中的CYP19α表達水平沒有出現明顯變化的原因則還有待作進一步研究。

目前已經有許多研究采用不同魚種的卵黃蛋白原(VTG)作為生物標志物對環境雌激素效應進行檢測。Orlando等[19]發現造紙廢水中存在的雄激素物質在水環境中很容易被轉化為雌激素物質，從而引起了魚類產生雌激素效應，誘發雄魚VTG基因的表達。Matthiessen等[20]對污染較重的河流中鯰魚的調查發現，89%以上的雄魚出現卵黃蛋白原基因表達，近17%的雄魚出現雌雄同體現象。加拿大學者對11家造紙廠排放的廢水進行研究，發現雄性黑頭呆魚暴露于20%和40%濃度后，其VTG的表達顯著升高[21]。近年探索應用食蚊魚的卵黃蛋白原(VTG α)基因轉錄水平為指標，評價廣東東莞寒溪河受雌/雄激素物質污染現狀的研究已有報道，其研究結果顯示，生活在東莞寒溪河中的雄性食蚊魚受雌激素物質干擾明顯，普遍出現顯著的雌激素效應，表明寒溪河水體受雌激素物質污染更嚴重[22]；同時進行了室內模擬實驗，研究了該地(樟村)污水處理廠出水原液不同濃度暴露對食蚊魚的形態雌性化生物學效應。結果顯示，雄魚肝臟VTGα mRNA轉錄水平顯著升高，并且其升高趨勢與暴露濃度相一致，表明雄性食蚊魚雌性化明顯，這表明，東莞城市廢水中存在能致食蚊魚發生雌激素效應的內分泌干擾物質[23]；該作者進一步對東莞寒溪河水體雌激素物質含量進行了檢測，結果證實，東莞寒溪河水域中雌激素類物質雌酮(E1)和雙酚A(BPA)分別為1.34～18.32 ng· L-1和33.84～45 766.41 ng·L-1，因此推測廢水中E1和BPA在引起當地水域食蚊魚雌激素效應中起到重要作用[24]。本研究結果與上述的研究相一致，廣州海珠涌和黃埔涌夏季和冬季所有采樣點的雄魚VTGα表達水平顯著升高，其中黃埔涌比海珠涌變化更為顯著，有的采樣點高達20多倍。因此推測廣州河涌城市廢水中可能存在類雌激素相關的化合物，誘導VTGα mRNA的表達，從而出現不同程度的雌激素效應。但是本文作者的同期研究結果發現，盡管生活在廣州海珠涌和黃埔涌中4個采樣點成年雄性食蚊魚第4臀鰭條的長度值顯著小于對照點，但是所有采樣點的成年雄性食蚊魚第4：6臀鰭條長度比值則無明顯差異。此外，各采樣點成年雄性食蚊魚第14、15、16椎體脈棘的P值、P:D和P:L比值沒有明顯變化[13]。這些結果表明，分子效應與形態變化的效應存在差異，食蚊魚VTGα mRNA的表達量雖然提高而表現雄性食蚊魚產生雌激素效應，但效應的強弱將可能決定雄性食蚊魚骨骼形態雌性化的效果。

雌激素的生物學效應主要通過其特異性受體雌激素受體的介導實現。不少研究發現暴露城市廢水的雄性食蚊魚ERα表達水平升高，引起雄魚雌性化效應[25]。同時雌激素基因受體、芳香化酶基因敲除后的雄性小鼠會出現不育[26]。本研究中，雄魚ERα表達水平在寶崗大道段、赤崗路段點有明顯升高的趨勢(P<0.05)，其余各點無明顯變化。可見海珠涌和黃埔涌中的食蚊魚存在雌激素效應，但效應強弱在不同各采樣點具有差異。其中無論夏季還是冬季，赤崗路段點雄魚ERα的表達水平顯著上升(P< 0.05)，同時VTGα的表達中，赤崗路段點高達20多倍，故可以初步推測黃埔涌的赤崗路段段存在顯著的雌激素效應。

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Transcription Levels of Sex Hormone Genes in Liver of Mosquitofish in the Creek of Guangzhou City

Zhang Xiaochan1,Wen Rushu2,Fang Zhanqiang1,*

1.Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou 510631,China
2.College of Life Science,Jiaying University,Meizhou 514015,China

31 July 2015 accepted 8 October 2015

The cytochrome P450 aromatase(CYP19α),vitellogenin(VTGα)and estrogen/androgen receptor(ER α/ARα)genes mRNA transcriptional levels in mosquitofish(Gambusia affinis)were detected in order to monitor the pollution status of environmental estrogen/androgen substances in the creek of Haizhu and Huangpu,Guang-zhou city.The results showed that,theCYP19α mRNA transcription levels in gonad of female mosquitofish from sampling sites of Haizhu Baogang Avenue(BG),Hongde Road(HD)and Huangpu Chigang Road(CG),Miaoyi Road(MY)significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)when compared with the control point of Huashi(REF); theVTGα mRNA transcription levels in liver of male mosquitofish from sampling sites of BG,HD and MY significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)except CG when compared with the control point of REF;theARα mRNA transcription levels in anal fin of female mosquitofish from all sampling sites significantly increased(P< 0.05 orP<0.001)in summer and winter.Except CG in summer and MY in winter theCYP19α mRNA transcription levels in gonad of male mosquitofish were not significantly different in other sampling sites;theVTGα mRNA andERα mRNA transcription levels in male mosquitofish from all sampling sites significantly increased(P< 0.05 orP<0.001)except HD and MY when compared with the control point of REF.The results indicated that, VTGα genes in liver andCYP19α genes in gonad of female mosquitofish were subject to different degrees of inhibition,andARα mRNA transcription level was significantly higher than that in the REF,showing the effects of androgens.TheVTGα mRNA andERα mRNA transcription level in male mosquitofish were significantly higher than that in the REF,andCYP19α gene expression in male mosquitofish was not significantly different,showing the effects of estrogens.Mosquitofish in the creek of Haizhu and Huangpu were significantly influenced by estrogen/androgen material interference,and the environmental hormone pollution in the creek of Guangzhou city was very serious.

environmental hormones;Gambusia affinis;the creek of Guangzhou city;target gene;mRNA expression;biochemistry

2015-07-31 錄用日期：2015-10-08

1673-5897（2016）3-115-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150731002

簡介：方展強(1953—)，男，教授，博士生導師，主要研究方向為水生動物生態毒理學，發表學術論文170余篇。

廣東省科技計劃項目(2012B030800006)；廣東高校城市水環境生態治理與修復工程技術研究中心建設項目(2012gezxA004)

張曉嬋(1988-)，女，碩士研究生，研究方向為水生動物生態毒理學，E-mail:390267054@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:fangzhq@scnu.edu.cn