基于彗星實驗的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的研究

高上吉，鐘曉霞，劉婉瑩，王勉之，孫靜，李弘程，孫永學

華南農業大學廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州510642

基于彗星實驗的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的研究

高上吉，鐘曉霞，劉婉瑩，王勉之，孫靜，李弘程，孫永學*

華南農業大學廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州510642

為評價洛克沙胂的遺傳毒性，采用單細胞凝膠電泳(彗星實驗)，研究了不同濃度的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞脫氧核醣核酸(DNA)的損傷作用。提取秀麗隱桿線蟲的胚胎細胞，分別暴露于0(空白對照)、50、250、500 μg·L-1含洛克沙胂的溶液染毒1 h。用彗尾DNA百分比含量(TDNA%)、彗星尾長(TL)和Olive尾矩(OTM)作為DNA損傷的指標。實驗結果表明，與空白對照組比較，處理組中彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩顯著增加(P<0.01)。隨著洛克沙胂濃度的增加，彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩逐漸增加，其相關系數r>0.99，說明在實驗濃度范圍內，存在極顯著的濃度-效應關系。洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA具有損傷作用，彗星實驗操作簡便、快速、靈敏度高，能夠反映出洛克沙胂的遺傳毒性。因此，通過彗星實驗建立實驗室檢測洛克沙胂遺傳毒性的方法具有可行性。

洛克沙胂；秀麗隱桿線蟲；彗星實驗；DNA損傷；遺傳毒性

高上吉,鐘曉霞,劉婉瑩,等.基于彗星實驗的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的研究[J].生態毒理學報，2016,11(3):167-172

Gao S J,Zhong X X,Liu W Y,et al.Comet assay study on DNA damage of embryonic cells inCaenorhabditis elegansinduced by roxarsone[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):167-172(in Chinese)

洛克沙胂(roxarsone)是一種有機砷類飼料添加劑，具有明顯的促進動物生長及抗菌、抗球蟲的作用，在我國被廣泛應用。畜禽飼喂洛克沙胂后吸收較少，大部分以原形隨糞便和尿液直接排泄到體外，所吸收的很少部分也會經機體代謝后排泄到體外[1]。獸藥隨動物糞、尿等排泄物進入生態環境，污染環境土壤、表層水體等，并通過食物鏈影響植物、動物和微生物的正常生命活動，或在植物中富集，最終將影響人類的健康[2-3]。

然而，洛克沙胂潛在的遺傳毒性尚不可知，特別是對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞脫氧核糖核酸(DNA)損傷的研究資料尚為空白。彗星實驗(單細胞凝膠電泳，SCGE)是測定單個細胞DNA斷裂的技術，近年來，因其快速、敏感、經濟和靈敏度高等特點已在環境污染物的遺傳毒性評價方面得到了廣泛應用[4-5]。秀麗隱桿線蟲因其個體結構簡單、易于實驗室培養、生活史短等許多優點，在環境毒理學等領域得到廣泛應用[6]。本實驗采用單細胞凝膠電泳技術探討了洛克沙胂暴露脅迫對秀麗隱桿線蟲體外培養胚胎細胞DNA的損傷作用，為評價洛克沙胂的遺傳毒性提供試驗依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 主要儀器設備

水平電泳儀(Power Pac Basic，基本型電源，美國Bio-Rad公司)；水平電泳槽(SPFT型，美國Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(DM2500，德國Leica公司)；冷凍離心機(Sorvall RC 12BP，美國Thermo公司)；電子分析天平(感量0.00001 g，AE160，瑞士Mettler公司)；電子分析天平(0.001 g，Sartorius BSA323S，德國賽多利斯科學儀器有限公司)；超純水機(Milli-Q，美國Millipole公司)；可調微量移液器(Eppendorf Research型，0.5～2.5 μL，2～20 μL，10～100 μL，20～ 200 μL，100～1 000 μL，500～5 000 μL，德國Eppendorf公司)。

1.2 主要實驗試劑

洛克沙胂原料藥粉(含量98.5%，廣州惠華動物保健品有限公司提供)；正常熔點瓊脂糖(NMA，美國Sigma公司)；低熔點瓊脂糖(LMA，美國Sigma公司)；曲拉通X-100(Triton X-100，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；N-十二烷基肌氨酸鈉(SLS，美國Sigma公司)；溴化乙錠(EB，美國Sigma公司)；Tris-Base(美國Genview公司)；臺酚藍(美國Genview公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.3 線蟲和菌株

野生型秀麗隱桿線蟲(N2)以及大腸桿菌OP50 (E.coliOP50)均由國際線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)獲得。線蟲生長培養基(Nematode Growth Medium，NGM)：氯化鈉3 g，瓊脂粉17 g，加雙蒸水至1 L，高壓滅菌40 min后，55℃水浴15 min加入1 mol·L-1無菌氯化鈣溶液1 mL，1 mol· L-1無菌硫酸鎂1 mL，1 mol·L-1無菌磷酸鉀緩沖液(pH=6)25 mL，5 mg·mL-1無菌膽固醇乙醇溶液1 mL，混勻后倒入培養皿，待凝固后鋪上大腸桿菌OP50菌液，于20℃恒溫箱中過夜培養[7]。

1.4 細胞培養

當大部分秀麗隱桿線蟲成蟲到達產卵初期，用15 mL離心管收集洗滌后的成蟲，以750×g離心1 min，棄去上清液，加入漂白液5 mL(新鮮5%次氯酸鈉溶液1 mL、5 mol·L-1NaOH溶液0.5 mL、雙蒸水3.5 mL，混勻，現用現配)；漩渦振蕩3～5 min至大部分成蟲裂解，使成蟲體內的蟲卵釋放；加入蟲卵緩沖液(含118 mmol·L-1的NaCl、48 mmol·L-1的KCl、2 mmol·L-1的CaCl2、2 mmol·L-1的MgCl2，25 mmol· L-1的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，過濾除菌)，以1 500×g離心1 min，棄去上清液，相同條件洗滌3次后，棄去上清液，保留1 mL的液體；加入1 mL 60%蔗糖溶液，混勻，使蟲卵懸浮于30%的蔗糖溶液，以1 500× g離心5 min，收集上清液中的蟲卵。用蟲卵緩沖液洗去蔗糖，收集蟲卵并加入含1 U·mL-1幾丁質酶的蟲卵緩沖液(過濾除菌)1 mL，于室溫下消化約45 min，鏡下觀察發現約90%的蟲卵卵殼被溶解后，置于EP管中于4℃、以900×g離心4 min，棄去上清液，加入1 mL的L-15培養基將管底沉淀的細胞混勻后900×g離心4 min，棄去上清液，加入1 mL的L-15培養基，混勻；用5 μm濾器過濾懸浮液至無菌EP管，獲取離散的秀麗隱桿線蟲胚胎細胞。將EP管于4℃、以900×g離心4 min，棄去上清液，用預先配制好的加有雙抗(50 U·mL-1青霉素、50 μg·mL-1鏈霉素)和10%胎牛血清的L-15完全培養基混勻胚胎細胞，調節細胞密度約1.5×106個·mL-1，備用。6孔板中預先放置一塊用多聚左旋賴氨酸包被并滅菌的蓋玻片，取100 μL細胞懸液滴加到蓋玻片中央，于20℃孵育2 h后再加入2 mL完全培養基，于20℃靜置4 h，至此胚胎細胞懸浮液制作完成[8-9]。

吸取50 μL蟲卵懸浮液與50 μL臺酚藍染色液于離心管中混合均勻，取少許混合液(約15 μL)白血球計數板上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞顯藍色，計數100～200個細胞，經檢查所有處理組細胞成活率均大于90%，滿足彗星實驗細胞成活率至少大于75%的要求[10-11]。

1.5 胚胎細胞的染毒

將洛克沙胂溶解于雙蒸水中，使質量濃度(以As計)分別達到100、500、1 000 μg·L-1，以雙蒸水作空白對照。胚胎細胞成活率檢測后，小心吸出液體培養基中的代謝產物和死細胞，取100 μL的液體培養基，加入配好洛克沙胂溶液100 μL，使染毒終濃度分別為50、250、500 μg·L-1洛克沙胂溶液，染毒1 h，并設置空白對照。以上操作均在黑暗條件下進行，且洛克沙胂溶液在使用前配制。

1.6 彗星實驗

彗星實驗參照Singh等[12]、王瑞國[13]的方法略加改進。每張玻片用熒光顯微鏡放大400倍拍照，每組至少隨機選擇50個不重疊的彗星影像進行拍照。每個處理組至少隨機選擇150個彗星圖像采用CASP軟件進行分析，以彗尾DNA百分比含量(TDNA%)、彗星尾長(TL)和Olive尾矩(OTM)[14-15]作為DNA損傷的評價指標。

1.7 統計分析

數據分析采用SPSS軟件(16.0版，SPSS Inc.)。不同處理組間差異采用單因子方差分析(One-way ANOVA)，不同處理組間差異顯著性采用Duncan檢驗(0.01

2 結果與分析（Results and analysis）

2.1 洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞成活率的影響

由圖1可知，空白對照組和各洛克沙胂染毒組線蟲胚胎細胞成活率均大于90%，說明胚胎細胞DNA損傷為洛克沙胂作用所致，而非細胞毒性。

圖1 不同濃度洛克沙胂暴露1 h對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞成活率的影響

圖2 不同濃度洛克沙胂暴露1 h對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的彗星圖像

2.2 洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA的損傷及彗星圖像分析

空白對照組和各洛克沙胂染毒組彗星圖像如圖2所示。由圖2可見，空白對照組的胚胎細胞DNA完整，細胞核大小均一，呈圓形熒光團，熒光強度均勻，邊緣光滑，彗星細胞無拖尾現象，DNA沒有明顯的損傷(圖2A)。50 μg·L-1洛克沙胂暴露濃度組胚胎細胞核中心呈一熒光紅點，周圍有一層“紅暈”，說明細胞DNA開始出現解體，呈松散狀態，彗星細胞開始出現拖尾現象(圖2B)。250、500 μg·L-1洛克沙胂暴露濃度組胚胎細胞DNA受損比較嚴重，均有一個像彗星一樣的拖尾，呈掃帚狀，類似彗星，并且隨著洛克沙胂濃度的增加，細胞核逐漸縮小，彗星尾長逐漸延長，尾部熒光強度逐漸增強，彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小(圖2C、D)，其損傷作用表現出顯著的濃度效應。圖3是經CASP彗星圖象分析軟件分析后，由于熒光強度的不同而顯示出彗頭和彗尾的清晰輪廓。

圖3 CASP彗星圖像分析

2.3 洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的影響及濃度-效應關系

不同濃度洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的影響效應如表1所示。各濃度組彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩均極顯著高于空白對照組(P<0.01)，且各濃度組彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩之間均有極顯著性差異(P<0.01)。彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩隨著洛克沙胂暴露濃度的增加而增高，彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩與洛克沙胂暴露濃度均具有極顯著正相關關系(r= 0.991，P<0.01；r=0.993，P<0.01；r=0.991，P<0.01)。

3 討論（Discussion）

線蟲是土壤動物區系中最為豐富的無脊椎動物，它們參與土壤有機質分解、植物營養礦化和養分循環等重要生態過程，在土壤生態系統腐屑食物網中占有重要地位[16-17]。線蟲因其形態特殊性、食物專一性、分離鑒定相對簡單，以及對環境的各種變化包括污染脅迫效應能做出較迅速的反應等特點，可將線蟲作為土壤污染效應研究的生物指標。彗星實驗通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度可定量測定單個細胞DNA損傷的程度[18]，因其簡便、快速、應用范圍廣、靈敏度高、所需細胞少而成為科研工作者進行環境監測、流行病學調查以及生態毒理學研究的有效工具，是檢測細胞遺傳毒性的常用方法。

在相同的實驗條件下，受損胚胎細胞的尾部DNA百分比含量以及彗星尾長與DNA損傷程度有關，故尾部DNA百分比含量以及彗星尾長是評價DNA損傷的重要參數，而Olive尾矩指標作為復合值，較單一的尾部DNA百分比含量以及彗星尾長指標有更高的準確性。本研究采用CASP軟件分析彗星圖像，使實驗結果更加客觀準確，避免了人為誤差[19]；而且OTM指標分析靈敏，結合其他指標進行對比分析將進一步提高SCGE技術的準確性和靈敏度。

表1 不同濃度洛克沙胂暴露1 h對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的實驗結果（平均值±標準差，n=150）Table 1 Results of DNA damage of embryonic cells inCaenorhabditis elegansinduced by different concentrations of roxarsone exposure for 1 h(mean±standard deviation,n=150)

本研究發現，在不同濃度洛克沙胂暴露后，秀麗隱桿線蟲胚胎細胞彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩均極顯著增加，DNA損傷均極顯著增加。研究表明，洛克沙胂暴露下會使抗氧化酶活性受到抑制，導致過量活性氧自由基的產生。劉耀川等[20]發現洛克沙胂引起大鼠肝臟和肺臟抗氧化酶(超氧化物歧化酶)活性顯著下降，孫永學[21]發現洛克沙胂可導致大白鼠肝勻漿和血清以及鯽魚腦抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、乳酸脫氫酶)活性的減弱，引起抗氧化物質(還原型谷胱甘肽)減少，而氧化產物(如丙二醛)增高。細胞在代謝過程中產生大量的自由基，可被體內抗氧化防御系統所清除同時，對活性氧自由基的清除能力減弱會導致過量活性氧自由基產生。這些自由基超過一定限度時，可分別與分子發生反應，產生氧化性損傷和生成加合物，最終導致DNA鏈斷裂和損傷[22-23]，這可能是洛克沙胂遺傳毒性的機制。

洛克沙胂對核酸物質具有較強的毒性，能導致DNA鏈斷裂。通過相關性分析得知，洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA的損傷效應呈很好的相關性，洛克沙胂的濃度與DNA損傷存在極顯著的濃度-效應關系，其相關系數>0.99，因此，秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷可作為洛克沙胂遺傳毒性的生物學指標。

本研究結果顯示，洛克沙胂的濃度與DNA損傷存在極顯著的濃度-效應關系，洛克沙胂可導致秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA明顯的斷裂和遷移，誘導了秀麗隱桿線蟲的遺傳損傷，秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷可作為洛克沙胂遺傳毒性的生物學指標。

目前關于洛克沙胂的環境影響的研究僅僅是初步的。為評價和控制洛克沙胂對環境的影響，還有很多工作要做。彗星實驗操作簡便、快速、靈敏度高，能夠反映出洛克沙胂的遺傳毒性。因此，通過彗星實驗建立實驗室檢測洛克沙胂遺傳毒性方法具有可行性。洛克沙胂導致秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA損傷的損傷機制還有待進一步研究。

（References）：

[1] Rutherford D W,Bednar A J,Garbarino J R,et al.Environmental fate of roxarsone in poultry litter.PartⅡ.

Mobility of arsenic in soil amended with poultry litter[J]. Environmental Science&Technology,2003,37(8):1515-1520

[2] 馬驛,陳杖榴.恩諾沙星對土壤微生物群落代謝功能多樣性的影響[J].生態毒理學報,2010,5(3):446-452

Ma Y,Chen Z L.Effects of enrofloxacin on the functional diversity of soil microbial communities[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2010,5(3):446-452(in Chinese)

[3] 王連生.環境有機化學[M].北京:化學工業出版社, 2004:228-244

[4] Singh N P,McCoy T,Tice R R,et al.A simple technique for the quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Experimental Cell Research,1988,175: 184-191

[5] United States Environmental Protection Agency(US EPA).Chemical Assessment Summary.Pentachlorophenol (CASRN 87-86-5)[R].Washington DC:National Center for Environmental Assessment,2001

[6] Leung M C,Williams P L,Benedetto A,et al.Caenorhabditis elegans:An emerging model in biomedical and environmental toxicology[J].Toxicological Sciences,2008, 106:5-28

[7] Brenner S.The genetics ofCaenorhabditis elegans[J]. Genetics,1974,77(1):71-94

[8] Shaham S.Methods in Cell Biology[M]//TheC.elegans Research Community.WormBook.2006.http://www. wormbook.org

[9] 黃鴻山,胡玉,盧偉偉,等.二氯苯醌對秀麗隱桿線蟲胚胎細胞DNA的損傷作用[J].環境與健康雜志,2014, 31(6):471-473

Huang H S,Hu Y,Lu W W,et al.Effects of 2,6-dichloro-1,4-benzoquinone on DNA in embryonic cells ofCaenorhabditis elegans[J].Journal of Environmental Health, 2014,31(6):471-473(in Chinese)

[10] Strober W.Trypan blue exclusion test of cell viability[J]. Current Protocols in Immunology,2001,A3:18-23

[11] Miranda D D C,Arcari D P,Ladeira M S P,et al.Analysis of DNA damage induced by aflatoxin B-1 in Dunkin-Hartley guinea pigs[J].Mycopathologia,2007,163(5): 275-280

[12] Singh N P,McCoy M T,Tice R R,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Experimental Cell Research,1988, 175(1):184-191

[13] 王瑞國.黃曲霉毒素B1致雛鴨肝細胞DNA損傷的研究[D].北京:中國農業科學院,2009:25-40

Wang R G.Study on the DNA damage induced by Afla-toxin B1in duckling hapetic cells[D].Beijing:Chinese A-cademy of Agricultural Sciences,2009:25-40(in Chinese)

[14] Olive P L,Wlodek D,Durand R E,et al.Factors influencing DNA migration from individual cells subjected to gel electrophoresis[J].Experimental Cell Research,1992, 198:259-267

[15] Ashby J,Tinwell H,Lefevre P A,et al.The single-cell gel electrophoresis assay for induced DNA damage(comet assay):Measurement of tail length and moment[J].Mutagenesis,1995,10:85-90

[16] Ingham R E,Trofymow J A,Ingham E R,et al.Interactions of bacteria,fungi,and their nematode grazers: Effects of nutrient cycling and plant growth[J].Ecological Monographs,1985,55:119-140

[17] Wardle D A.Impacts of disturbance on detritus food webs in agroecosystems of contrasting tillage and weed management practice[J].Ecological Research,1995,26:105-185

[18] 王瑞國,蘇曉鷗.改良彗星實驗檢測黃曲霉毒素B1致雛鴨DNA損傷[J].中國畜牧獸醫,2009,36(9):45-50

[19] Konca K,Lankoff A,Banasik A,et al.A cross-platform public domain PC image analysis program for the comet assay[J].Mutation Research,2003,534:15-20

[20] 劉耀川,宋淑英,張澤輝,等.洛克沙胂對大鼠SOD、GSH-Px、LDH、MDA等生化指標的影響[J].黑龍江畜牧獸醫,2015,6:238-240

[21] 孫永學.有機胂添加劑的生態毒性及毒性機理研究[D].廣州:華南農業大學,2003:37-63

Sun Y X.Study on ecological toxicity and mechanism of organoarsenical additives[D].Guangzhou:South China Agricultural University,2009:37-63(in Chinese)

[22] Walker C H.Avian forms of cytochrome P450[J].Environmental Health Perspectives,1998,106(52):613-620

[23] Goldstone J V,Goldstone H M.Cytochrome P450 1 genes in early deuterostomes(tunicates and sea urchins) and vertebrates(chicken and frog):Origin and diversification of the CYP1 gene family[J].Molecular Biology and Evolution,2007,24(12):2619-2631◆

Comet Assay Study on DNA Damage of Embryonic Cells in Caenorhabditis elegans Induced by Roxarsone

Gao Shangji,Zhong Xiaoxia,Liu Wanying,Wang Mianzhi,Sun Jing,Li Hongcheng,Sun Yongxue*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Development and Safety Evaluation,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China

30 December 2015 accepted 14 March 2016

To evaluate the genotoxicity of roxarsone,the present study investigated the damage effects of different concentrations of roxarsone on deoxyribonucleic acid(DNA)of embryonic cells inCaenorhabditis elegansby using the single cell gel-electrophoresis(SCGE).The extracted embryonic cells ofCaenorhabditis eleganswere exposed to 0(blank control),50,250,500 μg·L-1roxarsone for 1 h,respectively.The percentage of comet tail DNA(TDNA%),the comet tail length(TL)and Olive tail moment(OTM)were used as the indicators of DNA damage.The results showed that,TDNA percentage,TL and OTM in all treatment groups increased significantly compared with these in the control group(P<0.01).TDNA percentage,TL and OTM increased gradually according to the increased concentrations of roxarsone.The correlation coefficient ofrgreater than 0.99,which indicated that the con-centration-effect relationship was observed in the experimental concentration range.Roxarsone had damage effect on DNA of embryonic cells inCaenorhabditis elegans.Comet assay was simple,fast,and highly-sensitive to reflect the genotoxicity of roxarsone.Thus,as a laboratory based method,it is practical to detect the genotoxicity of roxarsone by using comet assay.

roxarsone;Caenorhabditis elegans;comet assay;DNA damage;genotoxicity

2015-12-30 錄用日期：2016-03-14

1673-5897（2016）3-167-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151230001

簡介：孫永學(1969—)，男，博士，教授，研究方向為獸藥安全性評價、生態毒理學。

國家自然科學基金項目(31172368)

高上吉(1989-)，男，碩士研究生，研究方向為獸醫藥理學與毒理學，E-mail:710648618@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:sunyx@scau.edu.cn