比較兩種RAD54啟動子調控的全酵母發光細胞對化學誘變原的評價效果

田永杰，徐秀舉，陸益新，王超，周天祺，李湘鳴

揚州大學醫學院預防醫學教研室，揚州225001

比較兩種RAD54啟動子調控的全酵母發光細胞對化學誘變原的評價效果

田永杰，徐秀舉，陸益新，王超，周天祺，李湘鳴*

揚州大學醫學院預防醫學教研室，揚州225001

通過分子生物學技術構建2種不同RAD54啟動子調控的yEGFP重組報告載體pRAD54-yEGFP和pRAD54S-yEGFP，前者啟動子DNA為1.8 kb，后者為0.5 kb，分別轉入W303-1A酵母細胞，構建2種啟動子調控的發光酵母細胞，用不同化學誘變原作用后，用流式細胞儀和多功能發光儀測定酵母的發光強度。結果發現2種啟動子調控的酵母細胞的發光強度均與化學誘變原(甲磺酸甲脂、4-硝基-N-氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明顯的劑量效應關系，但是W303-1A/RAD54-yEGFP劑量效應關系較為明顯，產生的最大誘導倍數(5.96、2.19和2.71)明顯高于W303-1A/RAD54S-yEGFP所產生的最大誘導倍數(2.53、1.50和1.91)，可能與啟動子序列中轉錄因子的數量以及轉錄因子間協同增效作用有關。同時發現，流式細胞儀測定效果明顯優于發光儀測定效果。所以在構建RAD54啟動子調控重組酵母細胞篩選誘變時，選用全啟動子序列效果較好。

化學誘變原；RAD54啟動子；酵母細胞；綠色熒光蛋白；劑量效應關系

田永杰,徐秀舉,陸益新,等.比較兩種RAD54啟動子調控的全酵母發光細胞對化學誘變原的評價效果[J].生態毒理學報，2016,11(3):251-257

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DNA毒性化合物(化學誘變物，簡稱誘變物)是指一大類可對生物大分子遺傳物質產生毒性的化合物。這類化合物所造成的環境污染潛在性危害較大，因為其多數具有致癌性。隨著我國經濟的發展，新化學物在不斷的出現，需要評價致突變性的化學物數量劇增，但是現行標準的體外致突變實驗費時、成本高，遠不能滿足需求，迫切需要發展快速的高通量方法。因此，建立高效、快速、自動化、敏感、相對可靠、高通量地篩選這類化合物的評價方法，具有十分重要的現實意義。

釀酒酵母細胞的RAD54基因位于第七號染色體上，編碼區全長約3 613 bp，開放性閱讀框(ORF)為2 694 bp[1]，通過對GenBank中RAD54基因組的檢索發現RAD54基因的上游是SUT1基因，下游是YRB30基因，在RAD54基因和SUT1基因之間分別是兩者的啟動區，大小約1.8 kb。RAD54蛋白是致DNA斷裂誘變原誘導的一種特異性表達的酵母蛋白，對該基因突變會使細胞對X-射線等致DNA斷裂誘變原的敏感性大大增加。有學者認為該基因與DNA的損傷后的同源重組修復有關，因為許多化學誘變原均會誘導酵母細胞RAD54基因高效表達[2]。進一步研究發現，當化學誘變原作用于酵母細胞造成雙股DNA斷裂時，會使許多有關DNA修復基因的表達量大大增加[3]。因此，許多學者利用分子生物學技術，將RAD54啟動子與報告基因相融合，構建成重組酵母細胞，用于高通量篩選化學誘變原[4-6]。但是，由于RAD54基因的啟動子范圍目前仍然沒有完全研究清楚，在構建重組酵母細胞，用于快速高通量篩選化學誘變原，所選用的啟動區范圍均不相同。有的選用RAD54基因和SUT1基因之間的全部序列作為啟動子[7-9]；有的則選用-500 bp以下的DNA序列作為啟動子[10-11]。啟動子不同對化學誘變原的篩選敏感性則不同。兩者何者用于對化學誘變原的篩選效果較好，目前國內外未見報道。因此，研究比較2種啟動子對化學誘變原篩選的敏感性，對選用何種重組酵母細胞對化學誘變進行篩選，具有現實的指導意義。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 材料

質粒pLZ-yEGFP，大腸桿菌DH5α，酵母W303-1A(基因型:MATα，leu 2-3，112 ura3-1，trp1-1，his3-11，15 ade2-1)由本實驗室保存(揚州大學醫學院衛生毒理學實驗室)；限制性內切酶和T4連接酶購自TaKaRa公司；所用質粒提取試劑盒和純化試劑盒來自AxyGen公司；用普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；倒置熒光顯微鏡(尼康Ti-U)由日本Nikon公司生產；多功能酶標儀(Bio-Tek Synergy2)由美國伯騰公司生產；引物由中科華大博科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RAD54全啟動子調控的yEGFP報告載體的構建

1.2.1.1 RAD54全啟動子克隆

根據文獻[12]報道的方法提取酵母基因組，根據GenBank所報道的RAD54啟動子序列以酵母基因為模板，PCR擴增RAD54啟動子。由于RAD54啟動子較長，加之在(242 bp和1 393 bp)處有Hind III酶切位點，故采用分段的方法擴增RAD54啟動子。首先擴增上1/2片段，引物設計為上游5′-AAAAAGCTT GAAGTTTAGATGAGTAAGGAA-3′，下游為5′-TAGGGATCCTAATACGGTATAACGTAAACC-3′，引物兩端分別增設3個保護堿基及Hind III和BamH I兩酶切位點(下劃線所示)；RAD54啟動子下1/2片段引物設計為上游5′-TTAGGATCCCTATAAGGGTTCCTTCGGGAGGA-3′，下游5′-TCTACCGGTCAGTTATAAGGAAATATATATG-3′，引物兩端分別增設BamH I和Age I兩酶切位點(下劃線所示)和保護堿基。

上1/2片段的PCR產物經DNA試劑盒回收純化后，與pLZ-yEGFP一并用Hind III和BamH I酶切，將其與載體pLZ-yEGFP用T4連接酶相連，將所構建的載體命名為pRAD54-1-yEGFP；下1/2片段的PCR產物經純化，與pRAD54-1-yEGFP一并用BamH I和Age I進行雙切，并用T4連接酶相連，從而構建成RAD54全啟動子調控的yEGFP酵母報告載體，將其命名為pRAD54-yEGFP(見圖1)。

圖1 pRAD54-yEGFP酵母報告載體

1.2.1.2 -500 bp RAD54啟動子的克隆

劃線接種pRAD54-yEGFP菌液于LB/AMP平板，37℃培養18～20 h。再挑取單克隆于5～6 mL的LB/AMP培養液中，37℃振蕩培養過夜，用Axy-Gen試劑盒提取質粒，將pRAD54-yEGFP載體用Hind III進行酶切。酶切產物經1.0%瓊脂糖電泳分析，用DNA純化試劑盒切膠回收載體片段。經T4連接酶連接，連接產物轉化于感受態DH5α，用LB/ Amp平板篩選出陽性轉化子。挑取10個轉化子克隆于LB/Amp培養液中，小量提取質粒進行酶切鑒定，測序，將所構建載體命名為pRAD54S-yEGFP(見圖2)。

圖2 pRAD54S-yEGFP酵母報告載體

1.2.2 RAD54和RAD54S啟動子調控的重組yEGFP酵母細胞的建立

用醋酸鋰方法分別將pRAD54-yEGFP和pRAD54S-yEGFP轉化于感受態酵母細胞W303-1A，用SD/-ura選擇性培養板篩選陽性克隆。提取酵母DNA，對重組酵母細胞進行PCR鑒定，引物分別選用yEGFP的上下游引物。在所挑取4個轉化子克隆中發現有3個克隆中有yEGFP目的基因(約700 bp)(圖片省略)。說明RAD54和RAD54S啟動子調控的重組yEGFP發光酵母細胞的構建成功。

1.2.3 實驗研究

根據文獻[13-15]報道化學誘變原作用最佳時間為10～16 h，故用以下不同DNA作用水平的誘變原對細胞作用12 h，進行劑量效應研究。

(1)使DNA發生烷基化的誘變原：甲磺酸甲脂(methylmethanesulfonate,MMS)，其終濃度為400、200、100、25、6.25、1.56和0 μg·mL-1。(2)使DNA發生斷裂的誘變原：4-硝基-N-氧化喹啉(4-nitroquinoline-noxide,4-NQO)，其終濃度為5、1.25、0.32、0.08、0.04、0.02和0 μg·mL-1。(3)抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-F)，其終濃度為500、250、62.5、16、4、1和0 μg·L-1。(4)非基因毒性物質：秋水仙堿(colchicine)，其終濃度為250、125、62.5、31、16、4和0 μg·L-1。刀豆氨酸(canavanine)和四環素(tetracycline)，其終濃度分別為100、50、25、6.25、1.6、0.4和0 μg·mL-1。以上各劑量組均設3個復孔，對照(0)均選用各自化學物的溶劑。

1.2.4 統計方法

用Excel軟件對資料進行分析處理。多功能發光儀所測發光度用相對發光度表示(發光強度/ OD600)；流式細胞儀測定10 000個細胞的平均發光強度[16]；各劑量組復孔結果用均數±標準差表示；用誘導倍數描述劑量效應關系；誘導倍數為受試物濃度組所產生的發光度與空白對照發光度之比，其超過1.5倍并存在明顯的劑量效應關系，可判斷受試物為陽性[17]。

2 結果（Results）

2.1 熒光顯微鏡下觀察

圖3為2種不同RAD54啟動子調控的重組酵母細胞經過MMS的誘導后，在熒光顯微鏡下觀察結果，2種細胞均發出清晰、耀眼的熒光，呈散狀分布，與對照明顯不同。但是，在相同的放大倍數和相同的激發波長下，肉眼不能發現2種細胞的發光數量和亮度有明顯差異。

圖3 在熒光顯微鏡下觀察重組酵母細胞W303-1A/RAD54-yEGFP和W303-1A/RADS54-yEGFP

圖4 MMS誘導濃度和重組酵母細胞發光度的劑量效應關系

2.2 DNA烷基化誘變原的評價

選用MMS作為這類化學物的代表。圖4可見W303-1A/RAD54-yEGFP和W303-1A/RAD54S-yEGFP酵母細胞經MMS作用12 h后，細胞的發光度與MMS均有明顯的劑量效應關系，并在200 μg· mL-1時效應達高峰。W303-1A/RAD54-yEGFP劑量效應較明顯關系，最大誘導倍數達5.96，而W303-1A/RAD54S-yEGFP最大誘導倍數為2.53。同時也可看到，流式細胞儀測定方法的敏感性優于發光儀。

2.3 DNA發生斷裂誘變原的評價

圖5為使DNA發生斷裂的誘變原4-NQO與2種RAD54啟動子調控的yEGFP酵母細胞的劑量效應關系，從流式細胞儀所測結果來看，W303-1A/ RAD54-yEGFP與4NQO有明顯的劑量效應關系，在0.04 μg·mL-1以上濃度組，誘導倍數均超過1.5，最高為2.19，而W303-1A/RAD54S-yEGFP雖然亦有劑量效應關系，但不及前者明顯，最大誘導倍數僅為1.78。從用發光儀檢測結果來看，W303-1A/RAD54-yEGFP在0.32 μg·mL-1以上組有一定的劑量效應關系，最大誘導倍數為1.74；雖然W303-1A/RAD54S-yEGFP在0.32 μg·mL-1以上濃度組誘導倍數明顯升高，但是，由于細胞毒性的原因，其OD 600和yEGFP發光度已降至本底水平，分別為0.138和740，所以這種升高實際上是細胞毒性所致。

圖5 4-硝基-N-氧化喹啉（4NQO）濃度和重組酵母細胞發光度的劑量效應關系

圖6 5氟尿嘧啶誘導濃度和重組酵母細胞發光度的劑量效應關系

2.4 抑制DNA合成酶或拓撲異構酶誘變原的評價

圖6所示為抑制DNA合成酶誘變原5-F對2種RAD54啟動子調控的發光酵母細胞的實驗結果，可見經12 h作用后，經流式細胞儀和發光儀測定，發現W303-1A/RAD54-yEGFP與5-F有劑量效應關系，最大誘導倍數分別為2.53和2.71，而W303-1A/RAD54S-yEGFP經用流式細胞儀檢測發現有劑量效應關系，最高誘導倍數為1.91，但是，在用發光儀檢測時，未發現有劑量效應關系。

2.5 非基因毒性化學物的評價

選用秋水仙堿、刀豆氨酸和四環素對細胞有毒性的非基因毒性化合物進行特異性研究，經用流式細胞儀和發光儀檢測，以及熒光顯微鏡觀察，均未發現2種細胞的發光度與對照有明顯的差別(資料省略)，說明兩者均有較好的特異性。

3 討論（Discussion）

當化學物使DNA損傷或合成阻斷時，可同時誘導多個基因的轉錄表達，以提高細胞的修復能力。RAD54編碼涉及發生DNA重組損傷修復的ATP酶，當外來誘變物使DNA發生重組后，RAD54可大量表達[18]。因此，國外許多學者將RAD54啟動子與某些報告基因相融合，構建成重組酵母細胞，用于快速、高通量篩選化學誘變原，但是，所選啟動子的大小卻不盡相同。Cole等[8]將RAD54閱讀框上游406 pb堿基(-406 bp)與Lac Z報告基因相融合，發現Lac Z基因的表達量，與DNA的損傷有關，并進一步研究發現在-406 bp內有一29 bp的DNA損傷調控序列(Damage Regulatory Sequence,DRS)，對化學誘變原的反應起著至關重要的作用，它的缺失將會失去對誘變原的響應。所以，有些學者為了克隆方便，多選用-500 bp以內含有DRS的DNA序列作為啟動子[2,10,19]。但是，也有學者選用RAD54開放性閱讀框(ORF)上游和SUT1基因之間的全部序列(-1.8 kb區)作為啟動子[8-9,20]。因此，比較2種啟動子的敏感性，對指導誘變原的篩選具有十分重要的現實意義。

啟動子是指一段能被RNA聚合酶特異性識別和結合，能正確有效地起始轉錄的一段DNA調控序列，一般位于基因5’端上游區域。在真核類基因的轉錄起始階段，激活轉錄因子與基因上游的調控位點結合從而激活基因的轉錄。在真核基因的表達調控中，多數真核基因具有2個或2個以上的轉錄調控位點，單個位點的轉錄激活效率最低，多個調控位點對基因轉錄具有協同性[21]。本研究發現-1.8 kb區啟動子所構建的重組酵母細胞，對誘變原的敏感性明顯優于-500 bp所調控的酵母細胞。這是因為酵母高頻轉錄基因的內含子中存在一些可能的轉錄正調控位點，如在RAD54啟動子中有數個正向轉錄因子(ABF1 12個，TAF 11個，GCN4 4個，ADR1 2個，REB1 1個)，而RAD54S中正向轉錄因子結合位點較少(ABF1 4個，TAF 3個，GCN4 1個)。2種啟動子所調控的重組酵母細胞在對化學誘變原的評價敏感度上的差異這可能與正向轉錄因子的數量以及轉錄因子的協同增效作用有關[22-23]。

對誘變原的篩選敏感性除了與啟動子的選擇有關外，還與所使用的方法或儀器有關。發現用流式細胞儀的敏感性優于發光儀，這主要是流式細胞儀可以定量地觀察一定細胞數量的發光強度，而發光儀所測的發光強度，受到細胞數量不同的影響，需要用OD 600進行校正[24]，而當化合物對細胞的毒性較大時，會使OD 600低于0.300以下，從而造成較大的誤差(如圖5)，因為，OD 600在大于0.300以上時，才能較好反映細胞的數量。

雖然用yEGFP作為報告基因有許多優點，但是，其發射峰位于培養基、組織培養器材及細胞成分等產生的熒光背景范圍之內，許多凋亡的細胞也可產生熒光，故具有較高的“背景噪聲”，所以，在進行熒光定量研究時，最好與倒置熒光顯微鏡結合起來，但是，用倒置熒光顯微鏡進行定性效果較好，因為，鏡下所觀察的發光強度通常受激發光的強度、曝光時間、放大倍數等因素的影響。

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Oxidative Damage and Cell Cycle Arrest in Rat C6 Astroglial Cells Induced by Tri-ortho-cresyl Phosphate

Tian Yongjie,Xu Xiuju,Lu Yixin,Wang Chao,Zhou Tianqi,Li Xiangming*

Preventive Medicine Department,Yangzhou Medical College,Yangzhou University,Yangzhou 225001,China

13 November 2015 accepted 4 May 2016

Two yEGFP yeast reporter vectors,pRAD54-yEGFP and pRAD54S-yEGFP,regulated by two RAD54 promoters,were constructed by a molecular biological technique.The DNA lengths of the two promoters are 1.8 and 0.5 kb.These two vectors were transformed into W301-A yeast cells to construct the whole fluorescent yeast cells regulated by the two RAD54 promoters,which were named as W303-1A/RAD54-yEGFP and W303-1A/ RAD54S-yEGFP.After that,the whole yeast cells were treated by different chemical mutagens(methylmethanesulfonate,4-nitroquinoline-noxide and 5-fluorouracil)and their fluorescent densities were measured on a flow cytometer and a multifunctional luminous instrument.The fluorescent densities from the two types of yeast cells both exhibit significant dose effect relationships with methylmethanesulfonate,4-nitroquinoline-noxide and 5-fluorouracil concentration.The dose effect relationships of W303-1A/RAD54-yEGFP are more obvious.The maximum fold ofinduction of W303-1A/RAD54-yEGFP are 5.96,2.19 and 2.71,while those of W303-1A/RAD54S-yEGFP are 2.53,1.50 and 1.91.Such differences may be related to the number and synergy of transcription factors.Meanwhile,the results from flow cytometry are more sensitive than that of the multifunctional luminous instrument. When constructing a recombinant yeast cell regulated by RAD54 promoter for screening mutagens,it is suggested to choose the whole sequence of the RAD54 promoter.

chemical mutagen;RAD54 promoter;yeast cell;yEGFP;dose effect relationship

2015-11-13 錄用日期：2016-05-04

1673-5897（2016）3-251-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151113003

簡介：李湘鳴(1957-)，教授，碩士生導師，主要研究方向為現代分子生物學技術在預防醫學中的應用。

國家自然科學基金(81041111)

田永杰(1989-)，男，碩士研究生，研究方向為分子毒理學，E-mail:354097170@qq.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:847264344@qq.com