2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的相互作用機理研究

黃鳴，鄒路易,*，滕躍，杜憲正，房曉燕

1.江南大學環境與土木工程學院江蘇省厭氧生物技術重點實驗室，無錫214122

2.臨沂市農業環境保護監測站，臨沂276001

2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的相互作用機理研究

黃鳴1，鄒路易1,*，滕躍1，杜憲正1，房曉燕2

1.江南大學環境與土木工程學院江蘇省厭氧生物技術重點實驗室，無錫214122

2.臨沂市農業環境保護監測站，臨沂276001

2-巰基噻唑啉是一種被廣泛應用的抗腐蝕劑和光亮劑，然而它的一些殘留物會對環境造成損壞，為探究2-巰基噻唑啉的毒性作用，采用光譜學技術和分子對接技術來考察2-巰基噻唑啉和過氧化氫酶的相互作用影響，其中酶活性實驗表明2-巰基噻唑啉會抑制過氧化氫酶的活性，分子對接結果顯示2-巰基噻唑啉會結合在過氧化氫酶的活性位點處，并最終導致過氧化氫酶空間結構和微環境的變化，根據熒光測試結果，表明2-巰基噻唑啉和過氧化氫酶之間的猝滅方式為靜態猝滅。通過測量不同溫度下的結合位點數、結合常數以及熱力學常數，顯示2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶主要通過氫鍵和范德華力相結合。該研究從分子水平上考察了2-巰基噻唑啉對蛋白質的毒性作用，對于闡明污染物的毒性機理具有重要意義。

2-巰基噻唑啉；過氧化氫酶；多種光譜技術；分子對接

黃鳴,鄒路易,滕躍,等.2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的相互作用機理研究[J].生態毒理學報，2016,11(3):258-264

Huang M,Zou L Y,Teng Y,et al.Interaction mechanism between 2-mercaptothiazoline and catalase[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3): 258-264(in Chinese)

過氧化氫酶(catalase，CAT)是一種大量存在于肝臟中的氧化還原酶，能催化H2O2分解成H2O和O2，從而清除在細胞中的H2O2，使其不再進一步產生毒性很大的羥基自由基，是一種重要的肝臟保護酶[1]。近來有研究報道過氧化氫酶和某些腫瘤、糖尿病、衰老及氧化應激有關，但其機理尚不明確[2-3]。

2-巰基噻唑啉(2-mercaptothiazoline，2-MT)是一種雜環有機化合物，可作為一種抗腐蝕劑，光亮劑，橡膠抗氧化劑廣泛應用于各種工業生產中[4]，據報道，該物質存在于江河、城市徑流等環境中，因此，2-巰基噻唑啉及其殘留物會對環境造成危害[5]。2-巰基噻唑啉對實驗動物的毒性作用已有較多的報道,其對哺乳動物的甲狀腺具有顯著毒性[6]。然而從分子水平評價2-巰基噻唑啉對免疫系統關鍵酶的毒性影響尚未見報道，本文采用多種光譜技術和分子對接法研究了2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的毒性作用機理，通過探討2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的活性和骨架結構的影響，以及兩者之間的結合位點，結合常數和作用力類型，本研究可以將為評價2-巰基噻唑啉的毒性提供基礎數據和參考。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

過氧化氫酶(取自牛肝)購于美國Sigma公司，配制成1.0×10-5mol·L-1的儲備液，放置在0～4℃的冰箱中保存。2-巰基噻唑啉購于國藥集團化學試劑有限公司，配制成1.0×10-3mol·L-1的儲備液于0～4℃的冰箱中保存。0.2 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)作為緩沖溶液，購于國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 過氧化氫酶活性測定

過氧化氫酶活性可以利用分光光度法測定過氧化氫溶液在240 nm處的吸光度的變化，過氧化氫酶活性抑制率可以通過以下公式計算得到[7]：

ΔA1和ΔA0是在2-巰基噻唑啉分別存在和不存在時，過氧化氫溶液在240 nm處2 min內吸光度的變化值。

1.2.2 紫外可見吸收光譜

UV-6100雙光路紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)，用于紫外可見吸收光譜的測量，狹縫寬度為2 nm，掃描范圍為200～240 nm。

1.2.3 熒光光譜

RF-5301PC分子熒光分光光度計(日本Hitachi公司)用于所有熒光光譜的測量，激發波長為280 nm，激發和發射光狹縫均為5 nm，掃描范圍為280～500 nm。

同步熒光測量的波長差Δλ分別為15 nm(掃描范圍為260～340 nm)和60 nm(掃描范圍為300～400 nm)，激發和發射光狹縫均為5 nm。

1.2.4 圓二色譜

MOS-450/AF-CD圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司)用來測定CD光譜值，寬帶為4 nm，掃描范圍為200～260 nm，掃描速度為1 nm·2s-1。

1.2.5 分子對接

分子對接利用AutoDock 4.2軟件完成，過氧化氫酶的分子結構(1TGU.pdb)從Protein Data Bank數據庫獲得[8]，2-巰基噻唑啉分子的3D結構從網站(http://zink.docking.org/)下載[9]。利用AutoDock軟件探索了2-巰基噻唑啉的中心位置和可旋轉鍵，對過氧化氫酶進行去水、加氫、加電荷的操作，在過氧化氫酶分子上設置模擬范圍后，選取LGA的計算方法進行分子對接的模擬計算，最后選取結合自由能最低的構象用于后續分析。

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶活性影響

2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的活性影響見圖1[10]，從圖中可以看出，對于每一組染毒時間，隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，過氧化氫酶的活性是降低的。另外，當2-巰基噻唑啉不存在的時候，可以發現，染毒時間對過氧化氫酶的活性沒有影響，但是，當2-巰基噻唑啉存在時，染毒時間就會影響過氧化氫酶的活性。對于濃度為3×10-5mol·L-1和1× 10-4mol·L-1的2-巰基噻唑啉，當染毒時間達到120 min時，發現過氧化氫酶的相對活性分別下降至最初的(0 min)78.6%和84.3%，由此我們可以得出，2-巰基噻唑啉的濃度和染毒時間都會對過氧化氫酶的活性產生顯著影響。

圖1 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的活性影響圖

圖2 不同濃度2-巰基噻唑啉下過氧化氫酶的紫外可見吸收光譜圖

圖3 過氧化氫酶的同步熒光光譜圖

2.2 過氧化氫酶空間結構變化的研究

2.2.1 紫外可見吸收光譜

紫外可見吸收光譜是一種可以用來探索蛋白質骨架結構變化的方法，我們可以從圖2中看出，在205 nm處過氧化氫酶有很強的一個吸收峰，隨著2-巰基噻唑啉的濃度不斷增加，過氧化氫酶的最大吸收峰的值不斷降低，并伴有紅移，表明2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的骨架結構有影響，并使過氧化氫酶的骨架變得松散[11]。

2.2.2 同步熒光光譜

同步熒光能夠靈敏地反映生色團微環境的變化[12]。通過固定激發與發射的波長差(Δλ)，采用同步掃描激發和發射器，就可以得到同步熒光光譜圖，它可以用來判斷蛋白質的結構變化，當固定波長差(Δλ)分別為15 nm和60 nm時，掃描得到的同步熒光光譜給出的分別是酪氨酸和色氨酸的特征信息[13-14]。圖3a顯示隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，發射峰的位置幾乎沒有發生明顯的移動，由此可以看出2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶作用之后對酪氨酸殘基所處的微環境作用影響不大。圖3b可以看出隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，發射峰有了明顯的紅移(335.5～343.6 nm)，紅移說明了過氧化氫酶的結構發生了變化，色氨酸微環境的親水性增強。

圖4 2-巰基噻唑啉和過氧化氫酶作用后的CD光譜圖

2.2.3 圓二色譜

圓二色譜可以較準確地反映蛋白質二級結構的變化。從圖4中可以看出，過氧化氫酶的CD光譜在208 nm和222 nm處有2個負峰，它反映的是蛋白質α螺旋的特征信息[15]。然后我們利用CDPro軟件可以得出過氧化氫酶分子中α螺旋，β折疊以及無規則卷曲的含量。從表1可以看出隨著2-巰基噻唑啉濃度的增大，α螺旋降低了0.7%，β折疊增加了0.4%，這就說明2-巰基噻唑啉過氧化氫酶二級結構產生了一定的影響，使其二級結構發生改變[16]。

2.2.4分子對接

為了確定2-巰基噻唑啉在過氧化氫酶上的具體結合位置，本實驗采用分子對接的方法來對兩者的結合位置進行模擬。圖5a為2-巰基噻唑啉在過氧化氫酶分子上最可能的結合位置，從圖中可以看出2-巰基噻唑啉結合在過氧化氫酶D鏈的活性位點附近，這可能會影響過氧化氫酶的催化活性。圖5b為兩者結合位點的局部圖，分子對接結果表明2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的主要作用力為氫鍵和范德華力，在2-巰基噻唑啉分子上的H原子與過氧化氫酶A鏈GLU70氨基酸殘基上的OE1原子間存在氫鍵作用，在二者的結合的過程中也存在靜電力和疏水力，但氫鍵和范德華力起主要作用。

圖5 2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的結合位置（a）和兩者結合的局部（b）圖（虛線表示氫鍵作用）

表1 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶二級結構含量變化的影響Table 1 Effects of 2-MT on the percentage of secondary structural elements in CAT at 291 K

圖6 2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶熒光強度的影響

圖7 在不同溫度下2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶作用后的Stern-Volmer圖

2.3 過氧化氫酶與2-巰基噻唑啉的結合特性

2.3.1 熒光猝滅

過氧化氫酶在330 nm處具有較強的熒光峰(見圖6)，隨著2-巰基噻唑啉濃度的增加，過氧化氫酶的熒光峰強度不斷下降，說明2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的熒光具有猝滅作用，二者之間存在相互作用。熒光猝滅分為靜態猝滅和動態猝滅。本實驗根據Stern-Volmer方程進一步判斷熒光猝滅的類型[17]。

式中F0和F分別為未加入和加入猝滅劑時的熒光強度，KSV為Stern-Volmer猝滅常數，kq為猝滅速率常數，τ0為無猝滅劑存在時熒光分子的平均壽命(其值為10-8s[18])，[Q]為猝滅劑的濃度。

當猝滅常數隨著溫度的升高而增大，則猝滅類型為動態猝滅。當猝滅常數隨著溫度的升高而減小，則為靜態猝滅。從表2可以看出KSV隨著溫度的升高而下降，可以判斷2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的猝滅類型為靜態猝滅。而且，動態猝滅常數的最大值為2.0×1010L·mol-1·s-1[19],在本實驗中，不同溫度下的Kq值都遠大于2.0×1010L·mol-1·s-1，從而進一步驗證了2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的猝滅類型為靜態猝滅。

2.3.2 結合常數

對于靜態猝滅，小分子和蛋白質的結合常數和結合位點數可以通過以下公式得到[20]：

式中F0，F和[Q]與公式(2)的表示一致，Ka為結合常數，n為結合位點數。

表2 在不同溫度下2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶相互作用的Stern-Volmer猝滅常數Table 2 Stern-Volmer quenching constants for the interaction of 2-MT with CAT at different temperatures

由表中數據可知，在不同溫度下的Ka和n值，n值約為1，表明二者的結合位點數為1，即二者以約1：1的比例結合，Ka值反映了二者之間的作用力較強[21]。

2.3.3 作用力判斷

小分子與生物大分子之間的作用力包括很多類型，包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，在本試驗中模擬的是生物體內環境，因此條件比較溫和溫度變化不大，反應的焓變ΔHo可視作常數，可以根據熱力學公式計算出小分子與生物大分子作用間的相關熱力學參數。

其中K等同于公式(3)中的Ka，R為理想氣體常數。

Ross等[22]根據大量的試驗結果，總結出了小分子與生物大分子作用的有關熱力學參數可以簡單判斷其相互作用類型：若ΔHo>0及ΔSo>0主要表現為疏水作用；ΔHo<0及ΔSo>0要表現為靜電作用；ΔHo<0及ΔSo<0主要表現氫鍵或者范德華作用。

根據表3所示的結合常數Ka，帶入公式(4)(5)計算，并以lnK對T-1作圖8求得二者結合過程的熱力學函數列于表3。從表3數據可以看出ΔGo值為負值，說明2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶的結合作用是自發進行[23]，ΔHo和ΔSo值均為負值說明2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶之間主要通過氫鍵和范德華力相互結合。

本文利用了光譜和分子對接技術研究了2-巰基噻唑啉對過氧化氫酶的分子毒性作用機理，結果表明，2-巰基噻唑啉通過氫鍵和范德華力自發地與過氧化氫酶按1：1的比例相結合，結合在過氧化氫酶的活性位點處附近，從而導致過氧化氫酶的空間結構發生改變，并對過氧化氫酶的活性產生抑制作用。該研究為從分子水平上考察2-巰基噻唑啉的毒性作用機理，也為2-巰基噻唑啉的環境風險評價提供了重要依據。

圖8 2-巰基噻唑啉與過氧化氫酶作用的van't Hoff圖

表3 過氧化氫酶和2-巰基噻唑啉體系的結合常數與熱力學參數Table 3 Binding constants and relative thermodynamic parameters of the 2-MT-CAT system

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Interaction Mechanism between 2-Mercaptothiazoline and Catalase

Huang Ming1,Zou Luyi1,*,Teng Yue1,Du Xianzheng1,Fang Xiaoyan2

1.Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology,School of Environmental and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China
2.Linyi Agricultural Environmental Protection Monitoring Station,Linyi 276001,China

12 September 2015 accepted 11 November 2015

2-Mercaptothiazoline(2-MT)is a kind of widely used corrosion inhibitor and brightener.The residue of 2-MT in the environment is potentially harmful.To evaluate the toxicity of 2-MT at the protein level,the effects of 2-MT on catalase(CAT)were investigated by multiple spectroscopic techniques and molecular modeling.The enzyme activity experiment indicated that the CAT activity was inhibited by 2-MT.Molecular docking results revealed that 2-MT bound into the CAT active site,which further led to some secondary structure and micro-environmental changes of CAT.According to the fluorescence results,the quenching mechanism of fluorescence of CAT by 2-MT was a static quenching procedure.The number of binding sites n,the binding constant k and the thermodynamic parameters at different temperatures were also measured.The results indicated that 2-MT can interact with CAT to form a complex mainly by van der Waals'interactions and hydrogen bonds.In this paper,we studied the toxic mechanism between 2-mercaptothiazoline and protein at the molecular level,which will consequently be significantto learn the toxic effect of pollutants.

2-mercaptothiazoline;catalase;multi-spectroscopic techniques;molecular docking

2015-09-12 錄用日期：2015-11-11

1673-5897（2016）3-258-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150912001

簡介：鄒路易(1964-)，男，副教授，碩士生導師，主要研究方向為環境污染防治。

國家自然科學基金(21307043)

黃鳴(1991-)，男，碩士研究生，研究方向為環境毒理學，E-mail:1074982512@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:lyzou@jiangnan.edu.cn