亞砷酸鈉對酵母細胞抗氧化酶活性和脂質過氧化的影響

吳麗華，陳燕飛，陳鵬，儀慧蘭

1.太原師范學院生物系，太原030031

2.山西大學生命科學學院，太原030006

亞砷酸鈉對酵母細胞抗氧化酶活性和脂質過氧化的影響

吳麗華1，陳燕飛1，陳鵬1，儀慧蘭2,*

1.太原師范學院生物系，太原030031

2.山西大學生命科學學院，太原030006

以模式生物釀酒酵母為材料，研究亞砷酸鈉對細胞生長、抗氧化酶活性、丙二醛(MDA)含量及胞內活性氧(ROS)水平的影響。結果顯示，加入亞砷酸鈉(終濃度0.1～0.6 mmol·L-1)后，培養液在600 nm處的光密度值(OD600值)低于對照組，并呈濃度依賴性降低。經亞砷酸鈉處理12 h后，酵母細胞中過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)活性均增高，但胞內ROS水平和MDA含量與對照組無顯著差異。砷處理24 h后，POD在0.2 mmol·L-1砷處理組中活性最高，而CAT、SOD和T-AOC活性呈濃度依賴性增高；胞內ROS水平和MDA含量在高濃度砷組(0.4和0.6 mmol·L-1)顯著增高。結果表明，亞砷酸鈉可抑制酵母細胞生長，改變細胞內抗氧化酶活性，較高濃度時可引起細胞氧化損傷。

亞砷酸鈉；酵母菌；抗氧化物酶；丙二醛；ROS

吳麗華,陳燕飛,陳鵬,等.亞砷酸鈉對酵母細胞抗氧化酶活性和脂質過氧化的影響[J].生態毒理學報，2016,11(3):302-307

Wu L H,Chen Y F,Chen P,et al.Sodium arsenite exposure affects the levels of antioxidant enzymes and lipid peroxidation inSaccharomyces cerevisiae [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):302-307(in Chinese)

砷是環境中常見的、具有毒性作用的類金屬元素，其分布范圍及濃度除了受地質條件、地球化學條件、水文地質條件等多種環境因素的影響外，由于砷還廣泛應用于工、農、醫藥等行業及含砷廢水、廢渣的不合理排放，從而導致部分地區環境中砷含量超標，嚴重威脅著生態系統和人類的身體健康[1]。氧化應激機制是目前被廣泛認可的砷毒性機制之一，砷化物進入植物或動物體后，機體內抗氧化物酶活性升高，以維持胞內氧化還原平衡，從而達到解毒作用[2-3]；當體內累積砷濃度過高，細胞內超氧陰離子(O2·-)、羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等活性氧自由基大量產生而無法被及時清除時，則會影響機體生理功能，抑制細胞生長，誘導細胞死亡[4-5]。

酵母細胞是目前公認的研究真核生物細胞學機制的模式生物，且具有生長周期短、易培養等特點。本課題組已有研究證明，亞砷酸鈉可通過誘導胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高而誘導酵母細胞死亡[6]，但砷對酵母細胞氧化損傷機理還不清楚。因此，本實驗通過分析亞砷酸鈉對酵母細胞生理生化指標的影響，研究砷化物的氧化損傷效應，進一步探討砷化物的毒性作用機制。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

釀酒酵母購于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。酵母細胞接種于YPD液體培養中，28℃，180 r·min-1振蕩培養至對數期后用于毒性實驗。

1.2 藥物處理及生長曲線測定

取對數期細胞至含有不同濃度亞砷酸鈉(0、0.1、0.2、0.4和0.6 mmol·L-1)的液體培養基中，使各處理組培養液在600 nm處的初始光密度值(OD600)相等且小于0.1，28℃，180 r·min-1振蕩培養，每隔2 h以培養基為對照測定培養液OD600，繪制生長曲線；培養24 h后檢測抗氧化物酶活性、MDA含量及ROS水平，每個處理設置3個重復。

1.3 抗氧化酶的測定

1.3.1 細胞酶液的提取［7］

將酵母細胞懸浮于預冷的細胞裂解液中，加入一定體積的酸性玻璃珠，高速震蕩10 min(每震蕩2 min冰浴1 min)后，冰浴15 min。11 500 r·min-1低溫離心10 min，取上清液即為酶提取液。

1.3.2 抗氧化酶活性和MDA含量測定

過氧化物酶(POD)活力測定用POD測定試劑盒；超氧化物歧化酶(SOD)活力測定用T-SOD測定試劑盒；過氧化氫酶(CAT)活力測定用CAT測定試劑盒；總抗氧化能力(T-AOC)測定用T-AOC測定試劑盒；丙二醛(MDA)含量參照[8]方法測定。

1.4 胞內ROS水平測定

收集酵母細胞，洗滌并懸浮于終濃度為5 μmol ·L-1的二氯熒光黃雙乙酸酯(DCFH-DA)中，30℃避光孵育30 min后，流式細胞儀檢測細胞熒光水平。

1.5 統計分析

計算每組3個重復實驗的平均值和標準誤(Mean±SD)，采用SPSS 18.0和Duncan方法對實驗結果進行F檢驗并多重比較，分析各處理組之間的差異顯著性(檢驗標準為P<0.05)。

2 結果（Results）

2.1 亞砷酸鈉對酵母細胞生長的影響

圖1 亞砷酸鈉對酵母細胞生長的影響

由圖1可知，在初始OD600相同的情況下培養24 h后，各處理組培養液OD600均明顯低于對照組，且隨著處理濃度的增加而逐漸降低。在0.6 mmol· L-1處理組中酵母細胞幾乎完全停止生長。結果說明，亞砷酸鈉可抑制酵母細胞生長和分裂，并具有一定的濃度依賴性。

2.2 亞砷酸鈉對酵母細胞抗氧化酶活性的影響

酵母細胞抗氧化酶活性如圖2所示。與對照組相比，酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫12 h后，抗氧化酶活性隨濃度增高而逐漸升高，高濃度處理組(0.4和0.6 mmol·L-1)中酶活性均顯著高于對照組，其中POD活性在0.2 mmol·L-1處理組中與對照組間已具顯著差異，說明酵母POD對亞砷酸鈉脅迫相對敏感。

酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫24 h后，CAT活性隨處理濃度升高而增強，在0.4和0.6 mmol·L-1處理組中明顯增加，均與對照組具有顯著差異；SOD活性在處理濃度范圍內與砷濃度顯著正相關(r=0.99)，說明SOD活性在一定程度上能反映環境中砷污染程度；POD活性則呈現先升高后降低的趨勢，0.2 mmol·L-1處理組中，POD活性達到最高，高濃度組中，POD活性下降，可能與亞砷酸鈉脅迫后酵母胞內的氧自由基濃度有關，低濃度時可激活機體抗氧化防御系統[9]，而濃度過高時，對酵母細胞造成嚴重傷害，抗氧化物酶系統受到破壞，POD活性下降；TAOC活性在0.1 mmol·L-1處理組中略低于對照組，但無顯著差異；在0.2～0.6 mmol·L-1處理組中其活性顯著高于對照組。結果表明，亞砷酸鈉脅迫后，酵母細胞中抗氧化物酶在逆境生理中發揮了重要作用。

2.3 亞砷酸鈉對酵母細胞ROS水平的影響

圖2 亞砷酸鈉對酵母細胞抗氧化酶活性的影響

本實驗采用流式細胞術檢測酵母細胞ROS水平，發現酵母細胞經不同濃度亞砷酸鈉脅迫后，胞內ROS水平隨處理濃度的升高和處理時間延長而逐漸增加，并具有一定的濃度效應和時間效應(圖3)。經亞砷酸鈉脅迫12 h后，各處理組胞內ROS水平與對照組之間均無顯著差異；經0.2～0.6 mmol·L-1亞砷酸鈉脅迫24 h后，酵母胞內ROS水平顯著高于對照組，這可能是因為砷濃度較低或作用時間較短時，機體內抗氧化物酶可有效降低由砷脅迫產生的氧自由基；當砷濃度升高或作用時間較長時，機體內抗氧化物防御系統與過多的氧自由基失去動態平衡，導致ROS水平顯著增高。

圖3 亞砷酸鈉對酵母細胞ROS水平的影響

圖4 亞砷酸鈉對酵母細胞MDA含量的影響

2.4 亞砷酸鈉對酵母細胞MDA含量的影響

從圖4可看出，酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫后MDA含量隨砷濃度的升高和時間延長而逐漸增加。酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫12 h或經低濃度(0.1和0.2 mmol·L-1)亞砷酸鈉脅迫24 h后，各處理組中MDA含量均與對照組無顯著差異；經高濃度(0.4和0.6 mmol·L-1)亞砷酸鈉處理24 h后，MDA含量顯著升高，與對照組相比分別增加了107.07%和386.17%。研究結果說明，低濃度砷或短時間的砷脅迫不會對酵母細胞造成嚴重的氧化損傷；隨著砷濃度升高，活性氧增多，導致細胞脂質過氧化程度加劇，MDA含量升高，引起酵母細胞氧化損傷。

3 討論（Discussion）

眾所周知，砷是一種廣泛存在于自然界中的環境誘變劑，對植物、動物和微生物均可產生毒害作用[6,10-11]。Wu等[12]研究發現，砷化物可抑制骨髓瘤細胞生長。本實驗以模式生物釀酒酵母為材料研究砷化物的毒性作用，發現亞砷酸鈉可抑制酵母細胞生長，并隨著砷濃度的提高抑制作用增強，說明亞砷酸鈉對酵母細胞具有一定的毒性作用。

大量研究表明，氧化應激機制是砷毒性作用機制之一，那么砷對酵母細胞的毒性作用是否與氧化應激有關？正常情況下，當機體受到外源物質脅迫時，即可誘導細胞抗氧化物酶表達以清除脅迫產生的過量ROS，從而使細胞內ROS等自由基的產生與清除處于動態平衡狀態；當體內ROS等氧自由基增加過多或抗氧化系統能力下降時，機體則會發生氧化應激反應，胞內ROS水平升高，從而引起細胞發生氧化損傷[13]。SOD、POD和CAT是生物體內抗氧化酶系中最重要的酶類，其活性可在一定程度上反映細胞的抗氧化能力；ROS是氧在細胞內不能被完全還原而生成的產物的總稱，包括·、·OH及H2O2等，其水平能反應細胞內氧化系統情況；MDA含量是反映細胞膜脂損傷的重要指標，可間接反映細胞發生氧化損傷的情況，常用來評價環境污染物的潛在毒性[14]。因此，我們進一步檢測了酵母抗氧化酶活性、胞內ROS水平及MDA含量。

本研究結果顯示，酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫12 h后，抗氧化酶活性隨著處理濃度的升高而逐漸增強，胞內ROS水平和MDA含量與對照組相比均無顯著差異。這說明較短時間的砷脅迫可激活抗氧化物酶活性以清除酵母體內過量的氧自由基，抑制胞內ROS水平升高，此時亞砷酸鈉并不會對酵母造成氧化脅迫，這是酵母對逆境環境的適應性反應。酵母細胞經亞砷酸鈉處理24 h后，SOD活性隨處理濃度升高而增強，說明SOD在整個實驗中將超氧陰離子催化生成H2O2的能力逐漸增強。CAT和POD可將H2O2轉變為氧氣和水，從而消除H2O2對細胞造成的毒性作用。在本研究中，酵母細胞經亞砷酸鈉脅迫24 h后，CAT活性隨處理濃度升高而增強；在高濃度處理組中，POD活性呈下降趨勢，胞內ROS水平顯著高于對照組水平。這有可能是因為低濃度砷即可快速激活抗氧化酶活性以清除酵母細胞內氧自由基，而砷濃度較高時，POD活性下降，細胞清除H2O2的能力減弱；雖然CAT和SOD活性持續增加，但胞內產生的氧自由基超過了抗氧化酶的清除能力，自身氧化還原系統平衡遭到破壞，使胞內ROS水平升高。

總之，在亞砷酸鈉脅迫下，酵母細胞內SOD、POD和CAT活性發生改變，ROS水平升高，MDA含量增加，表明砷脅迫引起酵母細胞內活性氧的產生和清除失衡，細胞發生氧化損傷，最終引起酵母細胞的生理代謝紊亂，細胞生長受到抑制。

研究結果表明，0.1～0.6 mmol·L-1的亞砷酸鈉能夠誘導酵母細胞內ROS水平升高，抗氧化酶活性增強，從而提高酵母細胞對逆境的適應能力，但胞內ROS水平超過一定閾值無法被及時清除時，就會導致膜脂過氧化水平加劇，MDA含量升高，從而對酵母細胞造成氧化損傷。

（References）：

[1] Garelick H,Jones H,Dybowska A,et al.Arsenic pollution sources[J].Reviews of Environmental Contamination and Toxicology,2008,197:17-60

[2] Malik J A,Goel S,Kaur N,et al.Selenium antagonises the toxic effects of arsenic on mungbean(Phaseolus aureusRoxb.)plants by restricting its uptake and enhancing the antioxidative and detoxification mechanisms[J].Environmental and Experimental Botany,2012,77:242-248

[3] Sharma I.Arsenic induced oxidative stress in plants[J]. Biologia,2012,67(3):447-453

[4] 薛美昭,儀慧蘭.活性氧介導砷誘導的蠶豆保衛細胞死亡[J].生態毒理學報,2013,8(2):257-261

Xue M Z,Yi H L.Involvement of ROS in arsenic-induced guard cell death in detached epidermis ofVicia fabaleaves[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2013,8(2): 257-261(in Chinese)

[5] Wu L H,Yi H L,Yi M.Assessment of arsenic toxicity usingAllium/Viciaroot tip micronucleus assays[J].Journal of Hazardous Materials,2010,176(1/3):952-956

[6] Wu L H,Yi H L,Zhang H F.Reactive oxygen species and Ca2+are involved in sodium arsenite-induced cell killing in yeast cells[J].FEMS Microbiology Letter,2013, 343:57-63

[7] 劉向勇.釀酒酵母Bdf1p轉錄因子在高鹽脅迫反應中調控機制的研究[D].濟南:山東大學,2008:84-85

Liu X Y.Regulation of the Bdf1p transcription factor in the salt stress response ofSaccharomyces cerevisiae[D]. Jinan:Shandong University,2008:84-85

[8] 潘軍航.釀酒酵母耐鋁機制中可能包含抗氧化作用[D].杭州:浙江大學,2005:17

Pan J H.The involvement of antioxidant inSaccharomyces cerevisiaealuminum tolerance[D].Hangzhou:Zhejiang University,2005:17

[9] 于慶云,王悠,徐彥,等.鎘和鉛對菲律賓蛤仔脂質過氧化及抗氧化酶活性的影響[J].生態毒理學報,2013, 8(4):504-512

Yu Q Y,Wang Y,Xu Y,et al.Effects of cadmium and lead on the lipid peroxidation and levels of antioxidant enzymes inRuditapes philippinarum[J].Asian Jounal of Ecotoxicology,2013,8(4):504-512(in Chinese)

[10] Wang Q,Xiong D,Zhao P,et al.Effect of applying an arsenic-resistant and plant growth-promoting rhizobacterium to enhance soil arsenic phytoremediation byPopulus deltoidsLH05-17[J].Journal of Applied Microbiology, 2011,111:1065-1074

[11] Ivanov V N,Gengyun W,Hei T K.Sodium arsenite exposure inhibits AKT and Stat3 activation,suppresses self-renewal and induces apoptotic death of embryonic stem cells[J].Apoptosis,2013,18(2):188-200

[12] Wu X,Shi J,Wu Y,et al.Arsenic trioxide-mediated growth inhibition of myeloma cells is associated with an extrinsic or intrinsic signaling pathway through activation of TRAIL or TRAIL receptor 2[J].Cancer Biology and Therapy,2010,10:1201-1214

[13] Li L J,Liu X M,Guo Y P,et al.Activity of the enzymes of the antioxidative system in cadmium-treated oxyachinensis(Orthoptera acridoidae)[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2005,20:412-416

[14] 龍奕,劉珊珊,王萌,等.納米Al2O3和Cd聯合暴露對銅銹環棱螺體內Cd的生物積累和抗氧化酶活性的影響[J].生態毒理學報,2015,10(2):216-223

Long Y,Liu S S,Wang M,et al.Effect of Cd and Al2O3-NPs co-exposure on bioaccumulation of Cd and antioxidase enzyme activities inBellamya aeroginosa[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(2):216-223(in Chinese)

[15] Yannic M,Robert B.Repression of gene express by oxidative stress[J].Biochemical Journal,1999,342:481-496

[16] Du L,Yu Y,Chen J,et al.Arsenic induces caspase-and mitochondria-mediated apoptosis inSaccharomyces cerevisiae[J].FEMS Yeast Research,2007,7:860-865

[17] Li B,Li X,Zhu B,et al.Sodium arsenite induced reactive oxygen species generation,nuclear factor(erythroid-2 related)factor 2 activation,heme oxygenase-1 expression, and glutathione elevation in Chang human hepatocytes[J]. Environmental Toxicology,2013,28:401-410

[18] Wolff S P,Dean R T.Fragmentation of proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis[J].Biochemical Journal,1986,234:399-403

[19] Stadtman E R.Protein oxidation and aging[J].Science, 1992,257:1220-1224

[20] Gasch A P,Spellman P T,Kao C M,et al.Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes[J].Molecular Biology of the Cell, 2000,11:4241-4257◆

Sodium Arsenite Exposure Affects the Levels of Antioxidant Enzymes and Lipid Peroxidation in Saccharomyces cerevisiae

Wu Lihua1,Chen Yanfei1,Chen Peng1,Yi Huilan2,*

1.Department of Biology,Taiyuan Normal University,Taiyuan 030031,China
2.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China

5 November 2015 accepted 29 January 2016

Arsenic is a high toxic metalloid widely distributed in the environment.However,the underlying mechanisms of arsenic toxicity are not yet well understood.Saccharomyces cerevisiaeas a model organism was selected as the materials to investigate the toxic mechanism of sodium arsenite(As).The results showed that cell culture density(OD600)of yeast cells was lower in all As-treatment groups(in the concentration range of 0.1-0.6 mmol· L-1)than in the control group.The values of OD600decreased in a concentration-dependent manner.The activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase(SOD),peroxidase(POD),catalase(CAT)and total antioxidant capacity(T-AOC)increased with increasing arsenic concentrations after yeast cells were exposed to sodium arsenite for 12 h,but no significant difference in intracellular reactive oxygen species(ROS)level or malondialdehyde(MDA)content was found between the control and As-treatment group.After 24 h of exposure,the activitiesof CAT,POD,SOD and T-AOC increased also in a concentration-dependent manner,however POD reached its peak in 0.2 mmol·L-1As-treatment group.And both intracellular ROS levels and MDA contents significantly increased in yeast cells after they were exposed to 0.4 mmol·L-1or 0.6 mmol·L-1sodium arsenite.These results suggested that sodium arsenite can induce cell growth inhibition,alter the activities of antioxidant defense system,and result in oxidative damage in yeast cells.

sodium arsenite;yeast;antioxidant enzymes;malondialdehyde;ROS

2015-11-05 錄用日期：2016-01-29

1673-5897（2016）3-302-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151105001

簡介：儀慧蘭(1963—)，女，博士，教授，博士生導師，主要研究方向為環境生物學與逆境生理學，已發表研究論文90余篇，獲國家發明專利授權2項。

國家自然科學基金青年基金(21307087)；山西省高等學校大學生創新創業項目(2015363)

吳麗華(1981—)，女，博士，副教授，研究方向為環境毒理學，E-mail:wlh1981622_510@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:yihl@sxu.edu.cn