殺蟲單對不同倍性泥鰍鰭細胞系的毒性作用

向陽，李霞,2,*，秦艷杰，單莉娟，楊艷津

1.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室,大連116023

2.大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室,大連116023

殺蟲單對不同倍性泥鰍鰭細胞系的毒性作用

向陽1，李霞1,2,*，秦艷杰1，單莉娟1，楊艷津1

1.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室,大連116023

2.大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室,大連116023

以泥鰍鰭二倍體(DIMF)和三倍體(TRMF)細胞系為受試細胞，研究殺蟲單對2種細胞系的毒性作用。采用噻唑藍(MTT)法測得DIMF與TRMF 24 h半致死濃度分別為119.73 mg·L-1、146.26 mg·L-1。DIMF的敏感性明顯高于TRMF。經殺蟲單處理的活體細胞表現為細胞伸長，空泡化和脫落并游離于培養基表面的現象。2種細胞系酶活力測定的結果顯示：殺蟲單濃度為0～100 mg·L-1時，SOD和GST活力隨著濃度的增加而增加，100～200 mg·L-1濃度組酶活力逐漸降低；0～200 mg·L-1時，AChE活力與殺蟲單濃度呈負相關，并且三倍體3種酶活力均高于二倍體。微核試驗結果顯示：50 mg·L-1殺蟲單就能對細胞核造成損傷并形成微核，微核率隨殺蟲單濃度增加而增加。當殺蟲單濃度達到200 mg·L-1時，微核率出現最大值，DIMF和TRMF分別為3.3‰和3.7‰，2種細胞的測試結果無顯著性差異(P＞0.05)。電鏡觀察結果顯示：對照組DIMF和TRMF超微結構無明顯差異；DIMF和TRMF病理變化情況相似：染色質凝集趨邊，細胞核分解成多個，細胞內出現空泡和凋亡小體，表現出凋亡的特征。研究表明殺蟲單的細胞毒性機制是通過改變細胞內酶活性從而誘導凋亡，不同倍性細胞系之間的差異主要與多倍體細胞體積大，胞內物質多，分裂快，生長旺盛等有關。

殺蟲單；泥鰍鰭細胞系；二倍體；三倍體；酶活力；微核率；超微結構；凋亡

向陽,李霞,秦艷杰,等.殺蟲單對不同倍性泥鰍鰭細胞系的毒性作用[J].生態毒理學報,2016,11(3):308-315

Xiang Y,Li X,Qin Y J,et al.In vitro cytotoxicity test of monosultap using different ploidy loach fin cell lines[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016, 11(3):308-315(in Chinese)

農藥的使用，雖然給農業的增產增收提供了保障，卻給水生生物以及人類健康帶來了嚴重威脅[1]。相關農藥毒性研究較多是利用魚類個體開展的，近年來利用魚類細胞系的進行農藥及海洋污染物的毒性研究越來越受到重視。陸續報道的有褐色大頭鯰BB細胞系[2]、虹鱒RTG-2細胞系[3]、鱸魚心臟細胞系[4]、真鯛鰭細胞系[4]、牙鲆鰓細胞系[5]、褐點石斑魚鰭細胞系[6]、大黃魚鰭細胞系[7]等用于農藥及海洋污染物的毒性分析。殺蟲單(monosultap)化學名稱1-硫代磺酸鈉基-2-二甲氨基-3-硫代磺酸基丙烷，是一種對昆蟲具有觸殺和胃毒作用的人工合成沙蠶毒類殺蟲劑[8]，主要用于水稻害蟲的防治。目前較多報道是殺蟲單在環境中殘留的檢測方法[9-10]，而利用細胞系對殺蟲單的檢測尚未見報道。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)作為一種環境污染指示生物，具有對農藥敏感的特點，成為毒理學研究較為理想的實驗材料[11-13]。泥鰍毒理學研究多集中于重金屬、農藥等的毒性效應[13]。已有報道如Hg、Cu、Pb和Zn四種重金屬對泥鰍胚胎發育與仔魚成活影響的研究[14]，甲胺磷與敵枯雙對泥鰍紅細胞微核的誘導的影響[15]等。而關于殺蟲單對泥鰍毒理學的研究鮮見報道。本文采用實驗室建立的泥鰍鰭二倍體和三倍體細胞系為實驗材料，研究了殺蟲單對其存活率、細胞形態、酶活力、微核率和超微結構損傷的影響。目的是探討殺蟲單的細胞毒性機制，從而建立殺蟲單農藥的體外毒性檢測體系。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實驗材料

實驗所用的60-70代泥鰍鰭二倍體細胞系(DIMF)和三倍體細胞系(TRMF)由大連海洋大學細胞工程實驗室2012年建立。細胞在含20%胎牛血清DMEM/F12培養基中培養(25℃、5%二氧化碳培養箱)。

實驗所用的90%殺蟲單可溶性粉劑購于西華農藥廠。DMEM/F12培養基、胎牛血清(FBS)、胰酶均為Hyclone公司產品。MTT粉、二甲基亞砜(DMSO)購置于上海生工。超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

在超凈工作臺上取對數生長期、狀態良好的60-70代DIMF細胞和TRMF細胞，用0.25%的胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105個· mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板或等密度接種5 mL到25 mL細胞培養瓶中，培養24 h后，棄掉原培養基。在預實驗中，已確定濃度達到350 mg·L-1時二倍體與三倍體細胞全部死亡，故設置殺蟲單濃度梯度0、50、100、150、200、250、300、350 mg·L-1，每個濃度設置5個重復，用于MTT檢測。培養瓶中加入5 mL濃度為0、50、100、150、200 mg·L-1殺蟲單，用于酶活性、微核的研究。以上細胞均在CO2培養箱(5%，25℃)中培養24 h。

1.2.2 殺蟲單對泥鰍鰭細胞系毒性作用的MTT檢測

按照1.2.1方法染毒24 h后，加入20 μL的5 mg·L-1MTT溶液于96孔板中，25℃孵育4 h，棄掉培養基，用預熱到37℃磷酸緩沖液(PBS)輕輕快速清洗2次，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜溶液，室溫震蕩10 min，在酶標儀492 nm波長下測各孔吸光值，計算其平均值。

細胞存活率計算公式：細胞存活率=(處理組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(陰性對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%。

1.2.3 殺蟲單對泥鰍鰭細胞系超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)活性檢測

按照1.2.1方法染毒，培養24 h后，用胰酶消化并收集細胞培養瓶中的細胞，1 500 r·min-1離心l0 min，將沉淀用PBS重懸后，在冰浴中用超聲波破碎儀破碎細胞(工作3 s，間隙3 s，處理10 min)，將破碎后的細胞懸液于2 000 r·min-1，4℃離心10 min，離心收集上清液，分別按照試劑盒說明書進行酶活力測定。

1.2.4 細胞微核率的測定

按照1.2.1染毒方法處理細胞24 h后，胰酶消化并收集培養瓶中的細胞，1 000 r·min-1離心5 min，去上清，用0.5 mL PBS重懸細胞。將細胞滴于干凈的載玻片上，采用45°推片的方法快速推片，甲醇固定10 min，用Giemsa染液(PBS:Giemsa 9:1)染色5 min，蒸餾水沖洗，晾干，鏡檢。每個片計數1 000個細胞以上，記錄微核細胞數。微核率=有微核的細胞數/觀察到的細胞總數×1000‰。

1.2.5 電鏡樣品制備及觀察

取對照組和半致死濃度組的DIMF和TRMF細胞，用胰酶處理細胞并收集在離心管中，1 500 r· min-1離心10 min，去上清，加入3%戊二醛固定，4℃固定6 h以上。棄去固定液，固定好的樣品用PBS漂洗3次，每次5 min。再用1%鋨酸于4℃固定1.5 h，然后用乙醇系列脫水，用環氧樹脂Epon812對樣品包埋后切片，超薄切片經醋酸雙氧鈾和檸檬酸各染色30 min，置于HITACHI-600透射電鏡下觀察拍照。

1.3 數據處理

用SPSS 17.0軟件分析處理數據。使用t-test進行組間顯著性差異分析，實驗結果用平均值±標準誤表示，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結果（Results）

2.1 殺蟲單對DIMF和TRMF細胞存活率的影響

圖1給出了不同濃度殺蟲單處理DIMF和TRMF細胞24 h后的存活率曲線。從圖中可以看出2種細胞變化規律基本一致。細胞存活率與濃度自然對數間呈現良好的線性關系，其回歸方程分別為：y=-56.981x+322.67(R2=0.9871)，y=-48.845x+ 293.51(R2=0.9810)，計算得出DIMF和TRMF 24 h半致死濃度分別為119.71 mg·L-1、146.26 mg·L-1。50 mg·L-1殺蟲單即可引起細胞死亡，此時兩者的存活率分別為95.89%與97.93%，隨著濃度的增加，其存活率逐漸降低，且存在明顯的濃度依賴性。當殺蟲單濃度達到300 mg·L-1時，二倍體全部死亡，當濃度達到350 mg·L-1時，三倍體全部死亡。總體來看，二倍體各濃度組死亡率比三倍體要高一些。

圖1 殺蟲單對泥鰍鰭二倍體細胞系（DIMF）和三倍體細胞系（TRMF）存活率的影響

2.2 殺蟲單處理DIMF與TRMF細胞的光鏡觀察結果

在倒置顯微鏡下觀察染毒后細胞的變化，正常細胞排列緊密，呈纖維樣，貼壁生長(圖2A，D)。染毒24 h后細胞出現明顯的形態學變化，二倍體和三倍體細胞變化一致。100 mg·L-1殺蟲單濃度組部分細胞胞體伸長呈線狀，200 mg·L-1殺蟲單濃度組中多數細胞胞體伸長，細胞輪廓模糊，有些細胞內出現空泡或脫離培養瓶壁，懸浮在培養液中(見圖2B，E)，當殺蟲單濃度達250 mg·L-1時多數細胞變圓脫落、貼壁的很少(見圖2C，F)。

圖2 不同濃度殺蟲單處理后泥鰍鰭DIMF與TRMF的形態變化

2.3 殺蟲單對泥鰍鰭細胞系酶活性的影響

2.3.1 殺蟲單對細胞系SOD的影響

圖3為不同濃度殺蟲單處理DIMF和TRMF細胞24 h后的SOD活力圖，50 mg·L-1殺蟲單濃度組引起了SOD酶活力增加，100 mg·L-1殺蟲單濃度組SOD活性最高，和對照組比較差異顯著(P＜0.05)，以后隨濃度升高酶活性降低，各濃度組三倍體細胞系酶活力均高于二倍體細胞系(P＜0.05)。

圖3 不同濃度殺蟲單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF的SOD酶活力

圖4 不同濃度殺蟲單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF的AChE酶活力

2.3.2 殺蟲單對細胞系AChE的影響

在0～200 mg·L-1時，在二倍體與三倍體AChE酶活力與對照組比均顯著性降低(P＜0.05)，并具有濃度依賴性。但三倍體酶活力均高于二倍體細胞(P＜0.05)。

2.3.3 殺蟲單對細胞系GST的影響

殺蟲單處理24 h后，50 mg·L-1濃度組并未引起二倍體GST活性的顯著變化。當濃度達100 mg· L-1時酶活力顯著升高，達到最大值，與對照組比較差異顯著，(P＜0.01)，隨著殺蟲單濃度增加酶活性又逐漸降低，各濃度組三倍體細胞系酶活性均高于二倍體細胞系(P＜0.05)。

圖5 不同濃度殺蟲單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF的GST酶活力

2.3.4 殺蟲單對細胞系微核率的影響

殺蟲單處理后的DIMF與TRMF均出現微核，兩者的變化規律較一致，微核出現在細胞質中，呈圓形且邊緣光滑，與細胞核染色一致，如圖6A、B所示。由表一可知，經殺蟲單處理后DIMF和TRMF微核率與對照組比較有顯著提高，當濃度達到200 mg·L-1時，兩者的微核率最大，分別為3.3‰和3.7‰，分別為對照組的10倍和11.2倍。隨著濃度增加，在同一濃度下，二倍體與三倍體之間微核率差異不顯著(P＞0.05)。

圖6 殺蟲單處理后泥鰍鰭DIMF（A）與TRMF（B）細胞核的形態

表1 不同濃度殺蟲單對泥鰍鰭DIMF和TRMF微核率的影響Table 1 The effect of different concentrations of monosultap on the micronucleus rates of loach fin DIMF and TRMF

2.4 殺蟲單對細胞超微結構的影響

對照組中DIMF細胞形態規則，有明顯可見的核，核膜完整，細胞核邊界明顯，粗面內質網結構完整，有大量線粒體。TRMF細胞形態結構與DIMF相似，只是核體積較DIMF大，細胞中空泡較多。(見圖7A，B)。經半致死濃度殺蟲單處理的細胞，DIMF和TRMF病理變化一致，細胞超微結構發生明顯改變：細胞核分解成多個，線粒體、核糖體與內質網等細胞器消失(見圖7C)，細胞內出現大量空泡(見圖7D)，出現凋亡小體(見圖7E，F)，表現出凋亡的特征。

圖7 殺蟲單處理后泥鰍鰭DIMF和TRMF超微結構變化

3 討論（Discussion）

殺蟲單可引起細胞形態發生較大變化。正常的泥鰍鰭細胞為成纖維樣，貼壁生長。低濃度殺蟲單處理的泥鰍鰭細胞表現出細胞伸長，透明度降低等早期變化，隨著殺蟲單濃度的增加，細胞表現為空泡化，顆粒樣物質增多，細胞間空隙加大，最后脫離培養瓶底等晚期變化。作者認為泥鰍鰭細胞系早、晚期形態的改變等特征可作為環境中殺蟲單的檢測指標。超微結構變化顯示經殺蟲單處理的DIMF和TRMF細胞，細胞核分解成多個，同時細胞內出現大量空泡，并伴隨著凋亡小體產生，上述變化符合細胞凋亡的特征[16-17]。殷立成和郭華榮[5]在探討丁草胺對牙鲆鰓細胞系急性毒性作用中發現細胞形態的改變與細胞內抗氧化系統活性有直接的關系。Peikert等[18]在研究呼吸道上皮細胞的凋亡和脫落與誘發哮喘之間的關系時發現，SOD的活性與呼吸道上皮細胞脫落或凋亡的發生呈線性關系，也即是說SOD活性增加時能夠保護細胞不致脫落或凋亡。本實驗中100～200 mg·L-1濃度組，隨殺蟲單濃度的增加，SOD酶活力逐漸降低，證明細胞結構的變化與SOD活性有關。GST作為生物體重要的解毒酶，可催化脂溶性物質的甲基與谷胱甘肽(GSH)結合，來降低農藥對細胞的損傷。過高的殺蟲單濃度會造成細胞自身抗氧化能力不足，導致氧化酶系統損傷，同時抑制AChE酶活性，使細胞不能及時地對外界刺激做出反應，還能將底物GSH耗盡，細胞內GST無法誘導，使細胞表現出一系列的急性中毒癥狀[19-22]。所以殺蟲單的細胞毒性機制是破壞細胞的代謝平衡和內部結構，導致細胞生長與增殖停滯，使細胞內酶活性改變從而誘導細胞凋亡，最終導致細胞死亡。

微核是藥物作用于分裂期細胞的紡錘體，使染色體斷裂、丟失、結構破壞[23]而產生的。樓允東和吳萍[15]在研究甲胺磷和敵枯雙2種農藥對泥鰍紅細胞微核影響時發現在一定濃度范圍內，微核細胞率與農藥濃度呈正相關。本實驗中50 mg·L-1殺蟲單就能對細胞核產生損傷，形成微核，而且微核率隨殺蟲單濃度增加而增加，在200 mg·L-1時，微核率出現最大值。農藥能誘導細胞DNA損傷，但氧化損傷對微核的形成影響較小[24]。DNA損傷導致細胞有絲分裂時染色體發生斷裂，在細胞間期喪失著絲粒的染色體片段滯留在主核外形成微小染色質塊。當農藥作用后，誘導細胞DNA損傷，但DNA通過合成與修復作用，損傷部位能得到快速修復，另一方面，氧化劑主要是導致DNA單鏈斷裂，損傷的正確修復率大大提高，并且DNA單鏈斷裂對微核的形成影響很小。微核率檢測對揭示農藥對水生生物體的潛在危害及作用本質具有重要意義，可以將微核率作為檢測殺蟲單對細胞損傷的指標。

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In Vitro Cytotoxicity Test of Monosultap Using Different Ploidy Loach Fin Cell Lines

Xiang Yang1,Li Xia1,2,*,Qin Yanjie1,Shan Lijuan1,Yang Yanjin1

1.Key Laboratory of Marine Bio-resource Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China
2.Key Laboratory of Mariculture of Agriculture Ministry,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China

13 May 2015 accepted 22 October 2015

In this study,loach findiploid cell line(DIMF)and triploid cell line(TRMF)were used to assess toxicity of monosultap in vitro.The 24 h semi-lethal concentrations of DIMF and TRMF measured by thiazole blue(MTT) method were 119.73 mg·L-1and 146.26 mg·L-1,respectively.DIMF was more sensitive to monosultap than TRMF. After exposure to monosultap,the cellular morphology showed the phenomenon with elongation,vacuolization andexfoliation.When the monosultap concentration was 0-100 mg·L-1,the activities of superoxide dismuta(SOD)and glutathione S-transferase(GST)in two cell lines were increased with the increase of concentration,however,while the concentration was 100-200 mg·L-1,the activities of both enzymes gradually decreased.When the concentration was 0-200 mg·L-1,the activity of acethlcholine esterase(AChE)in two cell lines was negatively correlated with the concentration of monosultap.The activties of three enzymes in TRMF were higher than those in DIMF.Micronucleus test showed that 50 mg·L-1monosultap could cause the nucleus damage and form micronucleus.The rate of micronucleus increased with the increase of monosultap concentration.When monosultap concentration was 200 mg ·L-1,the maximum micronucleus rates of DIMF and TRMF were 3.3‰and 3.7‰,respectively,and no significant differences were observed between two cell lines(P＞0.05).The electron microscopic observations showed that DIMF and TRMF presented similar pathological changes,showing chromatin condensation,margination and cell nucleus decomposition.The numbers of mitochondria,ribosomes and endoplasmic reticulum reduced.Vacuoles and apoptotic bodies appeared in cells,which showed the characteristic of apoptosis.The present results showed that the cytotoxic mechanism of monosultap was inducing apoptosis by changing the intracellular enzyme activity.Differences between two ploidy cell lines were mainly related to the large cell volume,much intracellular substance,rapid cell division and vigorous growth of triploid.

monosultap;loach;fin;cell lines;diploid;triploid;enzyme activity;micronucleus rate;ultrastructure; apoptosis

2015-05-13 錄用日期：2015-10-22

1673-5897（2016）3-308-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150513002

簡介：李霞(1961—)，女，海洋生物學碩士，教授，主要研究方向為水產動物繁育學，水產動物發育學，細胞工程等，出版專著和教材4部，發表學術論文百余篇。

國家自然科學基金(31272650)

向陽(1991-)，男，碩士研究生，研究方向為生態毒理學，E-mail:aliaswork@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:lx@dlou.edu.cn