慢性阻塞性肺疾病激素不敏感與糖皮質(zhì)激素受體核內(nèi)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

孫筱茹　董　年　袁弘蕾　蘇孝瓊　王向東　陳智鴻△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科　上?！?00032; 2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院感染科　杭州　310009;3 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗研究中心　 上?！?00032)

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慢性阻塞性肺疾病激素不敏感與糖皮質(zhì)激素受體核內(nèi)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

孫筱茹1,2董年1袁弘蕾1蘇孝瓊1王向東3△陳智鴻1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科上海200032;2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院感染科杭州310009;3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實驗研究中心 上海200032)

目的研究慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)對糖皮質(zhì)激素不敏感是否與糖皮質(zhì)激素受體 (glucocorticoids receptor,GRα)的核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。方法將來自12例健康人、15例輕中度哮喘患者和15例COPD患者的人外周血單個核細(xì)胞 (peripheral blood molecule cells,PBMC)進(jìn)行體外培養(yǎng)。ELISA方法檢測其IL-8蛋白質(zhì)水平,并計算地塞米松 (Dex)半抑制濃度。PBMC在Dex中培養(yǎng)0.5～6 h,通過Western blot檢測GRα蛋白質(zhì)水平,GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移則通過免疫熒光和共聚焦顯微鏡來觀測和分析評估。結(jié)果COPD患者PBMC較輕中度哮喘患者和健康志愿者對Dex相對不敏感。Dex半抑制率 (IC50Dex)與糖皮質(zhì)激素受體GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān) (r=-0.54,P=0.000 8)。Dex可誘導(dǎo)增加各組PBMC中的總GRα,但GRα胞內(nèi)分布各組間存在差異。Dex可明顯增加健康人及哮喘患者核內(nèi)的GRα,但并未增加COPD患者核內(nèi)GRα。健康人及哮喘患者的PBMC中,Dex預(yù)處理能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8分泌,而在COPD患者的PBMC中這種抑制作用不明顯。結(jié)論COPD對糖皮質(zhì)激素的不敏感與GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移受抑制可能是造成糖皮質(zhì)激素在COPD患者中發(fā)揮抑制炎性作用欠佳的原因之一。

慢性阻塞性肺疾病;糖皮質(zhì)激素;糖皮質(zhì)激素受體;不敏感;核內(nèi)轉(zhuǎn)移

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種慢性非特異性炎性疾病。我國COPD的患病人數(shù)已超過4000萬[1]。預(yù)計到2020年COPD病死率將上升到第3位,同時將成為世界第五大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。 在我國,輕中度(GOLDⅡ級)COPD患者的急性加重發(fā)生率為年均1.29次/人[3],輕中度患者的死亡率因為急性加重增加了2.78倍[4]。因此,在呼吸困難等癥狀出現(xiàn)前就應(yīng)及時予以治療,以預(yù)防疾病的不可逆性進(jìn)展。

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)已成為治療哮喘的一線藥物。但其對于輕中度COPD患者卻缺乏療效證據(jù)。體外實驗也證實激素不能抑制COPD患者肺泡灌洗液中肺泡巨噬細(xì)胞釋放促炎介質(zhì)。目前COPD對激素治療不敏感的機(jī)制尚不清楚。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)表達(dá)減少,GC與GR結(jié)合減少,炎性通路的活性增強(qiáng)或輔阻遏物活性缺乏等因素都可導(dǎo)致對激素的不敏感,且這些因素受氧化應(yīng)激等影響[5]。氧化應(yīng)激反應(yīng)減少GC-GR復(fù)合物核轉(zhuǎn)移,阻斷GC的抗炎性反應(yīng)的同時,還降低了肺組織HDAC酶的活性,通過打破組蛋白乙?；?脫乙?；胶?增加了促炎性基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。氧化應(yīng)激使輕中度COPD患者的炎性因子表達(dá)增加[6]。同時激活不同激酶途徑,包括磷酸肌醇3激酶 (PI3K)/Akt途徑。有研究表明COPD患者外周肺巨噬細(xì)胞中PI3Kδ和Akt的活性都升高,選擇性地抑制PI3Kδ/Akt通路,可修復(fù)COPD患者激素抑制炎性介質(zhì)表達(dá)的能力[7]。阻斷COPD患者的巨噬細(xì)胞中的促炎因子MIF,GC不敏感好轉(zhuǎn),提示MIF在COPD中與GC不敏感有關(guān)[8]。

GC主要通過GR來實現(xiàn)作用。GRα作為GR的主要形式,一般以非活性復(fù)合體存在于細(xì)胞胞質(zhì)中,當(dāng)其與GC結(jié)合后,誘導(dǎo)熱休克蛋白90 (HSP90)等分子伴侶的解離,促使GRα迅速轉(zhuǎn)移至核中。繼而與特異性DNA應(yīng)答元件GC反應(yīng)元件 (glucocorticoid response elements,GRE)結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[9-10],或者與其他轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP1發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用,通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)發(fā)揮GC的生物學(xué)效應(yīng)。

在GC發(fā)揮抑制炎性的作用過程中,GR核內(nèi)轉(zhuǎn)移是一個關(guān)鍵步驟。本課題擬通過研究輕中度COPD及輕中度哮喘患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood molecule cells,PBMCs)核內(nèi)轉(zhuǎn)移的GRα的表達(dá)變化,探討GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移及COPD患者對GC治療不敏感的相關(guān)性。

資 料 和 方 法

試驗對象正常對照組均來自志愿者,年齡為40～70歲,均無吸煙史,無呼吸系統(tǒng)疾病或過敏性疾病及遺傳性激素反應(yīng)缺陷的疾病。COPD組受試者來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科門診,其診斷標(biāo)準(zhǔn)和嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)參照2015 GOLD 指南 (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease),年齡為40～70歲。哮喘組受試者來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科門診,診斷及嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)符合2015 GINA 標(biāo)準(zhǔn) (Global Initiative for Asthma),年齡為40～70歲。

所有受試對象最近一個月未服用抗驚厥藥、紅霉素和利福平等影響激素療效的藥物。受試者情況見表1。本研究內(nèi)容經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn) (B2014-108),受試者均被告知研究目的及試驗程序,并簽署知情同意書。

表1　COPD患者信息

Values are expressed median (interquartile range) in age,FEV1 (%pred) and FEV/FVC.FEV1:Forced expiratory volume in one second.FVC:Forced vital capacity.FeNO:Fractional exhaled nitric oxide (1 ppb=1×10-9mol/L).NA:Not available.

主要試劑和器材TNF-α,地塞米松 (dexamethasone,Dex) (美國Sigma 公司),IL-8 ELISA 試劑盒 (美國R&D 公司),抗GRα抗體 (美國Abcam公司),山羊抗兔二抗 (美國Santa Cruz公司),淋巴細(xì)胞分離液 (美國Sigma 公司),HBSS (美國Sigma 公司)。Leica TCS SP8 激光掃描共聚焦顯微 (德國Leica 公司)。

標(biāo)本采集 取受試者外周肘靜脈血10 mL (10% EDTA抗凝),用PBS緩沖液按1∶1稀釋并在50 mL無菌離心管中充分混勻。另一50 mL離心管加入淋巴細(xì)胞分離液12 mL,然后加入上述稀釋血,20 ℃恒溫水平300×g離心30 min后,吸取白色云霧層,置入另一無菌離心管中。向收集的細(xì)胞中加入10 mL的PBS緩沖液吹打混勻后,以1 800 r/min (r=10 cm,下同),20 ℃恒溫水平離心10 min,以除去殘余的分離液和雜質(zhì)。棄取上清后,再用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次,每次均以1 500 r/min,20 ℃恒溫水平離心10 min。棄去上清,用PBS緩沖液重懸細(xì)胞。計算細(xì)胞活力及細(xì)胞計數(shù)。

對PBMCs的不同刺激處理 對各組PBMCs按濃度梯度分別加入含10-4～102μmol/L Dex及10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 h后,予各孔加入TNF-α 0.01 ng/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取上清,按照說明書采用ELISA檢測PBMCs IL-8的表達(dá)。各組設(shè)3個副孔。各組PBMCs加入含1 μmol/L Dex及10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,按時間梯度分別培養(yǎng)1、2、4、6 h后提取細(xì)胞用于Western blot檢測GRα表達(dá)。余下予各孔TNF-α 0.01 ng/mL,空白孔加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,取上清,按照說明書采用ELISA檢測PBMCs IL-8的表達(dá)。各組加入含1 μmol/L Dex及10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,按時間梯度分別培養(yǎng) 0.5、1、2 h后,提取細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光檢測。

免疫熒光提取的細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定10 min,待細(xì)胞固定后涂片。0.5%Trition 20 min孵育。PBS清洗標(biāo)本3次,每次15 min。入血清 (與二抗來源一致)孵育20 min后,移入一抗:[兔抗-GRα (1:200)] 4 ℃過夜。次日,37 ℃復(fù)溫,PBS清洗標(biāo)本3次各15 min,入二抗孵育2 h。經(jīng)PBS漂洗標(biāo)本3次各15 min后,加入DAPI染液染30 min。PBS清洗標(biāo)本3次各15 min。避光條件下50%甘油封片,共聚焦顯微鏡下觀察,拍照。

Western blot檢測 以細(xì)胞裂解液提取總蛋白,首先測定蛋白質(zhì)濃度以保證蛋白質(zhì)量相同。SDS-PAGE電泳后,65 V恒壓電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1h,滴加一抗 (1∶125)室溫孵育1 h,4 ℃過夜,TBS緩沖液漂洗后加HRP二抗,室溫孵育2 h后發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。表達(dá)相對定量采用Quantity One軟件。

結(jié)　　　果

各組PBMCs中Dex對TNF-α誘導(dǎo)的IL-8動態(tài)抑制情況的比較為了從時序上了解Dex對PBMCs發(fā)揮抑炎作用的情況,對不同時間點Dex預(yù)處理的PBMCs給予TNF-α刺激,檢測其對IL-8釋放的抑制作用 (圖1)。發(fā)現(xiàn)正常對照組對IL-8的抑制作用始終比較明顯,在1、2、4、6h時IL-8分泌水平均較空白對照明顯減少 (P<0.01)。在4h內(nèi)哮喘患者均有抑制作用 (P<0.05),而COPD組的抑制炎性作用只維持了2h, (1hP <0.5,2hP<0.01)。組間比較也提示Dex對COPD患者的PBMCs的抑炎影響明顯不及其對于健康人及哮喘患者的作用。

IL-8 concentration of PBMC from healthy volunteers,asthmatics and COPD patients cells were pre-incubated with Dex (1 μmol/L) for 1,2,4 and 6 hours prior TNF-α stimulation.Data was plotted as median±SEM.A:Healthy volunteer B:asthmatics C:COPD D:Comparison among three groups.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖1TNF-α刺激Dex預(yù)處理的PBMCs時IL-8的變化

Fig 1Effects of TNF-α on IL-8 in the PBMCs pre-incubated with Dex

各組PBMCs中Dex對經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的IL-8分泌的影響 為進(jìn)一步確定各組PBMCs對激素的敏感性,將PBMCs過夜培養(yǎng),各組基礎(chǔ)IL-8水平無明顯組間差異。PBMCs經(jīng)TNF-α刺激致IL-8水平增加約8倍,但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。然而,在COPD組的PBMCs中,Dex對TNF-α誘導(dǎo)的IL-8抑制曲線較正常對照組及哮喘組右移,即需更高的Dex半抑制濃度 (IC50dex)[中位數(shù) (范圍)為17.6 (8.6-39.7)nmol/L,n=15],與哮喘組[10.2 (7.2-32.3)nmol/L,n=15]和正常對照組[6.3 (3.4-17.3)nmol/L,n=12]相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05,圖2)。提示相較于輕中度哮喘患者和健康志愿者,COPD患者PBMCs對Dex相對不敏感。

各組PBMCs中Dex對總GRα動態(tài)變化的影響 為了解細(xì)胞內(nèi)總GRα水平,我們從健康人、哮喘、COPD患者外周血中提取PBMC,給予Dex處理,分別于其后2、4、6h提取細(xì)胞,應(yīng)用Western blot檢測總GRα水平 (圖3)。各組總GRα在Dex處理2 h后均有增加,且增幅明顯大于核內(nèi)GRα,提示Dex能明顯增加胞質(zhì)內(nèi)GRα水平 (哮喘組、COPD組較空白對照明組明顯增加P<0.05)。隨后,總GRα水平變化出現(xiàn)明顯差異。哮喘組及COPD組的總GRα水平隨時間增加而減少,健康組PBMCs中的總GRα水平隨時長的增加而增多 (6 h時P<0.05)。數(shù)據(jù)表明總GRα水平健康人與哮喘及COPD患者有明顯差異,但是哮喘及COPD患者間無差異。

A:Dex (10-4-102μmol/L) was incubated 4 hours followed by 24 hours stimulation with TNF-α.ELISA was used to measure IL-8 levels in 12 healthy volunteers (HV),15 asthmatics,and 15 COPD patients.IC50Dex (50% inhibitory concentration) was measured and plotted in graph B.B:IC50Dex measured from A.was plotted for 12 healthy volunteers (HV),15 asthmatics,and 15 COPD patients.

圖2地塞米松抑制PBMCs釋放IL-8敏感性變化

Fig 2The variety of Dex sensitivity in inhibition of IL-8 releasing from PBMCs

Example of nuclear translocation as assessed by immunofluorescence of PBMCs treated with Dex (1 μmol/L) for 0.5 hour,1 hour and 2 hours.PBMCs were cytospined into slides and air dried.GRα was detected using an anti-GRα antibody with a secondary cy3-conjugated antibody (red).The nucleus was counter-stained using a cy5 To-Pro-3 (blue).A fixed area was drawn and used to measure the intensities of the red and blue channels in the nucleus.Ten cells per experiment were counted and the cy3 intensity used as the representation of nuclear GRα which was normalized for Dex treatment.Three patients′ pictures from confocal microscopy are shown.A:Healthy volunteers (Normal);B:Asthmatics;C:COPD patients.(1)vs.0 hour group,P<0.01.

圖3Dex預(yù)處理PBMCs時GRα的變化

Fig 3Effects of Dex on GRα in the PBMCs

各組PBMCs中Dex對核內(nèi)GRα動態(tài)變化的影響 由上述實驗可知,在PBMCs中,經(jīng)Dex處理后,哮喘和COPD患者總GRα蛋白質(zhì)水平隨時間改變的趨勢相似。GR轉(zhuǎn)移入核內(nèi)是GC發(fā)揮抗炎抑炎作用的關(guān)鍵。為了解GRα在PBMCs中的具體分布,我們用免疫熒光法測定了核內(nèi)GRα的熒光強(qiáng)度。分別檢測各組受試者PBMCs在Dex處理0.5、1、2 h后核內(nèi)GRα免疫熒光強(qiáng)度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組PBMCs在未受Dex處理時,核內(nèi)和胞質(zhì)均有GRα分布,且以胞質(zhì)為主。Dex處理0.5 h時,3組核內(nèi)GRα均有一過性減少,可能與核內(nèi)原有的GRα消耗有關(guān)。但此后,各組間核內(nèi)GRα水平變化明顯不同。健康人 (圖4A)PBMC核內(nèi)GRα的熒光強(qiáng)度隨Dex處理時間增長而加強(qiáng),在2 h處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。哮喘患者的PBMCs (圖4B) Dex處理1h時核內(nèi)GRα的熒光強(qiáng)度最強(qiáng) (P<0.05),但隨后其強(qiáng)度減弱。而COPD患者 (圖4C)GRα的核內(nèi)熒光強(qiáng)度,在Dex處理1 h時稍有增強(qiáng),隨后在2 h時明顯減弱 (P<0.01)。數(shù)據(jù)提示,在健康受試者的PBMCs中,核內(nèi)GRα的增加與Dex對GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響有關(guān),且這種影響持續(xù)增強(qiáng)。而在COPD患者PBMCs中,Dex對GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響很微弱,且隨時間的增長而減弱。結(jié)合Western blot結(jié)果,發(fā)現(xiàn)盡管在2 h時所有受試者的總GRα水平都增加了,但是在3組中核內(nèi)GRα水平有明顯差異,提示激素敏感性可能與GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

PBMCs were incubated with Dex (1 μmol/L) for 1,2,4 and 6 hours.GRα was detected using immun of luorescent stainning.A:Healthy volunteers.B:Asthmatics;C:COPD patients;(1)vs.0 hour group,P<0.05.

圖4Dex預(yù)處理PBMCs時GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況

Fig 4Effects of Dex on the translocation of GRα in the PBMCs

GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移與GC敏感性的相關(guān)性在各組PBMCs中,COPD組對激素相對不敏感,哮喘組相對敏感。而在GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移中,COPD組核內(nèi)轉(zhuǎn)移受抑制。為了解在PBMCs中Dex的敏感性與Dex影響下核內(nèi)GRα水平的關(guān)系,我們通過共聚焦顯微鏡定位檢測核內(nèi)GRα熒光強(qiáng)度。IC50Dex來自前文結(jié)果。結(jié)果顯示,Dex的半抑制率與GRα核內(nèi)熒光強(qiáng)度呈明顯負(fù)相關(guān) (P=0.000 8,r=-0.54,圖5),提示核內(nèi)GRα水平的降低與Dex對細(xì)胞因子的抑制作用減弱相關(guān),COPD的激素不敏感可能與GRα轉(zhuǎn)移核內(nèi)減弱有關(guān)。

討　　　論

臨床研究表明COPD患者對GC不敏感[14],而在體外的肺部細(xì)胞研究中也得到了同樣的結(jié)果,如來自COPD患者的巨噬細(xì)胞已被研究者證實皮質(zhì)醇激素不敏感[15]。近來發(fā)現(xiàn)Dex的抑制炎性作用在COPD患者的外周血中性粒細(xì)胞中要優(yōu)于來源于COPD患者的痰液中的細(xì)胞[16],提示對于COPD患者來說,全身用藥可能優(yōu)于局部用藥。全身性皮質(zhì)類固醇激素在 COPD 治療中的作用卻仍存有爭議。目前仍沒有強(qiáng)力的證據(jù)來指導(dǎo)如何選擇合適的患者、合理的用藥方式及其恰當(dāng)?shù)寞煶?。有證據(jù)顯示,當(dāng)用于COPD急性加重期的治療時,全身性GC可加快患者的康復(fù),并減少其治療失敗[17],但仍沒有證據(jù)證明其在輕中度COPD患者中的確切作用。本研究通過ELISA測試Dex抑制由TNF-α刺激的IL-8的半抑制濃度,證實COPD患者的PBMCs較健康人群及哮喘患者GC敏感性下降。本研究及相關(guān)文獻(xiàn)提示,COPD患者中,GC抵抗不僅出現(xiàn)在肺部細(xì)胞,同時也出現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞中,提示這種激素不敏感并非局部,而是累及全身的[18-19]。

Correlation between IC50Dex and the GRα nuclear translocation immunofluorescence intensity (IF) in all persons (n=35).

圖5IC50 Dex與GRα核內(nèi)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

Fig 5Correlation between IC50Dex and the GRα nuclear translocation

IL-8是中性粒細(xì)胞的重要趨化因子,其細(xì)胞來源廣泛,其中又以人PBMCs及內(nèi)皮細(xì)胞最多[20]。有研究表明IL-8特異性結(jié)合中性粒細(xì)胞表面受體,致細(xì)胞變形反應(yīng),脫顆粒反應(yīng),釋放溶酶體和形成超氧化物,從而促成炎性反應(yīng)[21]。IL-8需在LPS (脂多糖)、TNF-α等誘導(dǎo)劑作用下合成釋放。GC對IL-8基因轉(zhuǎn)錄的抑制是通過激素-受體復(fù)合物與IL-8基因5′末端的GC反應(yīng)元件相互作用實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)相較于健康人、哮喘患者,Dex對COPD患者的IL-8抑制效果明顯減弱 (圖1),意味著問題可能出在激素-受體復(fù)合物上。

有研究表明,在人外周血白細(xì)胞中,Dex對GRα和β mRNA 水平均具有明顯的下調(diào)作用[22],認(rèn)為這種由配體誘發(fā)的受體水平下調(diào)是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制,可以降低靶細(xì)胞對激素的反應(yīng)性,防止因激素的持續(xù)作用對細(xì)胞造成的損傷[23]。然而,我們通過Western blot檢測總GRα蛋白質(zhì)水平的結(jié)果卻是3組受試者中總GRα水平至少在2 h內(nèi)是增加的 (哮喘組和COPD組4、6 h減少)。有研究表明,地塞米松作用4～24 h,GRα的mRNA水平呈時間依賴性下降。而本研究發(fā)現(xiàn),Dex處理2 h時GRα蛋白質(zhì)水平增加。盡管結(jié)果上看似矛盾,但是從作用時長上來看,也許存在一個短期效果和長期效果的差別。當(dāng)然,這其中的具體機(jī)制需要深入研究加以闡明。

GC需與其受體在胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合,發(fā)生構(gòu)象改變,形成GC-GR復(fù)合物,轉(zhuǎn)移入核,作為轉(zhuǎn)錄因子激活或者抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)。不難看出,GR轉(zhuǎn)移入核內(nèi)是GC發(fā)揮抗炎抑炎作用的關(guān)鍵[11-13]。這一點在免疫熒光實驗中得到證實,Dex處理2 h時,COPD患者的PBMCs中的核內(nèi)GRα明顯較哮喘患者或健康受試者少。在免疫熒光動態(tài)觀察Dex對核內(nèi)GRα水平的影響過程中,我們發(fā)現(xiàn),未受Dex處理時,GRα在胞質(zhì)胞核都有分布,Dex作用30 min,3組受試者的PBMCs中的核內(nèi)GRα均減少,可能與核內(nèi)原有GRα的消耗有關(guān)。在1 h時3組核內(nèi)GRα均有增加,提示GRα的入核開始起作用。有研究發(fā)現(xiàn)在輕中度哮喘患者及健康人痰液中的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[24],哮喘患者及鼻息肉患者的成纖維細(xì)胞[25],激素受體入核發(fā)生在Dex處理30 min時,被稱為快速入核。故此,提示地塞米松促進(jìn)GRα入核。至于試驗顯示核內(nèi)GRα在地塞米松處理1h開始有增多的結(jié)果與30 min快速入核的已有結(jié)論有出入,推測與核內(nèi)GRα消耗速度快于入核速度有關(guān),而這種消耗有實驗表明與蛋白酶體途徑有關(guān)[26]。因此,GRα的入核是一個動態(tài)的過程,與GRα的核內(nèi)消耗存在一定程度上的平衡。所以在3組中1 h時GRα的入核多于其核內(nèi)消耗的GRα,表現(xiàn)為核內(nèi)GRα的熒光強(qiáng)度較前增加;其后的2 h,健康受試者核內(nèi)GRα的熒光強(qiáng)度繼續(xù)增加,而哮喘患者的相對減少,COPD患者的明顯減少。在預(yù)實驗中我們同時也檢測了Dex處理4 h及6 h的各組熒光強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)2 h后這種趨勢趨于穩(wěn)定,所以本研究選擇了2 h內(nèi)的處理時間。這種趨勢提示,Dex在激素敏感的健康人及相對敏感的哮喘患者中的作用時長較激素不敏感的COPD要長。而Western blot試驗顯示3個試驗組的總GRα在地塞米松處理2 h內(nèi)均升高,提示總GRα并不是影響核轉(zhuǎn)移的主要因素,COPD患者GRα在地塞米松處理2 h時減少可能與核內(nèi)轉(zhuǎn)移受抑制和/或核內(nèi)GRα降解增加有關(guān)。而核內(nèi)轉(zhuǎn)移受抑制和/或核內(nèi)GRα降解增加可能是COPD患者GC耐受的一個原因[27]。

本研究證實了在COPD患者的PBMCs中存在激素耐受。GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)移與GC的敏感性呈正相關(guān)。發(fā)現(xiàn)在COPD患者的PBMCs中,核內(nèi)GRα水平是一個動態(tài)的過程,Dex對其作用的減弱可能與GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)運受抑制和/或核內(nèi)GRα降解增加有關(guān)。本研究為闡明COPD患者GRα的核內(nèi)轉(zhuǎn)運受抑制機(jī)制及COPD激素耐受研究提供了新的思路。

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sE-mail:czh60@hotmail.com;wang.xiangdong@zs-hospital.sh.cn

Correlation between glucocorticoid insensitivity of chronic obstructive pulmonary disease and glucocorticoid receptor nuclear translocation

SUN Xiao-ru1,2, DONG Nian1, YUAN Hong-lei1, SU Xiao-qiong1, WANG Xiang-dong3△, CHEN Zhi-hong1△

(1DepartmentofRespiration,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofInfectiousDiseases,theSecondAffiliatedHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009,ZhejiangProvince,China;3BiomedicalResearchCenter,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

ObjectiveTo confirm whether the poor response to glucocorticoids (GCs) in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is due to impairmnt of the GC receptor (GRα) nucleus translocation.MethodsPeripheral blood molecule cells (PBMCs) from samples of 10 healthy controls and 15 patients with COPD and 15 asthmatics were culturedinvitro.Corticosteroid sensitivity was detected by measuring dexamethasone inhibition of TNF-α induced IL-8 production in PBMCs by using ELISA.PBMCs were incubated with budesonide or 1 μmol/L dexamethasone (Dex) for different times (30 min to 6 h) and GRα translocation was analyzed by immunofluorescence and

chronic obstructive pulmonary disease;glucocorticoid;glucocorticoid receptor;insensitivity;nucleus translocation

R56

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.007

2016-01-31;編輯:張秀峰)

國家自然科學(xué)基金(81270078,81470211)

confocalmicroscopy.ResultsPBMCs from COPD patients were relatively less sensitive to Dex as compared with those of non-severe asthmatics and healthy volunteers.The IC50values of Dex negatively correlated with decreased GR nuclear translocation assessed using immunocytochemistry (r=-0.54;P=0.0008).Dex increased the protein level of GRα in every group,whereas the distribution of GRα in the cell was different among the groups.We found that Dex significantly induced GRα translocation in controls and asthmatics compared with baseline.There was a decrease of GRα translocation compared with baseline in the PBMCs derived from the patients with COPD (2 h,P<0.05).Pretreatment with Dex effectively inhibited TNF-α-induced IL-8 production in control and asthma groups,but the effect was not that significant in the COPD group.ConclusionsOur data indicate that the insensitivity to GC treatment in COPD patients may due to GRα nucleus translocation impairment.The GR translocation inhibition may be one reason for the GCs reduced anti-inflammation activity in COPD patients.

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270078,81470211).