野生酸棗仁中總黃酮的提取及其抗氧化活性

蔡雨晴　賈棹東　吳茜茜　蔣 卉*

(1 南疆化工重點實驗室/生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物質源保護利用重點實驗室/生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

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野生酸棗仁中總黃酮的提取及其抗氧化活性

蔡雨晴1,2賈棹東1吳茜茜1蔣 卉1,2*

(1 南疆化工重點實驗室/生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物質源保護利用重點實驗室/生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

【目的】試驗以酸棗仁為試驗材料，采用超聲波輔助提取酸棗仁中的總黃酮，研究其抗氧化活性。【方法】通過單因素試驗考察了乙醇濃度、浸泡時間、超聲溫度、超聲時間、料液比對酸棗仁總黃酮提取率的影響以及提取物的活性。【結果】按照單因素試驗確定參數變化水平區間，得到酸棗仁總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度64. 46%，浸泡時間12 h，超聲時間44. 02 min，超聲溫度62. 86 ℃，總黃酮提取含量為7. 415 2 mg/g。抗氧化試驗結果表明，酸棗仁黃酮清除DPPH、羥自由基的IC50值分別為0. 436 mg/mL和2. 505 1 mg/mL。【結論】優化了酸棗仁中總黃酮的提取方法，黃酮粗提物具有一定的清除自由基活性。

酸棗仁； 總黃酮； 超聲波輔助提取； 抗氧化活性

酸棗仁是鼠李科(Rhamnaceae)植物酸棗(Zizyphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow)的種子，具有養心補肝、寧心安神等功效，是較為常用的鎮定安眠的中藥，是衛生部認定的藥食同源的物品之一[1-2]。酸棗仁中主要的化學成分有黃酮[3-6]、生物堿[7-8]、皂苷[9-11]、三萜[12]等化合物。牛春燕，李游[13-14]等認為黃酮類物質為酸棗仁主要有效成分之一。本文對酸棗仁中黃酮的提取工藝進行優化，并對提取的黃酮進行了抗氧化實驗。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生酸棗仁：2014年11月采集于陜西省渭南市澄城縣交道鎮阿蘭寨村邊山上，經塔里木大學植物科學學院吳翠云教授鑒定為鼠李科(Rhamnaceae)植物酸棗(Zizyphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow)的種子。

蘆丁標準品(純度>98%)；石油醚、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫均為分析純；

DHG-9145A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；LD500搖擺式中藥粉碎機(長沙市岳麓區常宏制藥機械設備廠)；Sartorius-SQP電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；721-100紫外—可見分光光度計(上海菁華科技有限公司)；RE-50B旋轉蒸發器(上海申生科技有限公司)；儀表恒溫水浴鍋(上海申光儀器儀表有限公)；KQ3200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；800型離心沉淀器(上海手術器械廠)。

1.2試驗方法

1.2.1原料預處理

酸棗仁脫脂粉的制備：將酸棗仁粉碎，過20目篩，稱取一定量的酸棗仁粉置于索氏提取器中，用10倍體積的石油醚(60～90 ℃)水浴回流脫脂2次，每次回流3 h，并回收石油醚。將脫脂后的酸棗仁粉混勻后密封干燥保存。

1.2.2酸棗仁總黃酮含量的測定

1.2.2.1標準曲線的制作

蘆丁標準品溶液的制備：精密稱取蘆丁標準品12. 00 mg置于10. 0 mL容量瓶中，用乙醇超聲溶解，定容，即濃度為1. 200 mg/mL蘆丁溶液作為標準品母液。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法繪制蘆丁標準曲線[15]，溶液為空白對照，于波長510 nm測其吸光度。以蘆丁標準液濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，吸光度(A)為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。

1.2.2.2樣品中總黃酮提取率的測定

供試樣品溶液的制備：精確稱取2. 000 g酸棗仁粉，以乙醇濃度為20%，料液比為1:10，浸泡時間為12 h，在超聲功率為150 W，超聲溫度為40 ℃的條件下超聲提取30 min，提取液以3 000 r/min轉速離心20 min，即得供試樣品溶液。

取5. 0 mL供試樣品溶液于50. 00 mL容量瓶中，按測定蘆丁標準溶液吸光度的方法測定樣品溶液的吸光度，計算總黃酮的提取率。酸棗仁總黃酮提取率的計算公式為：

總黃酮平均含量(Q)=C×V×D/M；

總黃酮提取率/%=C×V×D×100/(M×Q)式中：C為總黃酮提取液的質量濃度(mg/mL)；V為溶液體積(mL)；D為溶液稀釋倍數；M為酸棗仁的質量(g)。

1.2.3超聲波輔助提取總黃酮單因素試驗設計

精確稱取酸棗仁粉2. 000 g，選擇乙醇濃度0、20、40、60、80、100%，超聲時間10、20、30、40、50、60 min，超聲溫度30、40、50、60、70、80 ℃，浸泡時間4、8、12、16、20、24 h，料液比1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，5個參試因子進行單因素試驗，考察各個因素對酸棗仁總黃酮提取率的影響。

1.2.4酸棗仁總黃酮的抗氧化性試驗

樣品溶液的制備：稱取12. 0 g脫脂酸棗仁粉末，以最優條件提取，離心，將得到的上清液濃縮，干燥，得到1. 646 g酸棗仁黃酮粗提物。

稱取0. 050 g粗提物于10. 0 mL的容量瓶中，加水溶解并定容，此樣品粗提物溶液濃度為5. 00 mg/mL，即1.0 mL相當于樣品中含有5. 0 mg粗提物，(1. 0 mL粗提物相當于蘆丁0. 041 5 mg)。將上述溶液配制成不同濃度的溶液0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8 mg/mL，上述溶液做清除羥自由基和還原力的測定，蘆丁含量分別為0. 004 15、0. 008 3、0. 016 6、0. 033 2、0. 049 8、0. 066 4 mg。

1.2.5.1酸棗仁總黃酮還原力的測定

將酸棗仁黃酮粗提物稀釋成不同的濃度梯度，各取1. 0 mL不同濃度樣品于試管中，分別加入1. 5 mL0. 200 mol/L的PH為6. 6的磷酸鹽緩沖溶液和1. 5 mL1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻，50 ℃水浴20 min，急速冷卻，再加入1. 5 mL10%的三氯乙酸溶液，于2000 r/min離心15 min，取上清液3. 0 mL，再加入3. 0 mL蒸餾水和0. 5 mL0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，于700 nm處測定吸光度。每組試驗平行操作3次。并以蘆丁標準品按照上述相同步驟操作，做陽性對照組。1.2.5.2酸棗仁總黃酮對DPPH自由基清除率的測定

精密移取2. 0 mL不同濃度的酸棗仁黃酮樣品于試管中，加入2. 0 mL0. 200 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻，室溫下暗處理20 min，以無水乙醇為參比，在517 nm處測定吸光度Ai；量取2. 0 mL不同濃度的樣品溶液于試管中，加入2. 0 mL蒸餾水，混合均勻，室溫下暗處理20 min，于517 nm處測定吸光度Aj；取2. 0 mL0. 20 mmol/L的DPPH溶液，加入2. 0 mL蒸餾水，混合均勻，室溫下暗處理20 min，于517 nm處測定吸光度A。每組試驗平行操作3次。并以蘆丁標準品按照上述相同步驟操作，做陽性對照組，分別計算清除率。

DPPH清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A]*100

1.2.5.3酸棗仁總黃酮對羥自由基清除能力的測定

精密移取1. 0 mL1. 500 mmol/L鄰二氮菲溶液于試管中，依次加入2. 0 mL0. 200 mol/L的PH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液和1. 0 mL樣品溶液，充分混勻，再加1. 0 mL1. 500 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻，加1. 0 mL0.10%過氧化氫溶液，混合均勻，置于38 ℃水浴鍋中保溫1 h，于536 nm處測定吸光度AS；用1.0 mL去離子水代替1. 0 mL過氧化氫溶液，測定吸光度Ab。每組試驗平行操作3次。并以蘆丁標準品按照上述相同步驟操作，做陽性對照組，分別計算清除率。

OH清除率(%)=AS/Ab*100

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

標準曲線如圖1所示。在0. 06～3. 00 mg/mL濃度范圍內，吸光度(A)與標準品濃度(mg/mL)線性關系良好。

圖1　蘆丁標準曲線

圖2　乙醇濃度對酸棗仁總黃酮提取率的影響

2.2單因素試驗結果分析

在固定超聲功率為150 W的條件下，采用單因素試驗方法研究乙醇濃度、料液比、浸泡時間、超聲溫度和超聲時間對酸棗仁黃酮含量的影響，試驗結果見圖2～6。

圖3　料液比對酸棗仁總黃酮提取率的影響

圖4　浸泡時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響

圖5　超聲溫度對酸棗仁總黃酮提取率的影響

圖6　超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖2～圖6可知，當乙醇濃度達到60%提取量達到峰值，隨著乙醇濃度的增大提取量逐漸下降，當浸泡時間達到12 h時，提取量達到峰值，隨著浸泡時間的增大提取量逐漸下降，因此確定浸泡時間12 h為最佳條件；當超聲時間達到40 min時，提取量達到峰值，隨著超聲時間的增大提取量逐漸下降，因此確定超聲時間40 min為最佳條件；當超聲溫度達到60 ℃時，提取量達到峰值，隨著超聲溫度的增大提取量下降，因此確定超聲溫度60 ℃為最佳條件。由以上單因素試驗結果得到酸棗仁黃酮適宜的提取條件是：乙醇濃度為60%，料液比1:25，浸泡時間12 h，超聲功率150 W，超聲溫度為60 ℃，超聲時間為40 min。

2.3酸棗仁總黃酮抗氧化性的測定結果與分析

2.3.1還原力測定結果

酸棗仁總黃酮和蘆丁標準品還原力測定結果見圖7。由圖7可以看出，酸棗仁黃酮具有一定的還原力，且蘆丁和酸棗仁黃酮的還原力都隨著溶液濃度的升高而增大。抗氧化活性與還原力之間普遍存在相關性，可通過測定還原力來表示抗氧化活性強弱，吸光度越高，還原能力越強。在0. 05～0. 80 mg/mL范圍內，蘆丁具有較強的還原能力，蘆丁的還原能力明顯強于酸棗仁黃酮的還原能力。

圖7　酸棗仁總黃酮和蘆丁還原力測定結果

2.3.2DPPH清除率的測定結果

圖8　酸棗仁總黃酮和蘆丁DPPH·清除率測定結果

由圖8可知，酸棗仁黃酮對DPPH具有一定的清除能力，且隨濃度的增大而增強。在0. 05～0. 50 mg/mL濃度范圍內服從線性分布，y=111. 17x+1. 532 6，R2=0. 992 5，根據線性方程，可得到酸棗仁黃酮的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration of a substance，IC50)，即清除率為50%需要樣品濃度為0. 436 mg/mL。根據線性方程y=20. 974In(x)+107. 26，R2=0. 974 0，得到蘆丁的IC50值為0. 0636 mg/mL。酸棗仁黃酮具有較強清除DPPH能力，但弱于蘆丁清除DPPH的能力，這是由于酸棗仁黃酮提取物為混合物，純度低，雜質比較多，影響其活性。一般認為某種物質的IC50值低于10. 0 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性[17]。

圖9　酸棗仁總黃酮和蘆丁對羥自由基清除率測定結果

由圖9可知，隨著酸棗仁黃酮提取物濃度的增大，提取物對羥自由基的清除能力增強。在0. 05～0. 80 mg/mL濃度范圍內服從線性分布，y=9. 506 6x+26. 185，R2=0. 967 7，根據線性方程，可得到IC50值為2. 505 1 mg/mL。根據線性方程y=21.731In(x)+93. 544，R2=0. 931 1，得到蘆丁的IC50值為0. 134 8 mg/mL，說明酸棗仁黃酮提取物具有清除羥自由基的能力，但明顯弱于蘆丁。

3　結論

本實驗以脫脂后的酸棗仁為實驗材料，采用超聲波輔助提取工藝，根據單因素試驗結果，建立了乙醇濃度、浸泡時間、超聲溫度、超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的回歸模型，能夠比較好的預測酸棗仁總黃酮的提取率。得到超聲波輔助提取酸棗仁總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度64.46%，浸泡時間12 h，超聲溫度62. 86 ℃，超聲時間44. 02 min，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮理論提取含量為8. 078 7 mg/g，實際總黃酮提取含量為7. 415 2 mg/g。

酸棗仁總黃酮和蘆丁的還原能力、清除DPPH、清除OH·都隨著溶液濃度的增大而增強，酸棗仁黃酮和蘆丁清除DPPH的IC50值分別為0. 436 mg/mL和0. 063 6 mg/mL，清除OH·的IC50值分別為2. 505 1 mg/mL和0. 134 8 mg/mL，說明酸棗仁黃酮具有一定的抗氧化活性，但蘆丁的還原力、清除DPPH、清除OH·的能力均強于酸棗仁黃酮，這是由于酸棗仁黃酮是粗提取物，抗氧化活性成分含量比較低，其他雜質的存在影響其抗氧化活性。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Zizyphi spinosi Semen

Cai Yuqing1,2Jia Zhuodong1Wu Xixi1Jiang Hui1,2*

(1 Key Laboratory of Chemical Engineering in South Xinjiang/ College of Life Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300) ( 2 Key Laboratory of Protection & Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps/ College of Life Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

【Objective】 Taking Zizyphi spinosi Semen as the test material, by using ultrasonic assisted extraction, the optimized extraction method of total flavonoids in Zizyphi spinosi Semen, and its antioxidant activity were studied. 【Methods】 A single factor test to determine the effects of ethanol concentration, time, ultrasonic temperature, ultrasonic time, solid-liquid ratio on the extraction rate and extract activity. 【Results】 According to the single factor test, the parameters ranges were determined, and were as follows: 64.46% ethanol concentration, 12 hours immersion, 44.02 min for ultrasonic and ultrasonic temperature of 62.86 °C. The anti-oxidation experiment showed that, the IC50values of Zizyphi spinosi Semen for clearance of DPPH and hydroxyl radicals were 0.4360mg / mL and 2.5051mg / mL respectively. 【Conclusion】 The extraction method of total flavones of Semen Ziziphi spinosa was optimized. And the total flavones exhibited radical scavenging activity under the experimental conditons.

Semen Zizyphi spinosi; total flavonoids; ultrasonic-assisted; antioxidant activity

2015-08-04

國家大學生創新創業訓練計劃項目(201410757011)。

蔡雨晴(1992-)，女，2015級在讀碩士，研究方向為植物資源保護利用。E-mail：caicaiyuqing@126.com

?E-mail：jh1156@163.com

1009-0568(2016)03-0046-06

S816.7

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.009