灘羊種質資源細胞庫的構建及細胞的生物學鑒定

令世鑫，馬桂蘭，徐水林，王家敏，馬忠仁，喬自林*

（1.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州　730030；

2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州　730010）

灘羊種質資源細胞庫的構建及細胞的生物學鑒定

令世鑫1，馬桂蘭2，徐水林2，王家敏1，馬忠仁1，喬自林1*

（1.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；

2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州730010）

目的：通過對灘羊體細胞的體外分離培養和保存，在細胞水平上保存其種質資源。方法：用胰蛋白酶消化分離培養腎和睪丸組織的原代細胞，用組織塊法培養耳緣組織的原代細胞，經傳代擴大培養后在液氮中保存。細胞復蘇后進行了活力、形態、生長特性和微生物污染的檢查。結果：灘羊腎、睪丸和耳緣組織的原代細胞生長良好，細胞凍存后復蘇檢查的細胞活力在91.12%～97.74%，細胞形態和長勢良好，生長曲線呈近“S”型曲線，最大增殖濃度為在2.12～3.19×105/ml，倍增時間在24.62～28.1 h，細菌、真菌、支原體和病毒檢查為陰性。結論：灘羊的種質資源細胞庫成功構建，使這一物種的種質資源在細胞水平上得到保存。

灘羊；種質資源；細胞庫；鑒定

灘羊屬蒙古羊，是我國獨特的裘皮羊品種，以“二毛皮，九道灣”馳名中外，主要產于寧夏賀蘭山東麓的銀川市及甘肅環縣、靖遠、景泰、白銀、皋蘭等附近各縣。灘羊長期在西北荒漠或半荒漠地區放牧形成的耐干旱、耐鹽堿、耐粗飼、強抗病性及強抗逆性等特征，且具有優良的遺傳穩定性，是國家二級保護品種。自從國家實行封山禁牧政策以來，灘羊由完全的放牧模式轉變為圈羊，使其生存條件發生改變，加之沒有系統開展科學的繁育飼養模式，品種退化現象較嚴重［1］。在實施國家自然科技資源共享平臺項目《畜禽種質資源收集、整理與保存》以來，先后有幾百個品種的家養和野生畜禽的種質資源在細胞或基因水平上得到了長期保存。通過對灘羊體細胞的分離、培養、保存和鑒定，在細胞水平長期保存了該優良地方品種遺傳資源同時，也為該品種基因組文庫構建和遺傳多樣性研究提供生物學材料。

1　材料

灘羊腎、睪丸和耳緣組織采自甘肅靖遠某屠宰場，DMEM與胰蛋白酶（Gibco）、胎牛血清（蘭州民海生物，添加比例為10%）、DMSO（ThermoFisher）、無菌和支原體檢查培養基（北京三藥）、Hoechst33258（Sigma）、病毒檢查用Vero細胞和牛腎原代細胞（本室保存）、雞和豚鼠紅細胞等。

主要儀器設備有CO2培養箱（Thermo，3111型）、倒置相差顯微鏡（Olympus，CK40-32PH型）、熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，IX71型）、液氮罐（樂山東亞）等。

2　方法

2.1樣品采集及處理

選擇精神狀態良好、膘肥體健的30～50日齡灘羊羔羊經頸動脈放血處死，在剝皮之前，用手確定兩個睪丸都在陰囊中時，用線繩扎緊陰囊，使從結扎1 cm處剪取時睪丸在陰囊中并保持無菌，切口用碘伏反復消毒后放進消毒好的樣品袋中并標記。剖腹后連同包裹的脂肪一起摘取腎臟，且保留2 cm以上的血管和輸尿管，在干凈的開口容器內放置待脂肪固化后裝入自封袋，標記性別。割下整個耳朵，裝入自封袋，標記性別。所有組織裝入事先放有冰塊的樣品箱，宰后6 h內帶回實驗室。共采集了20個個體的腎和耳朵，公母各半，10個個體的睪丸。

2.2原代培養

按文獻方法采用胰蛋白酶消化法分離培養腎和睪丸組織細胞［2］，用組織塊法培養耳緣組織細胞［3］。

2.3傳代培養和凍存

生長致密的單層原代細胞用胰蛋白酶消化傳代培養，其中腎和睪丸組織細胞以1∶3比例分種，耳緣細胞第一次傳代按1∶2比例，其后按1∶3比例分種培養。待細胞擴大培養至總量達2×107以上時采用常規方法在液氮中保存（-196℃），用凍存保護液（10%DMSO+20%胎牛血清+70%DEMEM）調整細胞密度至2× 106～3.0×106/ml。

2.4細胞復蘇及活力檢查

從液氮中取出細胞凍存管，在39℃左右的水浴中快速解凍，用培養液懸浮細胞后800 r/min，10 min，棄上清，細胞沉淀用培養液重新懸浮后以2.0×105/ml左右接種培養，并用臺盼藍染色法檢查細胞活力。

2.5生長曲線

將復蘇培養的細胞傳代一次培養到單層用胰蛋白酶消化，用培養液調整濃度至1.0×104/ml，接種到24孔培養板，每孔1 ml，置37℃5%CO2，每隔24 h取3孔細胞進行消化計數求平均值，直至細胞密度降低為止，用培養時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標繪制生長曲線并求得最大增殖濃度和倍增時間。

2.6細菌、真菌和支原體污染檢查

按文獻所述方法進行［4］。

2.7病毒檢測

運用細胞培養法對復蘇培養一代的細胞檢查非血吸附病毒和血吸附病毒［5］。

3　結果

3.1原代培養

灘羊腎組織消化培養的原代細胞從第3天起可見大部分培養瓶中有較多的細胞貼壁分裂生長，第4天在培養瓶生長面70%以上長滿了細胞，多為長梭形和多角形型細胞，第6天細胞成較致密單層，以長梭形為主（如圖1A和1B）。

圖1　灘羊腎細胞（A原代4d，10XB原代6d，20XC傳代第1代72h，10XD復蘇第1代72h，20X）

灘羊睪丸組織消化培養的原代細胞生長比腎組織的原代細胞要快，培養2 d時可見有細胞分裂生長，第4天生長面90%以上長滿了細胞，細胞以長梭形和多

角形細胞為主（如圖2A和2B）。

圖2　灘羊睪丸細胞（A原代2d，20XB原代4d，20XC傳代第1代48h，10XD復蘇第1代48h，20X）

灘羊耳緣組織塊法培養時第5天有部分組織塊附近有大量細胞長出，第7天時有明顯致密的單層細胞，細胞均呈長梭形，形態整齊均勻（如圖3A和3B）。

圖3　灘羊耳緣細胞（A原代5d，10XB原代7d，10XC傳代第1代48h，20XD復蘇第1代48h，20X）

3.2傳代培養和凍存

灘羊腎組織原代細胞按1∶3傳代后72 h可形成致密的單層細胞，視野內可見成片的上皮型細胞區（如圖1C）；睪丸組織細胞按1∶3傳代后48 h可形成單層細胞，細胞形態規則整齊，有似“水流樣”和“漩渦狀”走向（如圖2C）；耳緣組織細胞首次按1∶2傳代后48 h也能形成單層，以長梭形細胞為主，細胞間隙比腎細胞和睪丸細胞大，其后按1∶3傳代生長速度變快，48 h形成單層細胞（如圖3C）。

3.3復蘇和活力檢查

灘羊腎、睪丸和耳緣組織細胞的平均復蘇活力為94.48%、91.12%和97.74%。復蘇后腎細胞在72h形成致密單層（如圖1D）；睪丸和耳緣組織細胞48h形成單層（如圖2D和3D），細胞長勢均良好，可連續培養5代以上。

3.4生長曲線

圖4　灘羊體細胞的生長曲線圖

三種細胞的生長曲線均呈“S”型（如圖4），腎、睪丸和耳緣細胞的最大增值濃度為2.82×105/ml、2.12×105/ml和3.19×105/ml，倍增時間為25.53h、28.1h和24.62h。

3.5細菌、真菌和支原體檢查

培養細胞的培養基檢查細菌和真菌，培養7 d均沒有菌生長；在支原體液體基中培養14 d顏色沒有變化，在固體培養基中培養14 d也沒有菌落生長；細胞凍融處理的上清液接種Vero細胞上用Hoechst 33258染色后只觀察到細胞核有藍色熒光，其它部位沒有熒光。3.6病毒檢測

在原代與傳代培養過程中，利用倒置相差顯微鏡觀察未見病毒引起的細胞病變；將細胞培養物分別接種到Vero和牛腎原代細胞培養21 d，看不到細胞病變現象；雞和豚鼠紅細胞吸附試驗為陰性。

4　結論

畜禽種質資源是大自然留給人類的寶貴財富，是保障人類良好生存環境和衣食住行必不可少的物質，是關系到一個國家和民族競爭力的重要戰略物資，收集和研究各種畜禽種質資源，建設各類國家種質資源庫，建立功能基因開發和利用的國家基礎條件共享平臺具有重要的社會價值。灘羊為國家二級保護動物，是2001年被農業部列入第一批畜禽品種保護名錄，其品質退化嚴重已是不爭的事實。通過種質資源細胞庫的構建使這一重要的種質遺傳資源在細胞水平上得以保存下來，也為相關遺傳學研究提供了有效的理論依據和理想的生物材料。

［1］郭天芬，高雅琴，劉慶霞，等.灘羊產業現狀分析及發展建議［J］.畜牧獸醫科技信息，2007，（05）：10-11.

［2］令世鑫，徐水林，馬偉等.蘭州黑白花奶牛腎組織細胞系的建立［J］.甘肅畜牧獸醫，2016，46（5）：68-69，72.

［3］喬自林，馮玉萍，李明生，等.蘭州大尾羊耳緣組織成纖維細胞系的建立［J］.黑龍江農業科學2012，（10），64-68.

［4］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典三部2010年版［M］.北京：中國農業出版社，2011.

［5］國家藥典委員會.中國人民共和國藥典三部2010年版［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

（編輯：高真貞）

Q954.6-3

B

1006-799X（2016）15-0092-02

國家科技基礎條件平臺-家養動物平臺，西北民族大學中央高校基本科研業務費專項資金項目（zyp2015）

令世鑫（1966-），男，甘肅通渭人，工程師，主要從事家養動物種質資源保護利用工作。

喬自林（1976-），男，甘肅永靖人，高級實驗師，研究方向為動物細胞培養技術。