犬腹瀉性疾病的細菌分離鑒定及藥敏試驗

盛賢均，郭成華，賀永建

（1.重慶市榮昌區古昌鎮畜牧獸醫站，重慶榮昌 402460；

2.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶榮昌 402460）

犬腹瀉性疾病的細菌分離鑒定及藥敏試驗

盛賢均1，郭成華1，賀永建2

（1.重慶市榮昌區古昌鎮畜牧獸醫站，重慶榮昌 402460；

2.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶榮昌 402460）

通過對病犬不同類型腹瀉病糞便中細菌的分離、鑒定，并分別進行藥敏試驗，以健康犬作為對照，找出引起犬發生腹瀉的細菌性原因，針對不同類型腹瀉疾病篩選出最敏感的藥物。結果表明犬腹瀉性疾病的常見致病菌為大腸桿菌、沙門氏菌、耶爾森菌、變形桿菌，丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、鏈霉素對上述病菌的作用效果較好。

犬；腹瀉疾??；細菌；分離；鑒定；藥敏試驗

隨著人民生活水平的提高，人們對寵物的飼養量也日益增加，而在眾多的寵物當中，犬無疑是最受歡迎的。此外，因為狗肉營養豐富，味道鮮美，并有強身祛病之功效，自古以來為廣大群眾所喜愛。近年來隨著肉用犬需求量的不斷增加，全國范圍內的肉犬飼養熱持續不降，規模飼養前景看好。但是，一些犬類疾病尤其是犬腹瀉病，如寵物犬節日期間因暴飲暴食而引起的消化不良、胃腸炎的病例明顯增多，犬瘟熱、細小病毒、冠狀病毒等病毒性因素所引起的病犬腹瀉病，犬大腸桿菌、副傷寒桿菌等所致的細菌性腹瀉病等在養犬生產中頻繁發生，導致大量病犬死亡，嚴重威脅著我國養犬業的健康發展。

犬腹瀉是指病犬排糞時，出現排糞次數多，糞中水含量大，有時混有血液，糞便數量增多的一種疾病。它是犬發病過程中的一種常見癥狀，其病因復雜，臨床上很多疾病都會導致腹瀉。腹瀉對機體影響很大，可引起營養不良，維生素缺乏，貧血，降低身體的抵抗力，引起脫水，喪失大量的電解質，如鈉、鉀、鈣及鎂等，最終出現電解質紊亂、酸堿中毒，甚至引起死亡［1］。這類病的發生不分季節、地區、年齡，但在養犬生產中犬腹瀉多發于幼年犬只。然而，在犬腹瀉病的臨床治療中出現了許多治療無效或效果很差的現象，主要原因可能與細菌的耐藥性產生有關。

本研究擬通過對患有不同類型腹瀉性疾病的犬糞便中細菌進行分離、鑒定，并分別進行藥敏試驗，以健康犬作為對照，找出引起病犬發生腹瀉的細菌性原因，針對不同類型腹瀉疾病篩選出最敏感的藥物，以期為犬腹瀉性疾病的臨床用藥，提高臨床療效，避免臨床更多耐藥菌株的產生，提供科學依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1培養基SS瓊脂平板，普通瓊脂平板，麥康凱瓊脂平板，營養肉湯，三糖鐵斜面培養基，半固體瓊脂培養基，葡萄糖蛋白胨水溶液，Dumham氏蛋白胨水溶液，各種培養基均為自制，均按文獻［2］方法配制。

1.1.2主要藥品及試劑葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量發酵管，Simmon氏枸櫞酸鈉微量發酵管，藥敏紙片（由杭州微生物試劑有限公司生產），吲哚試劑，甲基紅試劑。

1.1.3主要實驗器材OLYMBUS顯微鏡（日本OLYMPUS），電子天平（上海?？惦娮觾x器廠），超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司制造），可調式移液槍（熱電（上海）儀器有限公司），隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠），電熱鼓風恒溫干燥箱（成都電熱儀器廠），Electrolux牌冰箱（上海伊萊克斯實業有限公司），天平，滅菌鍋，培養皿等。

1.1.4病料來源由榮昌地區獸醫門診提供。

1.1.5實驗動物健康50日齡本地犬25只，購于重慶市榮昌區昌元街道附近農戶。

1.2實驗方法

1.2.1癥型分類及病料采集

1.2.1.1根據糞便性狀不同分類

出血性腹瀉型：病犬排糞次數增加，糞便呈泥狀，糞便呈黑色或黑綠色時為小腸出血，糞便表面有血絲或鮮血為大腸出血，有的糞便上有大量偽膜，呈醬油色（番茄汁狀）、帶有腥臭氣味，滿足此條件歸為出血性腹瀉型，此癥型共采10個樣。

非出血性腹瀉型：病犬排糞次數增多，糞便呈稀粥狀，呈黃色或黃綠色，常為急性水樣下痢，有時糞便中有氣泡，糞便中無出血現象，也不見未消化的食物成分，可見于多種病因，滿足此條件歸為非出血性腹瀉型，此癥型共采10個樣。

消化不良性腹瀉型疾?。喝募S便中會有少量的植物細胞、未消化的飼料顆粒、肌肉纖維，如果這些成分大量存在且排糞次數增多，糞便酸臭，說明犬食量過多、消化不良、腸蠕動過速，食物未被充分消化即被排出，滿足此條件歸為消化不良性腹瀉型，此癥型共采10個樣。

1.2.1.2病料的采集采取出現腹瀉性疾病病犬的糞便（稀糞、血便、含未消化的飼料顆粒的稀糞），先用酒精消毒肛門周圍，用無菌棉簽在直腸內取適量病料置于無菌試管中，酒精燈灼燒試管口，封閉管口，立即用營養肉湯增菌，放入37℃恒溫箱中培養24 h，菌液備用。

1.2.2細菌分離、鑒別培養取出肉湯觀察管底有無沉淀，是否渾濁，有無菌環和菌膜。取菌液劃線接種于普通瓊脂培養基上，37℃恒溫培養24 h。取在普通瓊脂培養基中生長較好的單個菌落接種到鑒別培養基（SS瓊脂培養基，麥康凱培養基）中37℃恒溫培養24 h，觀察菌落的顏色、形態特征，在鑒別培養基中鉤取生長較好的單個菌落接種到普通無菌肉湯中37℃恒溫培養24 h，即純培養物增菌培養，菌液備用。

1.2.3染色鏡檢挑選上述培養基中的單個菌落，進行革蘭氏染色，然后用光學顯微鏡（10×100）觀察菌落形態［3］。

1.2.4生化鑒定

1.2.4.1三糖鐵培養基把純培養物接種到三糖鐵斜面培養基，接種時先涂布斜面再穿刺底層，37℃下恒溫培養24h，觀察培養基變化，觀察斜面和底層的顏色變化和產氣情況，凡培養基變為黃色者，表示產酸；凡培養基變黃并含氣泡者，為產酸產氣；凡培養基變為紅色者，表示產堿；凡培養基不變色者，表示該菌不發酵此培養基［4］。

1.2.4.2糖發酵把純培養物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖的微量發酵管中，37℃下恒溫培養24h，觀察產酸產氣情況。凡培養基變為黃色者，表示該菌發酵此糖產酸；凡培養基變黃并含氣泡者，為發酵此糖產酸產氣；凡培養基變為紅色者，表示該菌發酵此糖產堿；凡培養基不變色者，表示該菌不發酵此糖［5］。

1.2.4.3甲基紅（MR）試驗取純培養物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養基中，置37℃培養48～72 h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養液呈紅色者為陽性，以“+”表示；橙色者為可疑，以“±”表示；黃色者為陰性，以“-”表示。

1.2.4.4吲哚（靛基質）試驗以接種環將純培養物接種于Dunham氏蛋白胨水溶液中，置37℃培養24～48 h（可延長4～5 d）；取蛋白胨水培養管先加乙醚少量，塞緊棉塞搖振試管，使乙醚與培養液充分混勻，靜置片刻，待乙醚浮于液面上層時，沿管壁加入吲哚試劑2～3滴。凡在乙醚層內出現玫瑰紅者為陽性反應，不變色為陰性反應［6］。

1.2.4.5枸櫞酸鹽利用取純培養物接種于枸櫞酸鈉微量發酵管中，置37℃培養48～72 h，觀察是否有細菌生長，并觀察其顏色變化。凡有細菌生長，培養基變為深藍色者，為該菌利用枸櫞酸鹽，否則為陰性反應。

1.2.4.6運動力把純培養物穿刺接種于半固體培養基，穿刺線應在培養基中央，一直刺到管底，拔出穿刺針時應順原穿刺線取出，切不可左右滑動，以免影響觀察結果。37℃恒溫培養24 h，觀察半固體瓊脂培養管，凡細菌有鞭毛能運動者，則部分或全部半固體瓊脂變混濁，凡不運動者細菌僅在穿刺線上生長，穿刺線外圍培養基仍然透明。

1.2.5動物復歸試驗將25只健康50日齡本地犬隨機分為5組，每組5只，其中4個組為試驗組，1個組為對照組。將所分離到的4種細菌制成含活菌菌液，活菌數為1.5×107。試驗組每犬各皮下注射一種菌液2 mL，對照組各皮下注射無菌蒸餾水2 mL。注射菌液后，注意觀察犬只的臨床癥狀，每天為其測量體溫、呼吸、脈搏并記錄，出現腹瀉癥狀后注意觀察并記錄糞便性狀。

1.2.6藥敏試驗采用藥敏試紙擴散法，即將分離菌的純培養物分別均勻涂抹在普通瓊脂培養基上，靜置5 min后貼上藥敏試紙片。置37℃恒溫箱中培養反應24 h，測量藥敏試紙片抑菌圈的直徑并判定其敏感性［7］。

2　試驗結果

2.1細菌鑒別培養及鏡檢結果

圖1　大腸桿菌的麥康凱培養基

圖2　沙門氏菌的SS瓊脂培養基

圖3　大腸桿菌

圖4　沙門氏菌

2.2生化試驗結果，見表1

表1　各菌種生化鑒別結果

由表1可知，分離出的細菌經三糖鐵試驗產酸，葡萄糖、乳糖、麥芽糖及甘露糖發酵試驗呈陽性，甲基紅、吲哚試驗及運動力試驗呈陽性，說明該菌為大腸桿菌；分離出的細菌經三糖鐵試驗斜面產堿、底面產酸，葡萄糖、麥芽糖及甘露糖發酵試驗呈陽性，甲基紅、枸櫞酸試驗及運動力試驗呈陽性，說明該菌為沙門氏菌；分離出的細菌經三糖鐵試驗產酸，硫化氫試驗陽性，麥芽糖及甘露糖發酵試驗呈陽性，甲基紅及運動力試驗呈陽性，說明該菌為變形桿菌；分離出的細菌經三糖鐵試驗產酸，麥芽糖、蔗糖及甘露糖發酵試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陽性，說明該菌為耶爾森菌。

2.3不同癥型細菌分離

通過分離鑒別從30個樣本中一共分離出四個菌種，即大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、耶爾森菌，分離結果見表2。

表2　不同癥型細菌分離結果

由上表可見，大腸桿菌在各種癥型中分離出的比例都很高，而在健康對照組中的比例較低，差異顯著，說明大腸桿菌為腸道兼性致病菌之一。沙門氏菌在出血性腹瀉型和非出血性腹瀉型中所占比例較高，與健康對照組比較差異顯著，消化不良性腹瀉型與健康對照組差異不顯著，說明沙門氏菌為原發性致病菌。變形桿菌在各種癥型和健康對照組中分離出的比例相當，無顯著差異，說明變形桿菌為腸道正常菌之一。耶爾森菌在出血性腹瀉型和非出血性腹瀉型中所占比例較高，與健康對照組差異顯著，消化不良性腹瀉型與健康對照組都沒有分離出此菌，說明耶爾森菌為原發性致病菌。

2.4動物試驗結果觀察

試驗組犬只36 h內相繼出現相應腹瀉癥狀，但是接種大腸桿菌和變形桿菌的試驗組中分別有2只和1只犬未出現腹瀉癥狀，其余接種大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌菌液試驗組犬只出現不同程度腹瀉，犬只排糞次數增多，糞便呈稀粥狀，呈黃綠色，糞便中有少量氣泡，糞便中無出血現象，也不見未消化的食物成分。接種耶爾森菌菌液試驗組犬只均出現腹瀉癥狀，排糞次數增加，糞便呈泥狀，糞便呈黑綠色，糞便中有少量偽膜，呈醬油色、帶有腥臭氣味。對照組的五只犬均未出現腹瀉癥狀。

2.5藥敏試驗結果觀察

表3　各菌種藥敏試驗結果

判定標準［8］：抑菌圈大于20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～15 mm為中敏，小于10 mm為耐藥

圖5　耶爾森菌藥敏試驗結果

圖6　變形桿菌藥敏試驗結果

從表3可見，藥敏試驗結果表明丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、先鋒必素效果明顯，對所分離的四種病原菌均有較好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素可能由于廣泛性的使用，病原菌已經對其產生耐藥性，故而其抗菌效果較差。

3　分析與討論

3.1腹瀉原因

腹瀉是臨床中最常見的犬病，也是養犬生產中犬發病后最為常見的癥狀之一。引起犬腹瀉的原因主要有：

3.1.1感染常由細菌感染（如致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等）、病毒感染（如細小病毒、犬瘟熱病毒、冠狀病毒等）、真菌感染（如白色念珠菌、組織胞漿菌）、寄生蟲感染（如弓形體、蛔蟲等）造成［8］。當感染時，病原體吸附于腸黏膜表面，不侵入腸黏膜。通過產生毒素引起腸黏膜上皮細胞變性壞死，蛋白質、黏液滲出，同時炎癥刺激腸運動加快，造成腹瀉；有些病原體吸附侵入腸黏膜，并繁殖和產生毒素，引起腸黏膜的變性壞死，大量滲出。如痢疾桿菌、大腸桿菌等。有些病毒感染侵入小腸上皮細胞，在細胞內繁殖，引起上皮細胞受損脫落，導致吸收功能障礙，產生腹瀉，如細小病毒感染、冠狀病毒感染等。病原體在侵入腸黏膜細胞時還引起炎性浸潤，這些炎性細胞釋放炎性介質［9］。引起腸黏膜的變性壞死和滲出，從而導致腹瀉。

3.1.2消化機能不全或吸收不良消化機能不全多見于斷奶仔犬。由于斷奶仔犬胃腸功能不健全，消化酶分泌不足，從吃母乳變成了以飼料為主，加上斷奶應激，體內酶的水平下降，影響營養成分的消化和吸收，從而導致腹瀉。

3.1.3過食過多的食物在還未來得及消化分解就排出體外，這樣的腹瀉物中含有大量的消化不全的顆粒飼料和食糜。

3.1.4胃腸道菌群失調性腹瀉正常情況下，胃腸道處于有益菌和有害菌相對平衡的狀態之中。長期大量使用抗生素，造成機體菌群失調，平衡被打破，容易發生腹瀉［10］。

3.2引起腹瀉常見菌種分析

本研究通過對3種不同類型的腹瀉病犬糞便中的細菌進行分離、染色鏡檢、培養特性鑒定及生化試驗分析，結果分離到的細菌有大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、耶爾森菌。其中沙門氏菌、耶爾森菌為原發性致病菌，大腸桿菌、變形桿菌為犬消化道正常菌群中常在菌。原發性致病菌毒力較強，發生消化道感染時多以原發性致病菌為主；當犬機體某些條件發生改變時，也可引起正常菌群中的條件性致病菌感染消化道［11-13］。試驗組分離到的這4種細菌，均為革蘭氏陰性菌。據此可知，引起犬消化道感染的病原菌中以革蘭氏陰性菌為主。

當然，引起犬腹瀉的病原菌還比較多，比較常見的還有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等，但在本次實驗中均未曾分離到。其原因有待進一步探討。

動物復歸試驗結果表明：由于大腸桿菌和變形桿菌均為腸道正常菌之一，但此次分離出的大腸桿菌和變形桿菌使試驗組中大部分犬只出現腹瀉癥狀，說明此次分離出的大腸桿菌和變形桿菌均有致病性，為腸道兼性致病菌之一；接種沙門氏菌和耶爾森菌菌液的試驗組中的犬只均出現腹瀉癥狀，說明沙門氏菌和耶爾森菌為原發性致病菌。

3.3藥敏試驗分析

藥敏試驗中，丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、先鋒必素效果明顯，對所分離的五種病原菌均有較好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素可能由于廣泛性的使用，病原菌已經對其產生耐藥性，故而其抗菌效果較差。大腸桿菌感染，可能是原發病因，也可能是由其他病因繼發大腸桿菌感染［14］。在選用抗生素時不但要考慮其抗菌效果，而且還應考慮其副作用。若其中1種抗生素可以達到治療效果，應避免同時使用2種或2種以上抗生素。

4　結論

上述實驗結果證明，大腸桿菌和變形桿菌均為犬腹瀉性疾病的兼性致病菌，沙門氏菌和耶爾森菌均為犬腹瀉性疾病的原發性致病菌。丙氟哌酸、頭孢氨噻肟、慶大霉素、先鋒必素對所分離的四種病原菌均有較好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素對上述4菌的抗菌效果較差。

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（編輯：高真貞）

S858.292

B

1006-799X（2016）17-0083-05

盛賢均（1970-），男，重慶榮昌人，獸醫師，主要從事畜牧獸醫工作。