超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖和黃酮的研究

張煥麗，李凡姝，馬　慧，崔曉彤，王　霞，劉　娣，翟　歡，肖志剛

（沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽　110034）

超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖和黃酮的研究

張煥麗，李凡姝，馬慧，崔曉彤，王霞，劉娣，翟歡，*肖志剛

（沈陽師范大學糧食學院，遼寧沈陽110034）

我國黑木耳資源豐富，其中含有多糖、黃酮等多種活性物質，是一種營養較高的食用菌，同時也具有重要的藥用價值。采用超聲波輔助熱水法提取黑木耳中的多糖和黃酮，分別用苯酚-濃硫酸法和三氯化鋁法測定提取物中多糖和黃酮。在單因素試驗結果的基礎上，選擇液料比、超聲時間和提取溫度3個因素進行三因素三水平響應面試驗，并分別建立多糖、黃酮含量的二次回歸方程，通過響應面分析法確定黑木耳多糖和黃酮含量的最佳工藝條件為液料比60∶1，超聲時間15 min，提取溫度70℃，黑木耳多糖和黃酮的最大含量分別為7.78，0.56 mg/g。

黑木耳；多糖；黃酮；含量；響應面法

黑木耳，別名黑菜，因其形狀似耳，色調呈黑褐色而得名。黑木耳為木耳科植物，生長在楊樹、椴樹、槐樹等120多種闊葉樹的腐木上，單生或群生；人工培植以椴木和袋料為主[1]。黑木耳性平、味甘，具有涼血、止血、活血、益胃、潤燥的功效[2]。黑木耳是一種含有豐富營養素的食用菌，在保健品、藥材方面也具有開發價值[3]。黑木耳中多糖是其主要活性成分，除此之外，黃酮也發揮著重要的活性作用[4]。相關研究表明，黑木耳多糖和黃酮均有抗氧化、降血脂、抗腫瘤、抗衰老等功效[5-6]。我國黑木耳資源豐富，對黑木耳在醫療保健方面的研究也在逐步深入。

目前，我國對于黑木耳中活性物質的提取工藝研究主要集中在單獨提取黑木耳某一活性物質方面，對黑木耳多糖和黃酮類化合物同步提取工藝方面的研究較少。本文通過熱水浸提和超聲波2種方法相結合，同步提取黑木耳中多糖和黃酮，對綜合提取黑木耳多糖和黃酮工藝進行優化，通過精確的計算與統計分析得出最佳工藝參數，為提取物的工業化生產提供理論根據[7]。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1材料

黑木耳，市售，產自黑龍江省；葡萄糖，沈陽市東興試劑廠提供；蘆丁標準品，上海多烯生物科技有限公司提供；苯酚，天津市大茂化學試劑廠提供；濃硫酸、丙酮，沈陽化學試劑廠提供；三氯化鋁，國藥集團化學試劑有限公司提供；乙醇，沈陽瑞豐精細化學品有限公司提供；石油醚，沈陽市新化試劑廠提供。以上試劑均為分析純。

1.1.2設備

DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司產品；JXFM110型錘式旋風磨，上海嘉定糧油儀器有限公司產品；DT-200型電子天平，北京天平物華醫療儀器有限責任公司產品；TD5Z型離心機，湖南凱達科學儀器有限公司產品；WFZUV-2000型紫外分光光度計，尤尼科（上海）儀器有限公司產品；KQ5200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.2試驗方法

1.2.1黑木耳多糖和黃酮提取工藝流程

（1）多糖標準曲線的繪制。準確稱取標準葡萄糖0.02 g于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，得到葡萄糖標準溶液。分別吸取葡萄糖標準溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL于25 mL有塞試管中，加蒸餾水補至2 mL，再以2 mL蒸餾水作為空白，分別加入6%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，靜置15 min后搖勻，室溫放置20 min。然后，于波長490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度（μg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[8]。

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1　葡萄糖標準曲線

根據葡萄糖標準曲線，得回歸方程為C1=0.015 9X1+ 0.016 3，R21=0.997 4。

（2）黃酮標準曲線的繪制。準確稱取蘆丁標準樣品0.02 g于100 mL容量瓶中，加入一定量無水乙醇使其充分溶解后，再定容至刻度，搖勻，配成蘆丁標準溶液。分別吸取蘆丁標準溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于25 mL有塞試管中，加無水乙醇至10 mL。再向各個試管中分別加入0.5 mL的10%氯化鋁溶液，然后靜置20 min。于波長415 nm處以無水乙醇調節零點，測定各管吸光度。以蘆丁質量濃度（μg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

黃酮標準曲線見圖2。

圖2　黃酮標準曲線

根據黃酮標準曲線，得回歸方程為C2=0.009 2X2+ 0.007 1，R22=0.998 6。

1.2.3黑木耳多糖和黃酮的測定

黑木耳粉碎，過80目篩。稱取2 g黑木耳干粉m，放入250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，混勻，先放入超聲儀器中進行超聲浸提，后放入恒溫水浴鍋中進行水浴浸提，然后以轉速4 500 r/min離心15 min，取上清液。殘渣加入與上次操作相同的水量，重復上述過程，將2次濾液合并[10-13]。向濾液中加入等比例的乙醇，進行過夜醇沉。醇沉液以轉速4 500 r/min離心10 min，上清液和沉淀分離。

上清液置于水浴鍋中濃縮，定容至25 mL，記為V1。吸取1 mL加入具塞試管中，用乙醇溶液定容至10 mL，向試管中加入10%氯化鋁溶液0.5 mL，靜置20 min。于波長415 nm處，以無水乙醇調節零點，測定吸光度[14]。

向沉淀中加入丙酮和石油醚，清洗沉淀，再進行過濾分離，直至沉淀表面的溶劑揮發掉。然后用蒸餾水將沉淀溶解，定容至100 mL，記為V2[15-18]。再吸取1 mL溶液加入有塞試管中，加入1 mL的6%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，靜置15 min后搖勻，室溫放置20 min。然后，于490 nm處測吸光度。

多糖含量按R=C1V1/1 000 m計算；黃酮含量按R'=C2V2/1 000 m計算。

1.2.4響應面試驗設計

根據Box-Behnken中心組合設計原理，綜合單因素試驗結果，以液料比（A）、超聲時間（B）、提取溫度（C）為自變量，分別以黑木耳多糖和黃酮含量為響應值，設計了三因素三水平的響應面分析試驗[19-20]。

響應面設計因素與水平設計見表1。

表1　響應面設計因素與水平設計

2　結果與分析

2.1黑木耳多糖和黃酮提取結果分析

按照試驗設計，共進行17組試驗。

Box-Behnken試驗設計及試驗結果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計及試驗結果

利用Design Expert軟件，通過對黑木耳多糖和黃酮含量的試驗數據進行多元回歸擬合，得到黑木耳多糖含量和黃酮含量對編碼自變量液料比、超聲時間、提取溫度的二次多項回歸方程。

多糖三元二次回歸方程：

Y=7.61+0.43A+0.27B-1.11C-0.62AB+0.25AC+0.42BC-0.71A2-1.62B2-2.57C2.

多糖擬合二次多項式模型的方差分析見表3。

由表3可知，F回歸=154.03，p<0.000 1，表明模型極顯著。失擬項p=0.817 9，表明失擬不顯著。模型中一次項A，B，C對多糖含量的影響極顯著（p<0.01）；二次項A2，B2，C2對多糖含量的影響極顯著（p<0.01）；交互項AB，BC對多糖含量的影響極顯著（p<0.01），AC對多糖含量的影響顯著。表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系，因素間的交互作用對黑木耳多糖含量有影響。模型的調整確定系R2Adj=0.988 5，即該模型能解釋98.85%的響應值變化，說明該模型擬合程度良好，可以用此模型對超聲波輔助熱水浸提法提取黑木耳多糖含量進行分析和預測。

表3　多糖擬合二次多項式模型的方差分析

黃酮三元二次回歸方程：

Y'=0.55+0.023A+0.021B-0.082C-0.054AB+0.013AC+0.020BC-0.049A2-0.099B2-0.15C2.

黃酮擬合二次多項式模型的方差分析見表4。

表4　黃酮擬合二次多項式模型的方差分析

由表4可知，F'回歸=37.17，p<0.000 1，表明模型極顯著。失擬項p=0.344 2，表明失擬不顯著。模型中一次項A對黃酮含量的影響顯著（p<0.05），C對黃酮含量的影響極顯著（p<0.01）；二次項A2，B2，C2對黃酮含量的影響極顯著（p<0.01）；交互項AB對黃酮含量的影響極顯著（p<0.01）。表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系，因素間的交互作用對黑木耳黃酮含量有影響。模型的調整確定系R'2Adj=0.953 2，即該模型能解釋95.32%的響應值變化，說明該模型擬合程度良好，可以用此模型對超聲波輔助熱水浸提法提取黑木耳黃酮含量進行分析和預測。

2.2黑木耳多糖和黃酮含量的響應面分析

利用Design Expert軟件對試驗數據進行二次多元回歸擬合。根據二次模型所做的響應曲面及其相應的等高線圖可以評價試驗因素對黑木耳多糖含量的兩兩交互作用，確定各因素的最佳水平范圍。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著；圓形則相反，此時兩因素的交互作用可以忽略。

液料比和超聲時間的交互作用對黑木耳多糖含量的響應面與等高線見圖3，料液比和超聲時間的交互作用對黑木耳黃酮含量的響應面與等高線見圖4。

圖3　液料比和超聲時間的交互作用對黑木耳多糖含量的響應面與等高線

由圖3可知，液料比和超聲時間的交互作用對多糖含量的影響顯著。從超聲時間的曲面斜率略大于液料比的曲面斜率可知，超聲時間對黑木耳多糖含量的影響大于液料比的影響。

由圖4可知，液料比和超聲時間的交互作用對黃酮含量的影響顯著。從超聲時間的曲面斜率略大于液料比的曲面斜率可知，超聲時間對黑木耳黃酮含量的影響大于液料比的影響。

3　結論

黑木耳多糖和黃酮具有多種生物活性功能，在食品、藥品、保健品方面具有極大地發展前景。本文主要對結合2種提取方法提取黑木耳多糖和黃酮的最佳工藝進行研究，探究出最佳的工藝提取條件，為黑木耳多糖和黃酮的提取條件提供了科學依據。

（1）通過單因素試驗結果可知，液料比、超聲時間和提取溫度這3個因素對黑木耳多糖和黃酮含量的影響較大。

圖4　料液比和超聲時間的交互作用對黑木耳黃酮含量的響應面與等高線

（2）由響應面試驗分析得出，提取的最佳工藝為液料比60∶1，超聲時間15 min，提取溫度70℃，多糖和黃酮含量分別為7.78，0.56 mg/g。

（3）在提取工藝條件為液料比60∶1，超聲時間15 min，提取溫度70℃下，得到驗證試驗結果，多糖和黃酮含量分別為7.72，0.51 mg/g。

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Process of Ultrasound-assisted Hot Water Extraction of Auricularia auricular Polysaccharides and Flavonoids

ZHANG Huanli，LI Fanshu，MA Hui，CUI Xiaotong，WANG Xia，LIU Di，ZHAI Huan，*XIAO Zhigang
（College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China）

China is rich in resources of Auricularia auricular，which contains polysaccharides，flavonoids and other active substances，is a nutrient rich edible fungus，but also has important medicinal value.The extraction of polysaccharide from Auricularia and flavone by ultrasonic assisted hydrothermal method.Respectively，extraction of polysaccharide and flavone content is determined by phenol-sulfuric acid method and AlCl3method.On the basis of single factor test results，central composite experiment of three levels of three factors in selecting the material liquid ratio，ultrasonic time and temperature of extraction，two regression equation and the establishment of polysaccharide and total flavonoids content.The optimal process conditions by response surface method and Auricularia auricula polysaccharide and flavone rate：the ratio of liquid to 60∶1，ultrasonic time of 15 min，extraction temperature is 70℃，the maximum total amount of extracted Auricularia auricula polysaccharides and flavonoids as 7.78，0.56 mg/g.

Auricularia auricula；polysaccharide；flavone；yield；response surface method

TS219

Adoi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.031

2016-07-23

遼寧省“百千萬人才工程”資助項目（2013921038）；沈陽市科技創新專項資金（F14-104-3-00）；遼寧省高等學校優秀科技人才支持計劃（第一層次）資助專項（LR2015062）。

張煥麗（1992— ），女，在讀碩士，研究方向為生物化工。

肖志剛（1972— ），男，博士，教授，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。