葡萄miR164家族生物信息學分析及靶基因預測

王麗麗，葛金濤，劉興滿，趙統利

(連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000)

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葡萄miR164家族生物信息學分析及靶基因預測

王麗麗，葛金濤，劉興滿，趙統利*

(連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000)

MicroRNAs(miRNAs)對植物抗逆及生長發育過程起著重要的調控作用，而miR164是植物特有的miRNA，它對應的靶基因主要是NAC轉錄因子家族。采用生物信息學方法對葡萄以及其他幾個物種的miR164家族成員前體進行進化分析、前體二級結構預測、成熟序列堿基保守性分析以及在葡萄NAC轉錄因子家族71個成員中進行靶基因預測分析。結果表明：葡萄miR164家族成員的前體序列與雙子葉植物聚在一個分支，符合進化規律；葡萄miR164家族4個成員前體序列均可形成穩定的二級莖環結構，成熟序列的堿基保守性較高；葡萄miR164家族成員對應的NAC家族靶基因有2個(GSVIVT01007982001與GSVIVT01020478001)，經在NCBI進行BLAST分析，發現均與植物的根發育相關。這暗示著葡萄miR164家族與其靶基因在植物的抗逆過程中發揮重要的調控作用。

葡萄；miR164；靶基因；抗逆；生物信息學

微小RNA(MicroRNAs)是一類非編碼小分子RNA，在植物中主要通過介導靶基因降解對調控生長發育及抗逆過程發揮作用[1]。近年來的研究表明，miRNAs在植物響應逆境脅迫過程中起著重要的作用[2]，如在毛竹(Phyllostachys edulis)中，miR397和miR1432的表達量均受不同脅迫條件的影響，如高溫(42℃)、低溫(4℃)、高鹽和干旱[3]；在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中過表達水稻(Oryza sativa)miR393會提高轉基因植株的耐鹽性[4]；同時在不同物種中，同樣的miRNA可能發揮不同的作用，如在擬南芥中過表達miR169時可降低植株的抗旱性，而相反，在番茄(Solanum lycopersicum)中過表達miR169會提高植株的抗旱性[5]。

葡萄(Vitis vinifera)是全球性果樹之一，具有較高的經濟效益，但目前其產量卻受到逆境脅迫的影響，因此提高葡萄抗逆性的研究越來越受到關注。目前對葡萄抗逆相關方面的研究僅僅集中在生理指標檢測及抗逆相關基因研究的層面上，而從非編碼基因miRNA方面對葡萄進行的抗逆方面研究還未見報道。

miR164家族是植物特有的miRNA家族，在葡萄中存在4個家族成員，分別為vvi-miR164a，vvi-miR164b，vvi-miR164c以及vvi-miR164d；miR164主要靶基因是植物NAC轉錄因子，而植物NAC轉錄因子家族也同樣是植物特有的，其在N端約有150個氨基酸組成高度保守的結構域(分為5個亞結構域A，B，C，D，E)[6]。NAC轉錄因子參與生物學過程較廣泛，包括細胞分裂、器官邊界、細胞次生壁合成等植物生長發育過程，同時也參與調控植物對鹽、干旱等非生物逆境脅迫的響應過程[7]。以葡萄為研究對象，通過對葡萄miR164家族成員前體序列、成熟序列及靶基因序列進行生物信息學分析，以期從非編碼基因方面為今后葡萄抗逆性研究提供新的參考。

1　材料與方法

1.1材料

利用數據庫miRbase 21.0(http://www.mirbase.org/index.shtml)[8]下載葡萄、番茄(Salynum lycopersicum)、蘋果(Malus domestic)、碧桃(Prunus persica)、煙草(Nicotiana tabacum)、水稻、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的miR164家族成員前體序列和成熟序列；通過北京大學植物轉錄因子數據庫(PlantTFDB∶http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)[9]下載葡萄NAC轉錄因子家族成員序列(71條)；利用美國生物信息技術中心(NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對目標基因進行BLAST初步分析。

1.2方法

利用在線工具RNAfold WebServer(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)預測miRNA的前體二級莖環結構；利用MEGA 6.0軟件構建基于葡萄、蘋果、碧桃、水稻、二穗短柄草等miR164家族成員前體序列系統進化樹；利用在線平臺WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)[10]分析各物種的miRNA成熟序列的堿基保守性；通過在線平臺http://plantgrn.noble.org/psRNATarget[11]預測葡萄miR164的靶基因及其作用位點。

2　結果與分析

2.1系統發生樹

建立基于葡萄、蘋果等物種miR164家族成員前體序列進化樹，結果表明，總體分為兩大分支(圖1)，葡萄miR164家族4個成員(圓形標記)均與雙子葉植物聚類在一起，如蘋果、碧桃、煙草和番茄，而單子葉植物單獨聚類在一起，如二穗短柄草和水稻，均符合植物的進化規律。但是同時也發現，葡萄vvi-MIR164a和vvi-MIR164d與蘋果mdm-MIR164c和碧桃ppe-MIR164b聚類在一個分支，而葡萄vvi-MIR164b與蘋果mdm-MIR164a和碧桃ppe-MIR164d聚類在一個分支，葡萄vvi-MIR164c則相對與葡萄其他3個miR164家族成員進化關系較遠。這種情況同時也出現于其他物種中，即來自同一物種家族不同成員被聚類于不同的分支，表明植物miRNA的前體序列具有比較豐富的多樣性。這與毛竹中miR397和miR1432前體序列進化分析結果相類似[3]。

2.2前體二級結構預測分析

圖1　基于前體序列構建的系統進化樹Fig.1　Phylogenetic tree based on the sequence of precursors

經前體二級結構預測分析，葡萄miR164家族4個成員前體序列均可形成穩定的二級莖環結構，且葡萄miR164家族4個成員成熟序列均產生于各自對應前體序列的5′端臂上(圖2)。

2.3成熟序列堿基保守性分析

在miR164的92個家族成員中，59個成員有著完全相同的成熟序列(5’-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3’，被認為是miR164家族標準成熟序列)，其他的成員和標準成熟序列相比，分別都有1～5個堿基的差異[12]。葡萄miR164家族有4個成員，經在線堿基保守型分析表明，葡萄與其他幾個物種的miR164家族成員成熟序列基本與標準序列堿基種類是一致的(圖3)，其中vvi-miR164a，vvi-miR164c和vvi-miR164d與家族標準序列堿基種類完全一致，只有vvi-miR164b僅在3′端最后一位堿基存在差異，即由A成為U。說明葡萄miR164家族成員成熟序列堿基保守性較高。

2.4靶基因預測分析

經靶基因在線預測，結果表明：葡萄miR164家族，4個成員在葡萄NAC基因庫中均有對應的靶基因存在，且對應的靶基因主要有2個，分別為GSVIVT01007982001和GSVIVT01020478001，與葡萄miR164家族成員成熟序列堿基幾乎完全匹配(圖4)；通過在NCBI中進行BLAST分析，結果發現GSVIVT01007982001預測蛋白與蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)中NAC轉錄因子蛋白相似性較高，研究表明其主要參與植物根瘤菌共生過程[13]；GSVIVT01020478001預測蛋白則與毛果楊(Populus trichocarpa)中NAC1蛋白相似性較高，而植物NAC1基因主要參與植物的側根生長發育過程，進而影響植物的抗逆性[14]。因此，可推斷出葡萄miR164家族成員與其靶基因家族成員可能主要在植物根發育過程中發揮重要的調控作用。

3　結論與討論

自從Carrington等[15]2002年首次在擬南芥中克隆到miRNA后，越來越多的研究發現，miRNA不僅參與植物的生長發育過程，在植物應對逆境脅迫，如干旱[15]，凍害[16]，高鹽[17]等的響應過程中，也發揮著重要的調控作用。miR164家族是植物特有的miRNA家族，其與對應靶基因之間的互作在植物器官形態建成以及響應逆境脅迫過程中起著關鍵的作用。

圖2　前體二級結構預測Fig.2　Secondary structure prediction of precursors

圖3　葡萄miR164家族成員成熟序列堿基保守性分析Fig.3　Conserved nucleotide sequence analysis of miR164 in Vitis vinifera

圖4　葡萄miR164家族成員與靶基因匹配序列Fig.4　Sequences matched with miR164 members in Vitis vinifera

本文主要利用生物信息學方法對葡萄miR164家族成員前體序列進行進化分析，并對其二級結構進行預測，同時對各個成員成熟序列的堿基保守性進行分析，并在相關數據庫71個NAC家族成員進行了靶基因預測，結果表明，葡萄miR164家族4個成員前體序列均可形成穩定的頸環結構，且其成熟序列基本均與miR164家族標準序列相一致，這與Sunkar等[18]在水稻中的研究結果相一致，即植物miR164家族成熟序列保守性很高；通過靶基因預測，結果表明葡萄miR164家族成員主要對應的靶基因有2個，分別為GSVIVT01007982001與GSVIVT01020478001，經蛋白序列預測功能后，發現二者均與植物根發育相關，同時也影響植物的抗旱性，這個預測結果與Li等[19]和Fang等[12]分別在玉米(Zea mays L.)和水稻中的研究結果相一致。

但是miRNA及其靶基因之間的調控是一個極為復雜的網絡，二者之間可能存在一對多或者多對一的調控作用關系，既體現出其參與生物學過程的廣泛性，同時又體現出二者相互作用的精確性。在擬南芥中過表達miR164a和miR164b時導致植株子葉和花器官出現融合等現象[20]。ORE1/NAC2基因有促進植物葉片衰老功能，其表達受到miR164的調控，同時miR164本身的表達又受EIN2基因表達的抑制，因此它們之間的相互作用關系形成了參與調控植物葉片衰老過程的重要調節網絡[21]。另外miR164可降低NAC1的表達量，導致植物側根數目減少，同時二者的表達又受到生長素的誘導，說明miR164和其靶基因也可能參與到植物激素信號途徑調控中[22]。目前，對葡萄miR164家族更深入的研究尚未見報道，如除NAC轉錄因子家族外，葡萄miR164家族成員是否還有其他家族的靶基因成員；葡萄miR164家族成員對其靶基因的切割作用位點是否具有保守性，即是否和其他物種miR164家族成員一樣，作用位點位于miR164成熟序列的10～11位堿基之間(5′→3′)；葡萄miR164家族成員組織特異性表達與其他物種相比是否存在差異等，這些問題仍有待進一步研究。本文首次初步對葡萄miR164家族成員進行了序列生物信息學分析以及對其靶基因進行預測，除上述問題需進一步研究外，仍需利用轉基因技術對miR164及其靶基因的功能與關系進行深入探討，以期為今后葡萄抗逆新品種選育提供新的途徑。

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(責任編輯張韻)

Bioinformatics analysis of the MiR164 family and prediction of target gene in Vitis vinifera

WANG Li-li，GE Jin-tao，LIU Xing-man，ZHAO Tong-li*

(Lianyungang Academy of Agricultural Sciences，Lianyungang 222000，China)

MicroRNAs (miRNAs) play a very important role in regulating the stress resistance and growth development.MiR164 is specific in plants，whose target gene is mainly NAC transcription factor family.By utilizing the bioinformatic methods，we analyzed the phylogenetic of miR164 in Vitis vinifera and some other plants，predicted and analyzed the secondary structure of miR164 family members，the base conservation of the mature sequence，as well as the target gene in NAC (71 members) family of Vitis vinifera.The results showed that four members of miR164 in Vitis vinifera were clustered with the dicotyledon plants，which was accorded with evolution law.The precursors of four members could form stable secondary stem-loop structure.Otherwise，the base of mature sequence of four members were highly conserved.According to predicting and analyzing of the target gene，we found two NAC members (GSVIVT01007982001 and GSVIVT01020478001).By BLAST in NCBI，it showed that they were related with plant root development，which indicated that miR164 family and their target gene in Vitis vinifera play important regulatory role in root development and stress resistance.

Vitis vinifera;miR164;target gene;stress resistance;bioinformatics

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):441-446http://www.zjnyxb.cn

王麗麗，葛金濤，劉興滿，等.葡萄miR164家族生物信息學分析及靶基因預測[J].浙江農業學報，2016，28(3)： 441-446.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.13

2015-08-17

蘇北科技發展計劃項目(BN2014101)

王麗麗(1988—)女，山西長治人，碩士，從事果樹及觀賞樹木育種研究。E-mail：wangllawj@163.com

，趙統利，E-mail：yyyy28@126.com

Q943.2

A

1004-1524(2016)03-0441-06