響應(yīng)面法優(yōu)化破囊壺菌油脂的超臨界CO2萃取工藝研究

吳海龍,崔　巖,成家楊

(北京大學(xué)深圳研究生院,廣東深圳 518055)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化破囊壺菌油脂的超臨界CO2萃取工藝研究

吳海龍,崔巖*,成家楊

(北京大學(xué)深圳研究生院,廣東深圳 518055)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對破囊壺菌Aurantiochytriumsp.油脂的超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的工藝條件為:萃取壓力30.3 MPa、萃取溫度64.4 ℃、CO2流速56 L/h、萃取時(shí)間2 h,在此條件下的油脂提取率達(dá)到了74.55%;油脂的主要成分為十六碳烷酸(C16∶0)和二十二碳六烯酸(C22∶6,DHA),含量分別為48.818%和35.120%。萃取出的破囊壺菌油脂成分簡單,DHA含量高,可作為保健品生產(chǎn)的重要來源。

破囊壺菌,超臨界CO2萃取,響應(yīng)面法,優(yōu)化設(shè)計(jì),油脂提取

破囊壺菌是一類異養(yǎng)的海洋真菌,在分類學(xué)上屬于不等毛門、網(wǎng)粘菌綱、破囊壺菌目、破囊壺菌科。破囊壺菌體內(nèi)含有大量油脂[1],其成分以DHA和十六碳烷酸為主[2],其它脂肪酸含量很少。DHA全稱二十二碳六烯酸,具有促進(jìn)嬰幼兒智力和視力發(fā)育、預(yù)防心腦血管疾病、抑制炎癥和改善視力等功效,在保健品和食品領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用[3]。目前,DHA主要來源于深海魚油,但隨著漁業(yè)資源的日漸枯竭和魚油品質(zhì)的下降,從魚油中獲取DHA將難以滿足社會(huì)需求[4],而破囊壺菌油脂則是DHA商業(yè)開發(fā)的潛在來源。

有機(jī)溶劑浸提法是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的油脂提取法,出油率高,動(dòng)力消耗小,缺點(diǎn)是油脂中會(huì)殘留有機(jī)溶劑,影響油脂品質(zhì)。超臨界CO2萃取法是一種新型高效的萃取技術(shù),萃取完成后溶劑與油脂自動(dòng)分離,免除了溶劑的蒸餾分離問題,后處理簡單[5]。目前,采用超臨界CO2從深海魚類[6-7]和微藻[8-9]中提取油脂已有諸多報(bào)道,但采用超臨界CO2萃取破囊壺菌油脂,國內(nèi)外罕見報(bào)道。

響應(yīng)面法是用多元二次回歸方程擬合考察因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析來尋求最佳條件,在食品工業(yè)得到了廣泛應(yīng)用[10]。本研究以油脂提取率為評價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇萃取壓力、萃取溫度和CO2流速為考察因素,利用響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取工藝,為破囊壺菌油脂的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

正己烷(色譜純)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨廣東環(huán)凱生物科技有限公司;酵母提取粉廣東環(huán)凱生物科技有限公司;葡萄糖(分析純)天津市福晨化學(xué)試劑廠;磷酸氫二鉀(分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠;天然海水深圳灣海域。

HZQ-300恒溫振蕩器及HWS12電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司;BioFlo310高溫滅菌臺式發(fā)酵及5810R臺式高速冷凍離心機(jī)德國艾本德公司;FreeZone 2.5凍干機(jī)美國Labconco公司;Agilent 7890-5975氣相色譜儀美國安捷倫科技有限公司;HA220-40-11超臨界二氧化碳萃取設(shè)備南通市華安超臨界萃取有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1破囊壺菌的培養(yǎng)與菌粉的制備本研究所用的破囊壺菌菌株為Aurantiochytriumsp. PKU#SW7,由北京大學(xué)深圳藻類新能源技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從深圳海域自主采集分離得到。

液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、蛋白胨1.5 g/L、酵母提取粉1 g/L、磷酸二氫鉀0.25 g/L,過濾后的天然海水。固體培養(yǎng)基需額外添加10 g/L的瓊脂。

首先從固體培養(yǎng)基中接種少量破囊壺菌至300 mL液體培養(yǎng)基中,活化培養(yǎng)2 d后接種到5 L發(fā)酵罐中,在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),4 d后收集菌液。取50 mL菌液于離心管中,4000 r/min離心5 min后收集菌體,置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥24 h。將干燥后的菌體加入研缽中,研磨至粉末狀態(tài),用于超臨界CO2萃取實(shí)驗(yàn)。

1.2.2油脂含量的測定稱取50 mg菌粉,加入2 mL 4%硫酸-甲醇溶液,振蕩30 s,80 ℃下水浴1 h。待溶液冷卻到室溫,各加入1 mL水和正己烷,混勻后離心[11]。取上層有機(jī)相,加入已稱重的干燥玻璃管中,氮?dú)獯蹈珊笤俅畏Q量玻璃管的重量,根據(jù)下式即可計(jì)算出油脂含量。

式中,C為油脂含量(%),W0為干燥的玻璃管重量(g),W1為加入油脂后的玻璃管重量(g),m為菌粉重量(g)。

1.2.3超臨界CO2萃取破囊壺菌油脂圖1為超臨界CO2萃取的工藝流程。首先,取20 g菌粉于萃取釜中,打開鋼瓶,CO2經(jīng)冷凝后,由高壓泵加壓至設(shè)定壓力,再經(jīng)過預(yù)熱器升至設(shè)定溫度,進(jìn)入萃取釜,不斷將菌粉中的油脂萃取出來,減壓后進(jìn)入分離器,油脂留在分離器中,CO2經(jīng)流量計(jì)排回鋼瓶。萃取結(jié)束后,打開分離器的閥門,收集萃取出的油脂并稱重,并按下式計(jì)算油脂提取率。

式中,E為油脂提取率(%),M1為分離器1中的油脂重量(g),M2為分離器2中的油脂重量(g),m為加入的菌粉量(g),C為油脂含量(%)。

圖1　超臨界CO2萃取工藝流程圖Fig.1　The flow chart of SC-CO2 extraction

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)考察萃取壓力、萃取溫度、CO2流速和萃取時(shí)間對油脂提取率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1　單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇萃取壓力、萃取溫度和CO2流速為考察因素,以油脂提取率為響應(yīng)值,采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件,利用響應(yīng)面法(RSM)中的Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD),對超臨界CO2萃取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6油脂成分分析稱取20 mg左右萃取出的油脂,加入1 mL 4%硫酸-甲醇溶液,混勻,80 ℃下水浴1 h后,各加入1 mL水和正己烷,混勻后離心。取上層有機(jī)相,用正己烷定容至20 mL,用于氣相色譜分析。

色譜條件:安捷倫DB-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),FID檢測器,進(jìn)樣口溫度280 ℃,檢測器溫度290 ℃,進(jìn)樣量1 μL,分流比10∶1。升溫程序:70 ℃保持2 min,以10 ℃/min速率升溫至230 ℃,再以3 ℃/min速率升溫至290 ℃,保持5 min。氫氣流量30 mL/min,空氣流量400 mL/min。對比標(biāo)準(zhǔn)樣品并計(jì)算峰面積,從而確定油脂中各組分的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1超臨界CO2萃取的單因素實(shí)驗(yàn)

在萃取溫度50 ℃、CO2流速50 L/h、萃取時(shí)間2 h的條件下,考察萃取壓力對油脂提取率的影響。由圖2a可知,隨著萃取壓力的增大,油脂提取率不斷提高,但當(dāng)萃取壓力增加到45 MPa 時(shí),油脂提取率基本保持不變。萃取壓力的增加,減少了分子間的傳質(zhì)距離,提高了傳質(zhì)效率,有利于原料的萃取;但菌粉中的油脂含量有限,繼續(xù)增加壓力提取率基本不變,而且會(huì)增大對設(shè)備的損耗,增加操作和維護(hù)費(fèi)用。因此,適宜的萃取壓力為35 MPa。

圖2　不同萃取壓力(a)、萃取溫度(b)、CO2流速(c)、萃取時(shí)間(d)下的油脂提取率Fig.2　Oil extraction rate on different extraction pressure,temperature,CO2 flow rate and time

在萃取壓力35 MPa、CO2流速50 L/h、萃取時(shí)間2 h的條件下,考察萃取溫度對油脂提取率的影響。由圖2b可知,隨著萃取溫度的升高,油脂提取率不斷提高。這是因?yàn)殡S著萃取溫度的升高,物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)不斷增大,有利于油脂萃取。因此,適宜的萃取溫度為60 ℃。

在萃取壓力35 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間2 h的條件下,考察CO2流速對油脂提取率的影響。由圖2c可知,隨著CO2流速的增大,油脂提取率先增大后減小。CO2流速對萃取過程同時(shí)存在著兩方面的影響。一方面,流速的增加使單位時(shí)間里CO2對菌粉的萃取次數(shù)增加,提高了傳質(zhì)速率[12];另一方面,當(dāng)CO2流速較大時(shí),溶質(zhì)與超臨界流體來不及充分作用即到達(dá)分離釜中,使得萃取率下降。因此,適宜的CO2流速為50 L/h。

在萃取壓力35 MPa、萃取溫度60 ℃、CO2流速50 L/h的條件下,考察萃取時(shí)間對油脂提取率的影響。由圖2d可知,當(dāng)萃取時(shí)間在2 h以內(nèi),隨著時(shí)間的增加,油脂提取率不斷提高;但當(dāng)時(shí)間超過2 h后,油脂提取率曲線接近水平。因此,適宜的萃取時(shí)間為2 h。

2.2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面分析

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果基于單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,可以看出萃取壓力、萃取溫度和CO2流速是對油脂提取率影響較大的因素。因此響應(yīng)面分析選定的考察因素為萃取壓力(X1)、萃取溫度(X2)和CO2流速(X3),萃取時(shí)間設(shè)定為2 h,每個(gè)考察因素取3個(gè)水平(-1、0、+1),以油脂提取率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)因素與水平見表2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2　BBD設(shè)計(jì)因素水平表

表3　BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2模型的建立與顯著性檢驗(yàn)表3中,實(shí)驗(yàn)號1-12是析因?qū)嶒?yàn),實(shí)驗(yàn)號13-15是中心實(shí)驗(yàn),用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。采用Design-Expert軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到了萃取壓力、萃取溫度和CO2流速對油脂提取率的二次多項(xiàng)回歸方程模型:

Y=-301.93875+1.30075X1+7.76025X2+3.76675X3+0.0756X1X2-0.01555X1X3-0.00625X2X3-0.0873X12-0.0753X22-0.02575X32

對該回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表4。

表4　方差分析結(jié)果

2.2.3三維效應(yīng)面分析三因素兩兩交互作用對油脂提取率的響應(yīng)面和等高線見圖3。圖3中,左圖為響應(yīng)面三維圖,右圖為等高線圖。右圖中，等高線上的數(shù)字表示響應(yīng)值的大小，左圖中，響應(yīng)值變化越快，響應(yīng)面的坡度越大。對于固定的萃取溫度或者固定的CO2流速,萃取壓力的升高會(huì)導(dǎo)致提取率的降低;對于固定的萃取壓力或者固定的CO2流速,萃取溫度的升高有助于油脂的提取;而對于固定的萃取壓力或者固定的萃取溫度,存在著一個(gè)最優(yōu)的CO2流速值,過高或過低的流速都會(huì)降低油脂提取率。

為了確定最佳相應(yīng)值的因素水平組合,對回歸方程求一階偏導(dǎo),并令其為0,整理得到方程組,解得:X1=30.34 MPa,X2=64.42 ℃,X3=56.16 L/h。將結(jié)果代入回歸方程,解得:Y=73.57%?？紤]到實(shí)際操作性,將破囊壺菌油脂的最佳萃取條件修正為:萃取壓力30.3 MPa,萃取溫度64.4 ℃,CO2流速56 L/h,萃取時(shí)間2 h。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠性,在最優(yōu)條件下(萃取壓力30.3 MPa,萃取溫度64.4 ℃,CO2流速56 L/h,萃取時(shí)間2 h)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),油脂提取率的平均值為74.55%,與73.57%的預(yù)測值接近,說明該模型可靠。

2.4油脂成分分析

對在最優(yōu)條件下萃取得到的油脂進(jìn)行成分分析,結(jié)果見表5。

由表5可知,油脂中共檢測出9種脂肪酸,碳分子數(shù)在12～22之間,雙鍵數(shù)目在0～6之間,有6種飽和脂肪酸,1種單不飽和脂肪酸和2種多不飽和脂肪酸,油脂組成較為簡單。油脂的主要成分為十六碳烷酸和DHA,其中DHA的含量為35.12%。

表5　超臨界CO2萃取出的油脂成分

圖3　三因素兩兩交互作用對油脂提取率的響應(yīng)面和等高線Fig.3　Response surface and contour showing the interactive effects of three conditions on oil extraction rate

3　結(jié)論

通過響應(yīng)面法得到的二次多項(xiàng)回歸方程模型,方差分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均表明該模型可靠,能較好地解釋油脂提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。優(yōu)化得到的最佳萃取條件為:萃取壓力30.3 MPa、萃取溫度64.4 ℃、CO2流速56 L/h、萃取時(shí)間2 h,在此條件下的油脂提取率達(dá)到了74.55%。對在最佳條件下萃取出的油脂進(jìn)行成分分析,結(jié)果表明油脂的主要成分為十六碳烷酸和DHA,其中DHA的含量為35.12%,遠(yuǎn)高于魚油中12%左右的DHA含量[],可作為保健品生產(chǎn)的重要來源。

[1]李晶晶,劉瑛,成家楊,等. 深圳海域6株破囊壺菌的生長特性及油脂成分分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2015,42(1):17-23.

[2]李晶晶,劉瑛,馬炯. 破囊壺菌生產(chǎn)DHA的應(yīng)用前景[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(16):367-371.

[3]黃菊華,李蘊(yùn)成. DHA的功能及在食品添加中的應(yīng)用研究[J]. 中國食物與營養(yǎng),2014,20(4):76-79.

[4]吳海龍,崔巖,成家楊. 破囊壺菌二十二碳六烯酸的制備工藝及應(yīng)用前景[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(2):259-264.

[5]湯鵬,段海霞,夏金梅,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取鮑魚內(nèi)臟油脂及其脂肪酸種類測定[J]. 食品科學(xué),2015,36(12):153-159.

[6]Lopes BLF,Sanchez-Camargo AP,Ferreira ALK,et al. Selectivity of supercritical carbon dioxide in the fractionation of fish oil with a lower content of EPA plus DHA[J]. Journal of Supercritical Fluids,2012,61(51):78-85.

[7]Maschietti M,Pedacchia A,Maschietti M,et al. Supercritical carbon dioxide separation of fish oil ethyl esters by means of a continuous countercurrent process with an internal reflux[J]. Journal of Supercritical Fluids,2014,86(1):76-84.

[8]Mouahid A,Crampon C,Toudji SAA,et al. Supercritical CO2

extraction of neutral lipids from microalgae:Experiments and modelling[J]. Journal of Supercritical Fluids,2013,77(77):7-16.

[9]Couto R M,Simoes P C,Reis A,et al. Supercritical fluid extraction of lipids from the heterotrophic microalga Crypthecodinium cohnii[J]. Engineering in Life Sciences,2010,10(2):158-164.

[10]楊文雄,高彥祥. 響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國食品添加劑,2005(2):68-71.

[11]Kamlangdee N,Fan K W. Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp. isolated from mangrove[J]. Songklanakarin Journal of Science & Technology,2003(25):643-650.

[12]秦昌蓉. 富油微藻中油脂的提取及DHA富集純化的研究[D]. 天津：天津大學(xué),2010.

[13]溫雪馨,李建平,侯文偉,等. 微藻DHA的營養(yǎng)保健功能及在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué),2010(21):446-450.

Optimization of supercritical CO2extraction of oil from thraustochytrids by response surface methodology

WU Hai-long,CUI Yan*,CHENG Jay

(Peking University Shenzhen Graduate School,Shenzhen 518055,China)

Based on the single factor experiments,the response surface methodology(RSM)was employed to optimize the conditions of supercritical CO2extraction of oils fromAurantiochytriumsp.. The optimum condition were as follow:extraction pressure of 30.3 MPa,temperature of 64.4 ℃,CO2flow rate of 56 L/h and extraction time of 2 h,under which the oil extraction rate was 74.55%. The main components of oils were palmitic acid and DHA,which were 48.818% and 35.120% of the total fatty acids,respectively. The extracted oils ofAurantiochytriumsp. had simple composition and high DHA content,which can be used as potential resources for health products.

thraustochytrids;supercritical CO2extraction;response surface methodology;optimal design;oil extraction

2016-03-14

吳海龍(1994-)，男，碩士研究生，研究方向：DHA的分離純化，E-mail:wuhl2013@163.com。

崔巖(1984-)，女，博士，助理研究員，研究方向：微藻生物質(zhì)油的提取，E-mail:cuiyan@pkusz.edu.cn。

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201305022)；深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(JCYJ20150806112221114)；深圳市未來產(chǎn)業(yè)專項(xiàng)資金(JCYJ20150626110855791)。

TS224.4

B

1002-0306(2016)17-0232-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.037