腎炎康血清干預嘌呤霉素氨基核苷誘導足細胞損傷研究

向少偉，辛立紅，黃國東，賀西南，黃海燕，龍　韻

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腎內科，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001）

論 著

腎炎康血清干預嘌呤霉素氨基核苷誘導足細胞損傷研究

向少偉1，辛立紅2，黃國東1，賀西南1，黃海燕1，龍韻1

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腎內科，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001）

目的：探討復方腎炎康對嘌呤霉素氨基核苷誘導足細胞損傷的保護作用。方法：原代培養大鼠足細胞，隨機分為正常組，對照組，腎炎康低、中、高劑量組，厄貝沙坦組除正常組外，其余各組分別予以嘌呤霉素氨基核苷，正常組加正常大鼠血清，腎炎康低、中、高劑量組分別加腎炎康低、中、高劑量，厄貝沙坦組加厄貝沙坦，均干預48h。用原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡，實時定量PCR方法檢測P53、Caspase 3 mRNA，western印跡檢測細胞中P53、Caspase 3蛋白變化。結果：嘌呤霉素氨基核苷作用下的各組足細胞凋亡率、P53、Caspase 3mRNA及蛋白表達均顯著高于正常組（P＜0.05，P＜0.01），藥物干預的各組足細胞凋亡率、P53、Caspase 3 mRNA及蛋白表達均顯著低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），腎炎康高劑量組足細胞凋亡率、P53、Caspase 3 mRNA及蛋白表達與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：中藥復方腎炎康能抑制嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞凋亡，其機制可能與抑制P53、Caspase 3表達有關。

足細胞；凋亡；腎炎康；嘌呤霉素氨基核苷

足細胞是高度分化的細胞，是腎臟濾過屏障的關鍵元素，足細胞的損失在腎小球硬化和進行性蛋白尿腎臟疾病的發病機制中起著重要作用［1］。嘌呤霉素氨基核苷能誘導腎病綜合征模型［2］，對足細胞具有顯著致凋亡作用［3］。我們利用嘌呤氨基核苷誘導足細胞凋亡的體外損傷模型，觀察腎炎康血清對足細胞損傷的保護作用及其機制，總結如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

6周齡SPF/VAF級雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供（合格證號SCXK桂 2003-0003）。

1.2主要試劑

TRIzol Reagent（美國Invitrogen），RNA的逆轉錄試劑盒逆轉錄、SYBR Green mix（日本TOYOBO），TUNEL檢測試劑盒（美國Promega），DMEM培養基（美國Gibco），兔抗大鼠P53抗體、Caspase 3抗體、大鼠多克隆β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（美國Sigma），ECL試劑盒（美國Santa Cruz）。

1.3實驗方法

大鼠足細胞原代培養與鑒定［4］。無菌取腎后，通過差異過篩法迅速分離腎皮質，收集200目篩網上腎小球進行接種，37℃、5% CO2恒溫恒濕培養7、8天后消化，消化后產物通過200目篩網過濾，收集細胞傳代培養7d，采用倒置相差顯微鏡觀察足細胞形態及免疫熒光染色進行鑒定，流式細胞儀分析細胞純度。

含藥血清的制備。中藥復方腎炎康由八仙草、田七、薏苡仁、鹿含草按3∶1∶2∶2比例組成。以蒸餾水煎煮3次，過濾、濃縮至含生藥2.5g/mL，高壓滅菌，置于4℃冰箱保存待用。將48只SD大鼠隨機分為正常組、對照組、腎炎康低、中、高劑量組和厄貝沙坦組，每組8只。正常組予以蒸餾水3mL灌胃，每日2次；其余各組分別予以氨基核苷嘌呤霉素5mg/100g（溶于蒸餾水3mL）、腎炎康成人臨床用藥劑量5倍（13.5g/kg）、10倍（27g/kg）、20倍（54g/kg）及厄貝沙坦片成人臨床用藥劑量10倍（25mg/kg），灌胃（均蒸餾水稀釋至3mL），每日2次，連續7天。末次灌胃2h后股動脈取血，離心取血清，56℃水浴30min滅活補體，無菌針孔濾器（0.22μm）過濾除菌，分別制成正常大鼠血清、氨基核苷嘌呤霉素血清、腎炎康低、中、高劑量血清和厄貝沙坦血清，分裝置入-20℃凍存。

足細胞的分組及處理。等量足細胞接種和生長，細胞用PBS洗滌2次，在含1%FCS培養24h。實驗分為6組：①正常組：正常大鼠血清；②對照組：氨基核苷嘌呤霉素血清加正常大鼠血清；③腎炎康低劑量組：氨基核苷嘌呤霉素血清加腎炎康低劑量血清；④腎炎康中劑量組：氨基核苷嘌呤霉素血清加腎炎康中劑量血清；⑤腎炎康高劑量組：氨基核苷嘌呤霉素血清、腎炎康高劑量血清；⑥厄貝沙坦組：氨基核苷嘌呤霉素血清加厄貝沙坦血清。每組設平行孔8孔，培養干預48h。

原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡：用TUNEL檢測試劑盒檢測進入凋亡晚期的足細胞。操作步驟按說明書進行，熒光顯微鏡下細胞核綠色的為凋亡細胞。每張切片隨機選取5個視野（×400），計算凋亡指數（Apoptosis index，AI）：AI=凋亡細胞數/總細胞數。

實時定量PCR方法檢測P53、Caspase 3 mRNA水平。Trizol法提取細胞總RNA，在逆轉錄酶作用下合成cDNA后進行RT-PCR反應。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列，見表1。反應條件為94℃2min預變性，94℃30s、56℃30s、72℃30s，35個循環，最后72℃7min延伸。繪制動力學曲線，讀取Ct值，以GAPDH為內參照，用2-△△Ct法計算目的基因表達量。目的基因量=2-△△Ct，△△Ct=實驗組（Ct目的基因-Ct內參基因）-正常組（Ct目的基因-Ct內參基因）。見表1。

表1　P53、Caspase 3、GAPDH引物序列Table1 Primer sequence of P53，Caspase 3 and GAPDH

western印跡檢測P53、Caspase 3蛋白表達。收集細胞，加入RIPA裂解緩沖液，置冰上30min，離心后取上清，Bradford法測定蛋白濃度。每樣品取30μg總蛋白，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至尼龍膜，經脫脂奶粉封閉1h，加入一抗，4℃孵育過夜，洗去一抗后，再加入相應辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h。洗膜，ECL化學發光法膠片曝光并成像。用圖像分析軟件（UVI tec，英國）對X線片上雜交條帶進行半定量分析，目的蛋白條帶與β-actin條帶的積分吸光度比值為最終結果。

2　結果

各組細胞凋亡率比較見表2。與正常組比較，嘌呤氨基核苷作用下各組足細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與對照組比較，藥物干預后的各組足細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，腎炎康中、高劑量組足細胞凋亡率無統計學意義（P＞0.05）。

表2　各組足細胞凋亡率比較 （%，）

表2　各組足細胞凋亡率比較 （%，）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，##P＜0.01。

組別n凋亡率正常組84.28±1.33對照組817.36±3.45**腎炎康低劑量組814.02±2.64**△##腎炎康中劑量組812.03±2.32**△△腎炎康高劑量組88.86±2.32**△△厄貝沙坦組89.32±2.87**△△

各組足細胞P53 mRNA及蛋白的表達比較見表3。與正常組比較，嘌呤氨基核苷作用下的各組足細胞P53 mRNA及蛋白的表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與對照組比較，藥物干預后的各組足細胞P53 mRNA及蛋白的表達顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，腎炎康高劑量組足細胞P53 mRNA及蛋白的表達無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組足細胞P53 mRNA及蛋白表達比較 （）

表3　各組足細胞P53 mRNA及蛋白表達比較 （）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別nP53/ GAPDHP53/β-actin正常組81.000±0.0000.121±0.022對照組81.766±0.274**1.117±0.075**腎炎康低劑量組81.475±0.251**△##0.902±0.057**△△##腎炎康中劑量組81.401±0.227**△#0.741±0.062**△△##腎炎康高劑量組81.162±0.201*△△0.483±0.053**△△厄貝沙坦組81.143±0.182*△△0.506±0.057**△△

各組足細胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達比較見表4。與正常組比較，嘌呤氨基核苷作用下的各組足細胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與對照組比較，藥物干預后的各組足細胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與厄貝沙坦組比較，腎炎康高劑量組足細胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表達無統計學意義（P＞0.05）。

表4　各組足細胞Caspase 3mRNA及蛋白表達比較（）

表4　各組足細胞Caspase 3mRNA及蛋白表達比較（）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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3　討論

研究表明足細胞減少20%以下就出現系膜擴張、一過性蛋白尿；減少21%～40%，出現球囊粘連和局灶節段腎小球硬化，輕度持續性蛋白尿，腎功能正常；減少大于40%，出現節段性到全球性腎小球硬化，持續性大量蛋白尿，腎功能減退［5］。越來越多的證據表明，足細胞凋亡是足細胞數量下降的主要原因，并導致蛋白尿和腎小球損傷。人類p53基因是一種功能強大的抑癌基因，對細胞周期和細胞凋亡起著關鍵性調控作用，p53可以通過上調Bax的表達水平和下調Bcl-2的表達而促進細胞凋亡作用。高糖、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）等誘導的足細胞凋亡均與P53活化有關［6-8］。半胱天科氨酸蛋白酶家族（Caspase）是一類與凋亡密切相關的蛋白水解酶家族，負責選擇性地切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡。其中Caspase 3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。研究表明，AngⅡ使體外培養小鼠足細胞Caspase-3活性增加，從而誘導足細胞凋亡［9］。而AT1受體阻斷劑能抑制糖尿病腎病模型大鼠腎臟TGF-β1表達，進而使細胞凋亡相關蛋白Bax和Caspase-3的表達減少，從而減少足細胞凋亡［10］。我們的研究表明，嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞凋亡，也與p53及Caspase-3活化有關，這與既往的研究一致［11-12］。

慢性腎臟病主要表現為水腫、蛋白尿、血尿等，反復發作，纏綿難愈，屬中醫“水腫”、“虛勞”等范疇。中醫認為本病除脾腎虧虛之外，濕熱病邪是關鍵。或因濕邪久戀，郁而化熱；或因素體陰虛內熱，熱與濕合；或感染熱毒，與濕相合；或因藥邪（激素、抗生素等）所傷，助濕化熱。故有“腎炎濕熱論”之說［13］。而濕熱之邪易與瘀合，如濕邪久蘊，阻滯氣機、閉滯脈絡而成瘀；或濕熱煎液成瘀；或久病氣虛，血行不暢而成瘀。腎炎康湯主要含八仙草、三七、薏苡仁、鹿含草等。方中八仙草清濕熱、散瘀、消腫、解毒、利尿；三七有散瘀止血、消腫止痛、補血活血等功效；薏苡仁健脾利水滲濕；佐以鹿含草補虛益腎。全方以清熱利濕，活血化瘀為主，祛邪而不傷正，扶正而不留邪。本研究結果顯示，腎炎康含藥血清能顯著降低嘌呤氨基核苷誘導的大鼠足細胞凋亡率，抑制P53及Caspase 3合成，其高劑量組效果與厄貝沙坦相當。據此我們推測，中藥復方腎炎康可能通過抑制P53及Caspase 3的表達，減少足細胞的凋亡，從而起到減輕腎損害的作用。

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Objective：To investigate the protective effect of Compound ShenYanKang Granules，a Chinese herbal recipe mainly composed of Galium aparine，Panax notoginseng，Coicis Semen，Herba Pyrolae，on the podocyte injury induced by Puromycin amino nucleside. Method：The primary-cultured podocytes of rats were randomly divided into normal group，control group，low-dose，middle-dose， high-dose groups of ShenYanKang and irbesartan group. The podocytes in the normal group were given normal rat serum alone while that of the other groups were all given serum containing Puromycin amino nucleoside，and additionally，ShenYanKang groups and irbesartan group were given serum containing low-dose，middle-dose and highdose ShenYanKang and irbesartan respectively for 48 hours. The apoptosis of podocyte was determined by TUNEL assay. P53 and Caspase-3 mRNA were observed by real-time PCR. Expression of p53 and Caspase-3 protein were examined by Western blot. Result：The apoptosis rate of podocytes，P53 and Caspase 3 mRNA expression level in Puromycin amino nucleoside control group were significantly higher than that in the normal group（P＜0.05 or P＜0.01），and were decreased in the medication groups（P＜0.05 or P＜0.01 compared with that in Puromycin amino nucleoside control group）.The apoptosis rate of podocytes，P53 and Caspase 3 expression level in high-dose ShenYanKang group was not significantly different from that in irbesartan group（P＞0.05）.Conclusion： Compound ShenYanKang could inhibit the podocyte apoptosis induced by Puromycin amino nucleoside and its mechanism may be related to the inhibition of P53 and Caspase 3 expression.

Podocyte；Apoptosis；ShenYanKang；Puromycin amino nucleoside

R255.689.7

B

1004-2814（2016）02-0102-03

2015-10-13

廣西壯族自治區教育廳項目（編號：200810LX078）