Wortmannin對糖尿病大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9表達的影響

梁英杰,周德鵬,曹東華

(1.遼河油田總醫院 檢驗科,遼寧 盤錦124010;2.中國人民解放軍第二○二醫院 檢驗科,遼寧 沈陽110003)

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Wortmannin對糖尿病大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9表達的影響

梁英杰1,周德鵬1,曹東華2

(1.遼河油田總醫院 檢驗科,遼寧 盤錦124010;2.中國人民解放軍第二○二醫院 檢驗科,遼寧 沈陽110003)

目的研究Wortmannin對糖尿病大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9表達的影響。方法60只大鼠隨機分為對照組(20)、糖尿病組(20) 和Wortmannin處理組(20)，通過高糖、高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。糖尿病模型建立后，檢測血糖、血脂及體重的改變；采用免疫組織化學方法和Western blot方法檢測各組大鼠肺組織中Caspase-3與Caspase-9表達的變化情況。結果與對照組比較，糖尿病模型組大鼠血糖、血脂值明顯增高，P<0.01；與糖尿病模型組比較，Wortmannin處理組大鼠血糖、血脂值明顯降低，P<0.01。免疫組織化學和Western blot 結果顯示，糖尿病模型組大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9的表達量均顯著高于對照組，P<0.01；而與糖尿病模型組比較，Wortmannin處理組大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9的表達量均顯著降低。結論PI3K/Akt信號通路可能通過調節Caspase-3與Caspase-9的表達參與糖尿病肺組織病變的發生發展。

糖尿病；肺；磷脂酰肌醇3激酶；Caspase-3；Caspase-9；大鼠

(ChinJLabDiagn,2016,20:1428)

隨著社會的進步,人們生活水平的提高以及生活方式的改變，2型糖尿病的發病率快速增高,正嚴重地危害著人類的健康。2型糖尿病是一種嚴重的慢性疾病，其病因及機制非常復雜。糖尿病對人類的危害不僅是機體內環境中血糖濃度的升高，更重要的是對機體各個臟器的損害，引發諸多并發癥，包括感染、視網膜病變、心腦血管硬化、神經傳導延緩以及腎臟功能改變[1-3]。糖尿病肺病(Diabetes lung disease，DLD) 是糖尿病的并發癥之一，是導致糖尿病晚期死亡的一個重要原因[4]。因此，延緩糖尿病肺病的病理進程，對改善預后、降低死亡率有重要的臨床意義。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，檢測PI3K/Akt信號通路被阻斷后，DM大鼠肺組織中Caspase-3與Caspase-9表達的變化情況，探討糖尿病肺損傷的可能發生機制。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

羊抗大鼠Caspase-3和 Caspase-9多克隆抗體(Santa-Cruz)，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，血糖試劑盒(上海復旦張江生物醫藥股份有限公司)，Sure Step Plus血糖檢測儀(美國強生公司)。全自動血液生化分析儀(意大利愛康公司)，凝膠成相系統(Gel DocTM，美國Bio-Rad 公司)。

1.2動物分組及模型的建立

60只健康雄性SD 大鼠，購自中國醫科大學實驗動物中心，250-300 g，隨機分為對照組(20)使用普通飼料喂養，糖尿病組(20)和Wortmannin處理組(20)高脂飼料喂養76 d后，空腹12 h后，糖尿病組腹腔注射STZ(30 mg/kg)，對照組注射枸櫞酸緩沖液。72 h后尾靜脈取血測定血糖，將血糖濃度≥10.0 mmol/L大鼠定為糖尿病造模成功，糖尿病模型建立后,每周監測血糖1次,不符合標準者棄去。糖尿病模型建立次日起，Wortmannin處理組靜脈注射Wortmannin(0.5 mg/kg),1次/周,共12 W，第12周禁食12-14 h測定血糖后,麻醉處死大鼠，取材。

1.3血糖血脂測定

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，采集血樣，利用SureStep Plus 血糖檢測儀測定血糖，全自動血液生化分析儀測定血脂。

1.4免疫組織化學方法測定Caspase-3和Caspase-9表達

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，麻醉處死大鼠，開胸，剪開右心耳，生理鹽水沖洗，然后多聚甲醛灌流固定，取肺組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再移入30%蔗糖溶液中脫水至沉底，石蠟包埋，常規切片，按照SP試劑盒說明測定Caspase-3和 Caspase-9表達。

1.5Western blot方法檢測Caspase-3和Caspase-9表達

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，麻醉處死大鼠，冰上開胸，取肺組織，超聲粉碎，離心取上清，以BCA法測定樣品蛋白含量，計算上樣量，樣品經沸水浴變性后，上樣，電泳分離，轉印，雜交，暗室內ECL發光，X光片顯影、定影，凝膠圖像分析儀采集分析圖像光密度值。

1.6統計分析

2　結果

2.1大鼠的一般情況及血糖、血脂測定結果

糖尿病組大鼠在注射STZ后，呈明顯多飲、多食、多尿癥狀，明顯消瘦，并伴不同程度精神萎靡，毛豎而無光澤；而對照組大鼠精神狀況良好，體重明顯增加，毛皮有光澤。正常對照組大鼠空腹血糖濃度為(5.06±0.92) mmol/L，顯著低于糖尿病組大鼠(18.17±4.98) mmol/L，P<0.01，與糖尿病組大鼠相比，Wortmannin處理組大鼠空腹血糖濃度(10.21±2.57) mmol/L顯著降低，P<0.01。正常對照組大鼠血脂濃度為(1.52±0.27) mmol/L，顯著低于糖尿病組大鼠(2.37±0.36) mmol/L，P<0.01；與糖尿病組大鼠相比，Wortmannin處理組大鼠空腹血脂濃度(1.91±0.27) mmol/L顯著降低，P<0.01。

2.2免疫組織化學方法測定Caspase-3和Caspase-9表達結果

對免疫組化結果進行圖像分析，結果發現，對照組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3和Caspase-9僅有微量表達，顯著低于糖尿病組與Wortmannin處理組，P<0.01；而與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的表達顯著降低，P<0.01，見圖1，表1。

2.3Western blot方法測定Caspase-3和 Caspase-9表達結果

對免疫組化結果進行圖像分析，結果發現，與對照組比較，糖尿病組與Wortmannin處理組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3與Caspase-9蛋白的表達量均顯著升高，P<0.01；而與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3和 Caspase-9的表達顯著降低，P<0.01，見圖2，表2。

A:對照組; B:糖尿病組; C:Wortmannin處理組圖1　免疫組化法檢測Caspase-3 和Caspase-9表達表1　Caspase-3 和 Caspase-9平均光密度值 (MOD)比較

nCaspase-3Caspase-9對照組100.18±0.030.19±0.03糖尿病組100.52±0.15*0.43±0.11*Wortmannin處理組100.31±0.090.27±0.09

*與對照組或Wortmannin處理組比較,P<0.01

A:對照組;B:糖尿病組;C:Wortmannin處理組圖2　Western blot方法測定Caspase-3和 Caspase-9表達表2　Caspase-3 和 Caspase-9平均光密度 值(MOD)比較

nCaspase-3Caspase-9對照組100.33±0.060.24±0.04糖尿病組100.85±0.16*0.51±0.13*Wortmannin處理組100.55±0.120.36±0.11

*與對照組或 Wortmannin 處理組比較,P<0.01

3　討論

糖尿病(DM)是一種危害人類健康的慢性疾病，其發病機制復雜，并且對心、腦、腎有顯著的影響。研究發現，肺臟也是DM 損傷靶器官之一，DM本身可導致肺臟損害，可發展為慢性肺功能障礙，可以出現限制性通氣功能障礙和彌散、阻塞性及混合性通氣功能障礙，損傷機制可能與高糖誘導氧化應激損傷、炎癥反應、PKC 信號傳導通路增強等有關[5,6]，但是其具體的發病機制尚不清楚。

細胞凋亡(apoptosis)是指生物體內絕大多數細胞在一定發育階段由基因控制的、自主的、有序的死亡過程，它對于自身穩定的維持、組織的進化、器官的發育等起著重要的作用。細胞凋亡機制主要有外源性和內源性途徑兩種，外源性途徑需要先形成凋亡誘導信號復合體(DISC)，然后最終激活Caspase-3，引起細胞凋亡；內源性途徑也需要先形成凋亡活化復合體，然后激活Caspase-9 及下游的Caspase-3，最終導致細胞凋亡[7-9]。研究發現，2 型糖尿病大鼠肺組織中Caspase-3和Caspase-9表達增高，羅格列酮可通過調節肺組織中Caspase-3和Caspase-9的表達抑制肺組織細胞凋亡，延緩糖尿病肺病變的進展[10]。本研究發現，與對照組比較，糖尿病組大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9蛋白的表達顯著升高，P<0.01，這與先前的研究一致，結果提示，Caspase-3與Caspase-9很可能在糖尿病肺部損害中發揮作用。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)通路是真核細胞關鍵的信號轉導通路，在細胞凋亡、代謝、增殖及分化等生命活動中發揮著重要功能,研究發現，糖尿病腎病大鼠模型的腎皮質中PI3K及Akt活性升高[11]，大鼠糖尿病發病4周后整個腎臟的磷酸化PKB/Akt水平增加，并且體內由Gas6腎臟因子介導的腎小球肥大與PI3K/Akt信號通路有關[12]。本研究組前期研究已經證明，糖尿病模型組大鼠肺組織PI3K、Akt和p-Akt的表達量均顯著高于對照組，PI3K/Akt信號通路可能參與了糖尿病肺組織病變的發生發展，但是其具體的作用機制尚不清楚，其是否能夠調節炎癥因子Caspase-3和Caspase-9的表達都需進一步研究。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，在注射PI3K抑制劑Wortmannin阻斷PI3K/Akt信號通路后，采用免疫組織化學和Western 方法檢測DM大鼠肺組織中Caspase-3與Caspase-9表達的變化情況，結果發現，與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠肺組織炎性因子Caspase-3和Caspase-9的表達顯著降低，P<0.01，結果提示，Caspase-3與Caspase-9可能參與了PI3K/Akt信號通路介導的糖尿病肺組織病變的病理機制。血糖、血脂測定結果發現，與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠血糖、血脂濃度顯著降低，P<0.01，說明阻斷PI3K/Akt信號通路后，能夠改善血糖、血脂狀況。本實驗結果的發現有利于闡明PI3K/Akt信號通路參與糖尿病肺損傷的作用機制，能夠為糖尿病肺損傷的藥物治療提供一定參考依據。

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The effect of Wortmanninon on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in in lung tissue of diabetic rats

LIANGYing-jie,ZHOUDe-peng,CAODong-hua.

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theGenerarHospitalofLiaoheOilfield,Panjin124010,China)

ObjectiveTo study the effect of Wortmanninon on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in lung tissue of diabetic rats.Methods60 rats were divided into control group(20) diabetes mellitus group(20),and Wortmannin treatment group(20).The diabetic rat models were established by giving high glucose,highfat diet combined with peritoneal injection with low-dose streptozotocin(STZ).The changes of blood glucose,blood lipids and body weight were measured after the establishment of the model of diabetes,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were observed by immunohistochemical method and western blot method in lungs of rats in all groups.ResultsCompared with the control group,serum glucose,lipid values were significantly higher in rats of diabetes mellitus group,P<0.01.Compared with the diabetes mellitus group,serum glucose,lipid values were significantly lower in rats of Wortmannin treatment group,P<0.01.Compared with control group,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were increased significantly in lung tissue of rats in diabetes mellitus group,P<0.01.Compared with the diabetes mellitus group,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were decreased significantly in lung tissue of rats in Wortmannin treatment group.ConclusionPI3K/Akt signal pathway might be related to lung tissue pathological changes of dibtetic rats by regulating the expressions of Caspase-3 and Caspase-9.

diabetes mellitus;lung;PI3K;Caspase-3;Caspase-9;rat

遼寧省教育廳科研基金項目(2010687)

1007-4287(2016)09-1428-04

R282.71R587.2

A

2015-10-12)