胃動素受體在狗胃腸道的表達及比較

何　雨,王成燕,劉　彤,楊嵐嵐,金春香*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 超聲科，吉林 長春130033;2.吉林省腫瘤醫院;3.吉林大學第二醫院)

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胃動素受體在狗胃腸道的表達及比較

何雨1,王成燕2,劉彤1,楊嵐嵐3,金春香1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 超聲科，吉林 長春130033;2.吉林省腫瘤醫院;3.吉林大學第二醫院)

目的通過比較胃動素受體在狗胃腸道各部位的表達情況,探索胃動素在胃腸道各部位不同功能的結構基礎。方法分別取狗胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近段結腸、中段結腸和遠段結腸,用免疫組化方法研究狗胃動素受體在胃腸道的分布,用半定量RT-PCR檢測比較各部位胃動素受體mRNA的表達情況。結果除遠段結腸外,在胃腸道其他部位的腸神經系統中均可檢測到胃動素受體表達;但不同部位的胃動素受體mRNA表達量有顯著性差異(P<0.01);胃動素受體mRNA在十二指腸的表達量最高,其次是回腸,空腸,近段結腸,胃竇和中、遠段結腸。結論胃動素受體在狗胃腸道不同部位的表達量是不同的,狗胃動素受體的最高表達部位在十二指腸。

胃動素受體;狗胃腸道;表達

(ChinJLabDiagn,2016,20:1432)

胃動素是調節消化間期胃腸運動的重要激素,它通過與其受體結合誘導胃腸移行性復合肌電運動(migrating motor complex,MMC) Ⅲ相的發生[1],從而促進消化間期腸內容物向前推進,完成胃腸道機械性和化學性排空,又被稱為饑餓激素。胃動素受體(motilin receptor,MTLR)作為一種G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptor,GPR),業已成為臨床治療胃腸運動障礙性疾病的藥物靶點[2],研究其在胃腸道的分布及功能對于治療此類疾病(比如腸梗阻、腸易激綜合征、功能性消化不良等)具有潛在的臨床應用價值。 然而,不同種屬間MTLR在胃腸道的分布是不同的,目前,在人類、樹鼩、狗、牛、鼠和兔體內均有MTLR表達[3],但嚙齒類動物體內卻只存在一種MTLR假基因,這與該種屬胃腸道在進化過程中喪失嘔吐功能有關[3,4],因為胃動素的作用可引發哺乳動物的嘔吐行為。 但是,兔卻是唯一不會嘔吐的哺乳動物,它進化過程中保留MTLR的原因是需要胃動素來調節食糞這個特殊的消化行為[5]。因此,生存環境、飲食習慣等決定了MTLR在不同種屬的解剖分布及由此而衍生出的不同功能。而在同一種屬胃腸道不同部位MTLR的分布情況尚不十分清楚,本研究通過比較MTLR在狗胃腸道各部位的表達情況,探索胃動素在同種屬內胃腸道各部位不同功能的結構基礎,有助于提高臨床上以MTLR為靶點治療的針對性和可行性。

1　材料和方法

1.1材料

該研究經過吉林大學第三醫院動物醫學倫理委員會批準。將6條狗(雌雄隨機)禁食24小時,氯胺酮麻醉,固定四肢,暴露腹部皮膚,備皮(15 cm),強力碘消毒,切開腹部皮膚,皮下脂肪,肌肉,腹膜后進入腹腔,分別取狗的胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近端結腸(近回盲部)、中端結腸(近橫結腸)和遠端結腸(近降結腸),用預冷的生理鹽水沖洗所取標本至潔凈,然后均勻分成兩份,其中一份放入10%的中性福爾馬林固定用于免疫組織化學染色;另外一份將各部位標本分裝于做好標記的1.5 ml Eppendorf管中,先迅速置于液氮中速凍,之后轉移至-80℃冰箱保存用于提取組織總RNA。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色分析胃動素受體表達將組織切塊,固定,石蠟包埋,切片(厚度為4 μm),烤片,常規二甲苯中脫蠟、水化、修復,PBS沖洗;用正常羊血清封閉30分鐘,棄去,加入兔抗狗MTLR抗體(1∶200,由日本RaQualia,Taketoyo饋贈)4℃孵育過夜，PBS沖洗后,室溫下與生物素標記的羊抗兔抗體和抗生物素偶聯的辣根過氧化物酶孵育30分鐘,DAB顯色(Sigma,美國),酒精梯度脫水,透明,封片。 以PBS代替一抗作為陰性對照,陽性反應以出現棕黃色顆粒沉著為準。

1.2.2RT-PCR檢測MTLR mRNA表達總RNA提取按Trizol試劑(Invitrogen Life Technologies,美國)說明書操作，按二步法(Takara,日本)合成cDNA,以cDNA為模板,MTLR引物序列為:5′-ACC ACC GCC TAC TTC TTC CT-3′和 5′-GCC TGT TTC CCT ACA CAC CT-3′[6],以GAPDH 作為內參,其引物序列為:5′-CCA TCA CCA TCT TCC AGG AG-3′和5′-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG-3′[6]。PCR反應總體積為20 μl,反應條件為94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,40個循環,72℃10 min。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(Invitrogen,美國),應用Quantity one 4.6.2凝膠成像分析系統(美國)進行分析、觀察,用內參照(GAPDH)光密度值標化MTLR mRNA的光密度值進行半定量分析,得到MTLR mRNA表達的相對含量。

1.3統計學處理

結果以均數±標準誤表示,應用SPSS19.0軟件進行統計分析,多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),多個樣本均數兩兩比較采用最小顯著差法(LSD),P<0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

2.1MTLR在狗胃腸道的分布

在胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近段結腸、中段結腸環形肌和縱形肌之間的肌間神經纖維和腸肌間神經叢均發現MTLR的陽性表達,遠段結腸內未發現MTLR的陽性表達,整個胃腸道的平滑肌內均未檢測到MTLR的陽性表達(圖1)。

A:胃竇;B:十二指腸;C:空腸;D:回腸;E:近段結腸;F:中段結腸.圖1　胃腸道各部位腸肌間神經叢MTLR的分布(SP法,×400)

2.2MTLR mRNA在狗胃腸道各部位的表達及比較

MTLR mRNA的PCR擴增產物為549 bp。六條狗的胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近段結腸、中段結腸均擴增出目的基因片段,遠段結腸均未擴增出目的基因片段(圖2)。

各部位之間兩兩比較后顯示,MTLR mRNA表達強度由高到低的排序為:十二指腸→回腸→空腸→近段結腸→胃竇→中段結腸。其中,中段結腸的表達量最少,與其他部位相比差異均有統計學意義(P<0.01),其余各部位的表達與其相鄰排序部位表達之間無顯著差異,但與其不相鄰排序部位表達差異有統計學意義(P<0.01)(表1,圖3)。

表1　MTLR mRNA在胃腸道各部位的表達強度

1:胃竇;2:十二指腸;3:空腸;4:回腸;5:近端結腸;6:中端結腸;7:遠端結腸

圖2MTLR mRNA在狗胃腸道的表達

aP<0.01 與十二指腸MTLR mRNA比較;bP<0.01 與回腸MTLR mRNA比較;cP<0.01 與空腸MTLR mRNA比較;dP<0.01 與近段結腸或胃竇MTLR mRNA比較

圖3胃腸道不同部位MTLR mRNA 表達的排序及比較

3　討論

關于MTLR在不同種屬的分布及表達已有報道,本研究則針對同一種屬胃腸道各部位胃動素受體表達及分布的差異進行探討,試圖更深入理解胃動素對胃腸道運動的作用。研究發現,在總體分布趨勢上,從胃腸道近端至遠端MTLR表達呈現逐漸降低的趨勢;在表達部位上,與文獻報道一致[6],MTLR只表達在狗胃腸道的腸神經系統中,并不表達在平滑肌細胞中;在表達量上,十二指腸的表達量最高,以下依次為回腸、空腸、近段結腸、胃竇、中段及遠段結腸。

本文以狗為研究對象,是因為胃動素的生理特點在狗和人類之間存在諸多相似性,在消化間期,胃MMC Ⅲ出現時,血中內源性胃動素濃度達到峰值,這種吻合在狗和人體內都得到證實[7];當用中和抗體中和循環中的胃動素抑制正常MMC Ⅲ運動后,以一定濃度靜脈輸注外源胃動素,在狗和人體內均可誘導出提前的MMC Ⅲ[7]。本研究顯示,狗胃動素受體在胃腸道總體分布趨勢,也與人類相似,呈現由近端到遠端逐漸降低的趨勢[8]。已有研究發現胃動素衍生物,如紅霉素,不僅對人的上消化道如回腸、上段結腸等運動障礙有作用[9,10]，而且也能刺激健康人胃和十二指腸MMCⅢ運動[11]，但是對遠段結腸動力問題卻沒有影響[12],這正與MTLR在下消化道的低表達相吻合。實際上,許多種屬胃動素免疫陽性細胞(Mo cells)主要位于近端小腸,向肛門方向明顯減少,這也與MTLR在胃腸道近端到遠端表達逐漸降低一致。

然而,雖然分布總體趨勢類似,但不同種屬間MTLR分布及高表達部位仍然存在差異[6,13]。在人和兔的腸神經系統和平滑肌上均可檢測到MTLR表達,而狗MTLR僅位于腸神經系統;人MTLR的最高表達部位在胃竇[8],兔在結腸[14],而本研究發現狗則以十二指腸表達最多。已知MTLR存在兩種亞型,肌肉型和神經型,這兩個亞型的結合特性和藥理特征是不同的[14],通過對受體功能的研究顯示神經受體較肌肉受體對紅霉素的刺激更敏感[8]。不僅如此,Sanger等指出胃動素的作用優先表現為促進腸膽堿能神經活動而不是直接收縮平滑肌[15],因此MTLR的神經型應該是其最原始、最本能的表現形式,也是狗體內的唯一形式,人MTLR的最高濃度主要就是在胃竇的神經成分中測得的[8]。

關于MTLR的優勢表達部位應與胃動素在該處的功能密切相關。胃動素被認為是調節胃腸MMC的重要的內源性物質,MMC是在消化間期發生在胃和小腸的周期性的、反復的運動模式,進食可使其終止。Ⅲ相是MMC中最主動的、爆發性的收縮,起源于胃竇或十二指腸并逐漸向遠端移行。人體內,MMC Ⅲ相收縮起源自胃竇[16],而狗的MMC Ⅲ相起源并無明確說明,但研究已發現十二指腸MMC Ⅲ相常常發生在胃MMC Ⅲ相之前[17]。已經證實,在胃MMC Ⅱ相和Ⅲ相時,5-HT濃度增加發生在十二指腸內[17],而不是胃等其他部位,由此提示胃動素與5-HT之間的正反饋作用發生在十二指腸。當十二指腸被切除后,胃MMC樣運動消失,大概1-4個月以后,又重新出現,此時空腸好像變成了十二指腸發揮作用[18]。這些研究都表明十二指腸在胃腸MMC中的關鍵作用,也提示十二指腸是狗胃腸MMC的起源。本研究中得出的MTLR mRNA在十二指腸表達最多的結果無疑為十二指腸的重要功能提供了結構基礎和客觀證明.

本研究中,我們發現胃動素受體在狗腸神經系統內差異表達,但是我們并沒有確定表達胃動素受體的細胞類型。因為十二指腸的正反饋機制,Takahashi推測胃動素受體位于十二指腸黏膜的EC細胞,并介導了胃MMC Ⅲ相[19]。然而,Xu等通過免疫熒光三標法檢測到胃動素受體位于兔間質細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)膜上[20],并將胃動素與ICC偶聯介導胃運動。無論MTLR是位于ICC上或EC上,都需要進一步研究判斷是否存在種屬差異。目前,從十二指腸黏膜釋放的胃動素與十二指腸EC細胞釋放的5-HT之間的信號轉導過程還有待證明,但可以肯定的是十二指腸在啟動狗胃腸MMC的過程中具有重要的地位[17],這也是本研究所發現的狗MTLR最高表達部位。

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Comparison and expression of motilin receptor throughout dog gastrointestinal tract

HEYu,WANGCheng-yan,LIUTong,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033,China)

ObjectiveTo compare the expression of motilin receptor in different gastrointestinal regions and explore the structural basis of effect of motilin on various parts of dog gastrointestinal tract.MethodsAntrum,duodenum,jejunum,ileum,proximal colon,middle colon and distal colon were removed from the gastrointestinal tract of six dogs.The localization of motilin receptor was evaluated by immunohistochemistry.Semi-quantitative RT-PCR was performed to measure the expression levels of motilin receptor mRNA in different regions.ResultsMotilin receptor was expressed in the enteric nervous system throughout the gastrointestinal tract in dogs,except distal colon.The motilin receptor mRNA expressions among various regions were significantly different (P<0.01).Motilin receptor mRNA was highly expressed in duodenum,followed by ileum,jejunum,proximal colon,antrum,middle and distal colon.ConclusionThe expressions of motilin receptor in various parts of gastrointestinal tract are different.It is the duodenum that the significantly high expression of motilin receptor mRNA is observed.

motilin receptor;dog gastrointestinal tract;expression

國家自然科學基金項目(31271235,81201094)；吉林省自然科學基金項目(201115070)；吉林省科技廳項目(2012073,20130413005GH)

1007-4287(2016)09-1432-04

R574.4

A

2015-07-26)