非小細胞肺癌患者血清外泌體的分離與鑒定

周玄博，馮　虎，金　鵬，胡媛媛，李　寧，陳玉丙*

(吉林大學第二醫(yī)院 1.胸外科；2.放療科，吉林 長春130041)

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非小細胞肺癌患者血清外泌體的分離與鑒定

周玄博1，馮虎2，金鵬2，胡媛媛2，李寧2，陳玉丙2*

(吉林大學第二醫(yī)院 1.胸外科；2.放療科，吉林 長春130041)

外泌體最初是由Johnstone等在哺乳動物網織紅細胞研究中發(fā)現并命名[1-6]。后來的研究發(fā)現，外泌體在細胞內形成小囊泡，可以通過胞吐釋放到周圍環(huán)境中，并能夠在血液、尿液等多種體液中檢測到[7]。外泌體中攜帶著它本身來源的細胞的多種成分，如蛋白質、DNA、RNA、脂質等[8]。因此，建立穩(wěn)定的外泌體分離方法是外泌體以及后續(xù)相關研究的前提。超速離心分離外泌體的方法是當前外泌體分離的金標準。本研究利用超速離心的方法分離并鑒定非小細胞肺癌患者血清中的外泌體，同時也為研究非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及早期篩查提供新的切入點。

1　材料與方法

1.1材料

BCA蛋白濃度測定試劑盒(博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)；兔抗CD9、CD63單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；ECL化學發(fā)光液(上海七海復泰生物科技有限公司)；高速離心機、超速離心機(美國Beckman公司)；透射電子顯微鏡(美國FET公司)；微孔板分光光度儀(美國BioTek公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Image Quant LAS4010)。

1.2方法

1.2.1收集血清獲得非小細胞肺癌患者的知情同意后，從患者外周靜脈血取5 ml，室溫靜置30 min后，4℃、 1000×g離心10分鐘，取上層血清1 ml裝于1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2外泌體的提取取1 ml上述血清至10 ml一次性離心管中，加9 ml 1×PBS液稀釋，上下顛倒混勻，以4℃、2 000×g的條件離心30分鐘。將上清轉移到干凈的超速離心管中，以4℃、12 000×g的條件離心45分鐘。將上清轉移到干凈的超速離心管中，以4℃、110 000×g的條件離心2小時，棄掉上清。用9 ml PBS液重懸沉淀，用0.22 μm濾器過濾上述重懸液，濾液轉移到另一個干凈的超速離心管。以4℃、110 000×g的條件離心70分鐘，棄掉上清液。用500 μl PBS液重懸沉淀轉移到1.5 ml EP管中，-80℃保存。

1.2.3蛋白定量將0.5 mg /mL 的蛋白標準品按0，1，2，4，8，12， 16，20 μl順序加到96孔板中，各孔加入PBS 補充到20 μl；外泌體蛋白樣品取1μl加到96孔板中，加PBS補足到20 μl；各孔加入200 μl BCA工作液，用加樣槍輕輕吹打混勻，37℃孵育45 min后放入酶標儀，于595 nm 波長測定各孔吸光度。

1.2.4外泌體的鑒定

1.2.4.1外泌體形態(tài)的觀察取一干凈的100目載樣銅網置于封口膜上，將新鮮得到的外泌體溶液20 μl用等體積PBS稀釋后滴加到銅網上，室溫靜置1分鐘，室溫晾干。然后用3%(w/v)磷鎢酸鈉溶液20 μl滴到銅網上負染，1分鐘后用濾紙將多余液體輕輕吸去。將銅網放到透射電鏡下觀察，照相。

1.2.4.2外泌體表面特異性分子標志的檢測取上述分離得到的外泌體500 μl，加入100 μl細胞裂解液，將混合物依次放入-80℃、37℃反復凍融三次1 h。BCA 法進行蛋白定量。將蛋白與5×SDS上樣緩沖液混勻(體積比4∶1)，煮10 min,12 000轉/min離心10 min。每孔加入10 μg蛋白的樣品上樣至15%的SDS聚丙烯凝膠中電泳，然后轉印至PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉，按預染Marker 標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入兔抗人CD63、CD9單克隆抗體(1∶700 ) ，4℃搖床上過夜。TBST (10 mmol /L Tris，pH 7.4，150 mmol /L NaCl和0.1%Tween 20) 洗滌3 次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次后ECL 法顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)照相。

2　結果

2.1外泌體的形態(tài)

從非小細胞肺癌患者血清中提取到一些泡狀物，透射電鏡下觀察可見其大小較為均一，形態(tài)呈杯口狀，直徑30-120 nm，有完整膜，內有低電子密度小顆粒。見圖1。

2.2外泌體特異性分子標志物的表達

從非小細胞肺癌患者血清中提取的囊泡表達了外泌體特異性分子標志物CD63 和CD9，進一步證明了該泡狀物可能為外泌體。見圖2。

圖1　非小細胞肺癌血清來源外泌體的形態(tài)

圖2　非小細胞肺癌血清來源外泌體表面標志蛋白的表達

3　討論

外泌體是一種細胞來源的小囊泡，大小30-120 nm，幾乎存在于所有的生物體液中。外泌體能夠穩(wěn)定表達某些能夠參與抗原遞呈的蛋白質，如CD63、CD9及TSG101等[9-12]。外泌體上攜帶了多種其來源細胞的生物大分子，如蛋白質、RNA、質脂，能夠揭示其來源細胞的分子指紋和細胞狀態(tài)[13]。同時研究表明，外泌體的組成和功能與其來源的細胞是有關的[14]。

許多細胞在正常和病理情況下都可以分泌外泌體。他們可以運載一些預示著病理生理狀態(tài)的核酸和蛋白，其對臨床診斷標記物的發(fā)現有著重要的作用。許多的研究表明外泌體中包含與腫瘤、神經組織退化、新陳代謝、感染以及其他疾病相關的核酸和蛋白[15-17]。2009年 Rabinowits等完成了一個關于肺腺癌的研究，這一研究比較了肺腺癌患者和對照組人群中的腫瘤來源外泌體的循環(huán)水平、外泌體小RNA、特異性外泌體miRNA的表達水平，他們發(fā)現了循環(huán)外泌體和肺腺癌活檢樣品中miRNA的表達是相似的，而對照組卻有著顯著的不同。這也就暗示了循環(huán)外泌體miRNA在肺腺癌篩查檢測中可能會發(fā)揮重要的作用[18]。Tanaka等報道了食管鱗狀細胞癌患者血清外泌體miR-21的表達水平比良性腫瘤無全身感染患者中要高。而且，外泌體miR-21與腫瘤進展和侵襲性是及其相關的。總之，越來越多的發(fā)現表明外泌體可以成為許多疾病的一種可能性的生物標志，為疾病基因的靶向治療提供依據。

外泌體的分離純化一直是科研工作者關注的問題，獲得高純度的外泌體對后續(xù)的研究至關重要。目前外泌體分離提取的方法有超速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、磁珠免疫法、PEG-base沉底法、試劑盒提取等。超離法具有操作簡單，獲得的囊泡數量較多的優(yōu)點，因此，超速離心成為了研究者最常用的外泌體分離純化的手段，是目前外泌體分離純化的金標準。但是不可否認，超速離心的方法過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定(可能與轉子類型有關)，純度也受到質疑。

本研究利用超速離心法從非小細胞肺癌患者血清中分離得到大小較為均一內含電子致密物的泡狀物，透射電鏡觀察其形態(tài)，通過 Western blot技術分析泡狀物的外泌體特異性分子標記的表達，證實了該泡狀物為外泌體。超速離心法、Western blot以及透射電鏡技術的綜合運用建立了穩(wěn)定分離鑒定血清外泌體的方法。

綜上所述，本研究證實了非小細胞肺癌患者血清中存在外泌體，并建立了一套穩(wěn)定分離鑒定血清外泌體的方法。為進行大樣本血清外泌體蛋白、核酸檢測以及非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及早期篩查研究奠定基礎。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5.

[2]Devarakonda S,Morgensztern D,Govindan R.Genomic alterations in lung adenocarcinoma[J].Lancet Once,2015,16:e342.

[3]Shackelford RE,Vora M,Mayhall K,et al.ALKrearrangements and testing methods in non-small cell lung cancer:a review[J].Genes Cancer,2014,5:1.

[4]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7.

[5]O'byrne KJ,Danson S,Dunlop D,et al.Combination therapy with gefitinib and rofecoxib in patients with platinum-pretreated relapsed non small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2007,25(22):3266.

[6]Johnstone RM，Adam M，Hammond JR，et al． Vesicle formationduring reticulocyte maturation.Association of plasma membraneactivities with released vesicles ( exosomes)[J].J Biol Chem,1987,262(19):9412．

[7]Thery C,Zitvogel L,Amigorena S.Exosomes:composition,biogenesis and function[J].Nat Rev Immunol,2002,2(8):569.

[8]Jin Lin,Jing Li,Bo Huang,et al.Exosomes: Novel Biomarkers for Clinical Diagnosis[J].The Scientific World Journal,2015,20(5):65.

[9]Johnstone RM.The Jeanne Manery-Fisher Memorial Lecture1991.Maturation of reticulocytes: formation of exosomes as amechanism for sheddingmembrane proteins[J].Biochemistry and Cell Biology,1992,70(3):179.

[10]Pan BT,Johnstone RM.Fate of the transferrin receptorduring maturation of sheep reticulocytes in vitro: selectiveexternalization of the receptor[J].Cell,1983,33(3):967.

[11]Pan BT,Teng K,Wu C,et al.Electronmicroscopic evidence for externalization of the transferrinreceptor in vesicular formin sheep reticulocytes[J].Journal of Cell Biology,1985,101(3):942.

[12]Colombo M，Raposo G，Thery C． Biogenesis，secretion，and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles[J]．Annu R Cell Dev Biol，2014，30: 255．

[13]Toss A,Mu Z,Fernandez S,et al.CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine[J].Ann Transl Med,2014,2(11):108.

[14]Raimondo F，Morosi L，Chinello C，et al． Advances in membranousvesicle and exosome proteomics improving biological understandingand biomarker discovery[J].Proteomics，2011，11(4):709．

[15]Lakkaraju A,Rodriguez-Boulan E.Itinerant exosomes:emerging roles in cell and tissue polarity[J].Trends in Cell Biology,2008,18(5):199.

[16]Schorey JS,Bhatnagar S.Exosome function: from tumorimmunology to pathogen biology[J].Traffic,2008,9(6):871.

[17]van Niel G,Porto-Carreiro I,Simoes S,et al.Exosomes: a common pathway for a specialized function[J].Journal of Biochemistry,2006,140(1):13.

[18]Rabinowits G,Gerc C，el-Taylor,J,et al.Exosomal microRNA: a diagnostic marker forlung cancer[J].Clinical Lung Cancer,2009,10(1):42.

吉林省自然科學基金資助項目(20160101104JC)

1007-4287(2016)09-1439-03

2015-10-17)