SIF干預肥胖大鼠下丘腦瘦素介導JAK/STAT信號通路的研究

陳曉林，羅啟慧，2，唐秀瑩，劉　蕓，李立科，陳正禮，2，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學 實驗動物工程技術中心，四川 雅安 625014)

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SIF干預肥胖大鼠下丘腦瘦素介導JAK/STAT信號通路的研究

陳曉林1，羅啟慧1，2，唐秀瑩1，劉蕓1，李立科1，陳正禮1，2，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學 實驗動物工程技術中心，四川 雅安 625014)

通過觀察SIF對肥胖大鼠下丘腦中瘦素介導的信號通路蛋白表達的影響，探討SIF對肥胖大鼠的干預機制。采用高脂飼料飼喂大鼠，建立肥胖動物模型，并將肥胖大鼠分為4組，分別灌胃SIF，劑量為：對照組(Ⅰ組)0 mg·kg-1、低劑量組(Ⅱ組)50 mg·kg-1、中劑量組(Ⅲ組)150 mg·kg-1、高劑量組(Ⅳ組)450 mg·kg-1，并設置正常大鼠基礎組(Ⅴ組)，飼喂基礎飼料，并灌胃給予SIF處理等體積的羧甲基纖維素鈉，連續4周。采用HE染色法觀察下丘腦組織學結構變化，免疫組織化學SABC法檢測下丘腦中瘦素介導的JAK/STAT信號轉導通路蛋白OB-Rb(瘦素受體長型)，JAK2(內源性酪氨酸蛋白激酶2)，p-STAT3(磷酸化的信號轉導與轉錄激活子3)，SOCS3(細胞因子信號3抑制因子)，NPY(神經肽Y)的表達水平。結果顯示：高劑量組和基礎組OB-Rb，JAK2，p-STAT3的陽性表達水平顯著高于其他組(P<0.05)，且前述蛋白均有隨SIF的劑量增加而表達增多趨勢。高劑量組和基礎組的SOCS3和NPY表達水平顯著較其他組低(P<0.05)，但NPY在背內側核和室旁核的表達隨SIF的劑量增加而增多。OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3和NPY均在下丘腦廣泛表達，并隨SIF的劑量增加而變化，提示SIF對瘦素介導的信號通路有一定作用并與機體能量的調節密切相關；SIF通過干預大鼠下丘腦瘦素JAK/STAT信號通路具有減重作用，并呈劑量依賴性。

大豆異黃酮；免疫組織化學SABC法；OB-Rb；JAK2；p-STAT3；SOCS3；NPY

大豆異黃酮(soy isoflavones，SIF)是一種天然的植物雌激素。其化學結構與雌激素相似，具有多種生物學活性，大量的動物實驗及流行病學研究證明，SIF不僅具有降低血脂血糖、抗動脈粥樣硬化的作用，還具有神經保護和抗神經退變、預防骨質疏松、抗癌[1]、免疫調節、維持血管彈性及抗氧化的作用[2]。肥胖是能量攝入與消耗失衡導致的，而維持機體能量代謝的相對穩態是由多路系統調控的，大部分減肥藥物只能作用于其中某些部分。國內外學者研究發現，大豆異黃酮及相關產品不僅能通過競爭地與雌激素受體結合發揮弱雌激素樣功效[3-4]，還能激活AMPK通路改善血脂和血糖代謝[5-7]，以及通過PPAR路徑降血脂而達到減肥降脂的功效[8]。在眾多調控路徑中，瘦素介導的信號通路，如JAK/STAT信號通路，由于參與機體食物攝入量及體溫調節等受到關注，作為其通路上的關鍵因子，瘦素受體長型(OB-Rb)、內源性酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、磷酸化的信號轉導與轉錄激活子3(p-STAT3)、細胞因子信號3抑制因子(SOCS3)、神經肽Y(NPY)發揮著重大作用[9]。

瘦素(leptin)——作為中樞和外周的能量調節器，是一種由脂肪細胞分泌并能感知和調節機體自身能量的功能性多肽[10]，其循環在機體中樞和外周的水平與機體內脂肪水平呈正比。研究先后發現，瘦素受體至少有6種不同的蛋白異構體，其中OB-Rb被認為是唯一能進行信號轉導并調節能量攝入和能量消耗的異構體[11-12]。下丘腦是中樞神經系統調節能量平衡的核心部位，瘦素卻又在下丘腦調節能量平衡中扮演著重要角色[13-14]。下丘腦中涉及食物攝入和體重調節的站點包括弓狀核ARC(arcuate nucleus)，腹內側核VMH(nucleus ventromedialis)，背內側核DMN(dorsomedial nucleus)，室旁核PVN(paraventricular nucleus)和下丘腦外側區 LH(lateral hypothalamus)，其中尤以ARC-PVN-PF(perifornical)/LH軸間相互作用影響外周能量調控因子，包括瘦素及胰島素等[15]。因此，瘦素通過下丘腦中靶細胞膜上的受體及相應的信號轉導體系實現其功效，比如抑制NPY的分泌[16-17]，進而調控動物機體的食欲和能量平衡，影響體重變化。本研究采用HE染色和免疫組織化學染色方法研究大豆異黃酮對肥胖大鼠OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY的表達和分布的影響，探討其在下丘腦中表達的意義，為大豆異黃酮干預能量系統的功能活動及機制提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物

健康、雄性、出生后6周的SD大鼠80只，體重范圍130～150 g。購自四川達碩生物科技有限公司[SCXK(川)2014-028]。

1.1.2實驗物品及試劑

1)大白鼠基礎飼料，高脂飼料，墊料，水。

2)大豆異黃酮(質量分數為80%)，產品批號：110503，華北制藥股份有限公司。

3)Rabbit Anti-Neuropeptide Y(貨號：ab30914,英國Abcam biotechnology，Inc.)，Rabbit Anti-SOCS3 (貨號：14025-1-AP,美國Proteintech Group，Inc.)，Rabbit Anti-JAK2 (Ab-221)(貨號：B7127,美國Assay Biotechnology，Inc.)，Rabbit Anti-STAT3(Phospho-Tyr705)(貨號：A7224,美國Assay Biotechnology，Inc.)，Rabbit Anti-Leptin receptor(long)(貨號：bs-0109R,北京生物合成生物技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(黃)(貨號：AR1022,武漢博士德生物工程有限公司)，SABC(兔IgG)試劑盒(貨號：SA2002，武漢博士德生物工程有限公司)

1.1.3實驗用具及儀器設備

Leica冷凍切片機(德國徠卡生物系統努斯洛有限公司)，Nikon 50i-BF熒光生物數碼顯微鏡(日本尼康公司)，江蘇捷達801形態分析軟件(江蘇省捷達科技發展有限公司)，超凈工作臺等。

1.2實驗方法

1.2.1動物處理

將已適應環境的75只大鼠隨機分成2個組，基礎組15只和高脂組60只，分籠飼養。高脂組喂高脂飼料；基礎組喂基礎飼料。每日投喂過量飼料(喂前后稱量，計算平均進食量)，自由飲水和攝食。8周以上，每周秤量1次。以高脂飼料組大鼠的體質量大于基礎飼料組大鼠的平均體質量加1.4倍標準差作為肥胖大鼠。40只肥胖大鼠分為4組進行為期4周的大豆異黃酮干預實驗。劑量梯度(基于體質量)分組：①對照組(0 mg·kg-1)，②低劑量組(50 mg·kg-1)，③中劑量組(150 mg·kg-1)，④高劑量組(450 mg·kg-1)，⑤并選取10只基礎飼料組大鼠作為基礎組。各實驗組按照設置劑量灌胃大豆異黃酮，對照組灌胃溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)。飼養管理方式一致，參考大鼠采食量給予充足飼料。實驗中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2.2取材和切片

13周末用戊巴比妥鈉對各組大鼠進行麻醉處死，迅速取出腦組織于固定液中進行固定。將固定后的組織用蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚4～5 μm)，貼片烘片備用，切片分為3套：HE染色、免疫組化檢測、免疫組化陰性對照實驗。將另外固定的腦組織用蒸餾水沖洗后用濾紙吸去組織外部的水分，移入20%的蔗糖PB液中12 h，再移入30%的蔗糖PB液直至組織塊沉底。液氮固定，OCT包埋，進行連續冰凍切片，片厚為30 μm，撈片到PBS液中4℃儲存備用。切片也分為3套：HE染色、免疫組化檢測、免疫組化陰性對照實驗。

1.2.3樣品染色與分析

1)HE染色。常規石蠟切片，每只大鼠取切片5張，進行HE染色，觀察組織結構變化。

2)SABC免疫組織化學染色法。取每只大鼠下丘腦組織冰凍切片用SABC免疫組織化學法檢測OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY的表達。

切片按照常規步驟脫蠟至復水。切片浸入3%H2O215 min→蒸餾水洗3次→浸入檸檬酸鹽緩沖液至沸騰→PBS洗3次→滴加10×正常山羊血清37℃ 30 min→滴加PBS稀釋的一抗(各種一抗的稀釋比例參照試劑說明，并做預實驗而定。陰性對照用PBS代替一抗)4℃ 16～48 h→PBS洗3次→100×生物素化山羊抗鼠IgG 37℃ 60 min→PBS洗3次→100×PBS稀釋SABC 37℃ 30 min→ PBS洗3次→DAB顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水終止反應→PBS洗2次→脫水、透明封片，保存。

1.2.4圖像采集以及數據處理

2　結果與分析

2.1SIF干預對食源性肥胖大鼠體質量的影響

如圖1：SIF灌胃的4周，基礎組大鼠體質量與肥胖組相比差異極顯著(P<0.01)，且增長緩慢。肥胖組的體重持續增加，尤以對照組增加最多，而中、高劑量組體重增加較慢，高劑量組體重變化最少，且在后2周有降低趨勢，與其他各組在13周末時差異極顯著(P<0.01)。

*表示與肥胖組相比差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。圖1　大豆異黃酮干預各時期大鼠體質量Fig.1　Body weight of rats determined at regular intervals after addition of SIF

2.2HE染色結果

顯微鏡下觀察發現，各組大鼠整個腦組織結構清晰完整，下丘腦中的各核團(ARC，DMN，PVN)之間緊密連接，可清楚識別，細胞大小及形態結構完整，染色均勻，清晰可辨，與基礎組相比沒有異常病理變化(圖2)。

2.3SABC免疫組化染色結果

2.3.1OB-Rb在腦中的表達

各實驗組大鼠下丘腦內含OB-Rb的細胞呈現棕褐色，在ARC，DMN，PVN都出現大量的陽性細胞，并呈現多種形態，有多邊形、三角形、卵圓形等。典型的OB-Rb陽性細胞，胞核清楚，色淺，胞質深染，特別是核周區染色較深。陰性對照組皆無陽性反應(圖3)。

統計分析各組大鼠下丘腦中OB-Rb單位面積內的陽性表達面積和平均吸光度(圖4-A—B)，肥胖大鼠中OB-Rb在下丘腦中的表達隨SIF的劑量增加而增多，各組間差異顯著(P<0.05)。基礎組大鼠的OB-Rb表達量最高，與其他組差異顯著(P<0.05)。在ARC，DMN，PVN中，OB-Rb在DMN中表達最多，且隨SIF劑量增加而增加，各組和各核團間差異顯著(P<0.05)。

2.3.2JAK2在腦中的表達

JAK2陽性細胞為棕褐色或深黃色，并呈現多種形態，有多邊形、卵圓形等。JAK2蛋白主要表達在神經元胞質，少數膠質細胞內亦有表達。在ARC，DMN，PVN陽性細胞體清晰可見(圖5)。

JAK2在下丘腦中廣泛表達，高劑量組和基礎組表達最多，與肥胖其他組差異顯著(P<0.05)。在低劑量時，JAK2的表達量較對照組沒有變化，中劑量時有增加趨勢。JAK2在DMN中表達最多，ARC中最少，差異顯著(P<0.05；圖4-C—D)。

A： 基礎組；B，C： 對照組；D，E，F： SIF低、中、高劑量組。100×。圖2　大鼠下丘腦HE染色Fig.2　The hypothalamus HE staining of rats

A，B，C，D，E，F分別為下丘腦背側區、丘腦、視束后部、ARC、DMN、PVN。200×。：陽性細胞體。圖3　OB-Rb在下丘腦中的表達Fig.3　The IHC of OB-Rb distributing in hypothalamus

各組同部位柱狀圖上沒有相同小寫字母的表示在P<0.05水平差異顯著；n=8。A，C，E，G，I為總表達面積；B，D，F，H，J為吸光度。Ⅰ：對照組；Ⅱ：低劑量組；Ⅲ：中劑量組；Ⅳ：高劑量組；Ⅴ：基礎組。圖4　補充大豆異黃酮對大鼠下丘腦ARC，DMN，PVN中OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY表達的影響Fig.4　Effects of supplying soybean isoflavone on OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY expression in ARC，DMN and PVN of rats

A，B，C，D，E，F分別為尾殼核、內側隆起、視束、ARC、DMN、PVN。200×。圖5　JAK2在下丘腦中的表達Fig.5　The IHC of JAK2 distributing in hypothalamus

2.3.3p-STAT3在腦中的表達

p-STAT3陽性表達產物顏色及形態與JAK2相似，廣泛分布于下丘腦中(圖6)。

p-STAT3在下丘腦中的表達情況和JAK2相似，高劑量組和基礎組表達量最多，與其他組差異顯著(P<0.05)。對照組、中、低、高劑量組的表達量也隨SIF的量增加呈升高的趨勢。在DMN中表達最多，ARC中最少，各組和各核團之間差異顯著(P<0.05；圖4-E—F)。

2.3.4SOCS3在腦中的表達

SOCS3陽性產物在大鼠腦內有廣泛表達。陽性染色為棕黃色，以胞質為主，神經元軸突，樹突亦有；陰性對照無SOCS3陽性染色。ARC，DMN，PVN上SOCS3陽性表達較其他區域少(圖7-A—F)，且染色較淺。

如圖4-G—H，SOCS3的表達量在高劑量組和基礎組幾乎相同，較其他組表達最少且差異顯著(P<0.05)，且在DMN表達最多。在ARC中，SOCS3的表達量密度隨著SIF的量增加而呈降低趨勢，表達面積卻隨著劑量增加而加大。SOCS3的吸光度和表達面積在DMN和PVN中均有降低趨勢，在高劑量組和基礎組最小，差異顯著(P<0.05)。

A，B，C，D，E，F分別為連結核、丘腦外側核、尾殼核、ARC、DMN、PVN。200×。圖6　p-STAT3在下丘腦中的表達Fig.6　The IHC of p-STAT3 distributing in hypothalamus

A，B，C，D，E，F分別為血管周圍神經纖維、大腦皮質、海馬、ARC、DMN、PVN。200×。圖7　SOCS3在腦中的表達Fig.7　The IHC of SOCS3 distributing in hypothalamus

2.3.5NPY在腦中的表達

NPY陽性細胞的胞質呈棕褐色或棕黃色。NPY在神經系統內含量最高，在ARC，DMN，PVN上NPY也呈強陽性，可觀察到大量陽性神經纖維，陽性細胞體比較少見(圖8)。

由圖4-I—J可知，NPY的光密度值在下丘腦的幾個核區中隨SIF的劑量增加而呈現先增加后降低的趨勢，在中劑量組最高，高劑量組和基礎組最低，高劑量組和基礎組與其他組差異顯著(P<0.05)。NPY的表達面積在DMN，PVN中也隨SIF的劑量增加而呈現先增加后降低的趨勢，但在高劑量組和基礎組降低較少，而在ARC中隨SIF的劑量增加而呈現減少趨勢，高劑量組和基礎組表達最少。NPY在DMN和PVN中表達最多。

A，B，C，D，E，F分別為大腦皮質、尾殼核、海馬、ARC、DMN、PVN。200×。圖8　NPY在下丘腦腦中的表達 Fig.8　The IHC of NPY distributing in hypothalamus

3　討論

3.1OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY在腦的分布

腦是高級整合中樞，在能量平衡調節中起關鍵作用。下丘腦為食物攝入和體重調節的關鍵部位，其在影響Lep水平繼而調節能量平衡的過程中，ARC-PVN-PF/LH軸間相互作用并調節下游通路。在本實驗中發現，調節能量平衡的各因子均在下丘腦DMN中表達最多，因此可推測下丘腦DMN為機體攝食和能量調控的主要部位。Lep廣泛游離在體內，對機體產生重大作用，與OB-Rb結合后激發受體后效應，OB-Rb在腦內的組織學分布直接顯示出Lep的功能性位點。本實驗研究發現：OB-Rb在下丘腦廣泛表達，與已有相關研究高度一致[18]，且其在下丘腦中較通路上的其他蛋白因子表達最多，充分說明具有OB-Rb陽性細胞反應的核團均為Lep作用的靶細胞，并參與了機體攝食與能量的調控，進而影響機體肥胖。Lep與OB-Rb受體結合后，能夠磷酸化激活 JAK2分子，開啟JAK/STAT細胞內信號轉導通路調控體內能量代謝途徑[19-20]，JAK2，p-STAT3蛋白作為其家族成員之一，廣泛參與機體的能量平衡。本研究觀察發現，JAK2，p-STAT3蛋白也廣泛分布于下丘腦各核團，與彭玲玲[21]的研究結果相似。其中JAK2，p-STAT3蛋白的表達部位既有相同之處，也有區別，說明它們共同存在于某些細胞，相互作用調節；也同時分別存在于不同部位，發揮著不同作用。JAK/STAT 系統在發揮其信號轉導作用的同時，也啟動了該途徑的負反饋性抑制環路，從而使 JAK/STAT 系統的活動得到平衡與控制[22-23]。SOCS3作用在于作為Lep的負性調節因子抑制瘦素JAK/STAT信號轉導通路，減弱瘦素的Lep作用，并參與Lep抵抗。因此，SOCS3在腦內的分布與JAK2，p-STAT3是共存的，并且可看出SOCS3在正常者中較肥胖者表達要多一些。自分離純化出NPY后，有關NPY的分布研究眾多[24-25]。本實驗對NPY的表達也做了詳細研究，發現其在下丘腦中也廣泛表達，DMN和PVN表達最多，說明在下丘腦中對機體攝食是最主要受這兩個核區控制的，但作用機理尚待研究。

3.2SIF對膳食誘導肥胖大鼠下丘腦中OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY表達的影響

關于SIF對肥胖的治療作用已有大量報道，但其作用機制尚存在未知點及爭議[26]。研究顯示，SIF的肥胖逆轉作用與Lep有關[27]。值得關注的是，肥胖患者常表現高Lep血癥，看似與中樞Lep注射治療肥胖作用違背，但目前多數觀點認為這與Lep在中樞和外周的轉運和信號傳導障礙有關，稱為Lep抵抗[28]。大豆異黃酮通過改變Lep水平，進而引起后通路蛋白的改變。本實驗統計分析下丘腦內ARC，DMN，PVN中OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3的陽性表達總面積和平均吸光度，發現肥胖大鼠OB-Rb在下丘腦中的表達隨SIF的劑量增加而增多，各組間差異顯著(P<0.05)。基礎組大鼠和高劑量組的大鼠下丘腦內OB-Rb表達量最高，與其他組差異顯著(P<0.05)。而JAK2，p-STAT3在SIF作用下的表達量也呈現隨劑量增加的趨勢，差異顯著(P<0.05)，說明JAK2，p-STAT3在下丘腦中的表達與OB-Rb的表達呈正相關。SOCS3作為Lep的負性調節因子，在高劑量SIF作用下表達顯著降低，表達量與基礎組相似，可推斷在SIF作用下SOCS3對Lep的降脂作用抑制功能有減弱作用。且NPY的表達水平隨大豆異黃酮劑量增加而減少。NPY經不同劑量SIF作用，在下丘腦中的表達總體呈現低劑量緩慢升高而高劑量時降低的趨勢，說明SIF在高劑量時有明顯的控制動物食欲的作用，而在低、中劑量時作用不明顯，且可能伴有促進食欲的作用，這有待進一步的實驗研究。總的來說，在不同劑量SIF作用下，Lep介導的JAK/STAT信號轉導通路的各關鍵因子在下丘腦的表達呈現如此規律：OB-Rb，JAK2，p-STAT3的表達隨著SIF劑量的增加呈現升高的趨勢，SOCS3和NPY的表達卻有下降趨勢。推測大豆異黃酮可能劑量依賴性影響機體下丘腦內的Lep水平，且Lep與OB-Rb結合后，通過激活細胞內JAK/STAT信號轉導途徑，主要抑制下丘腦DMN，PVN表達和分泌 NPY而抑制食欲，減少食物攝入，增加耗能，消耗脂肪量，從而對肥胖具有治療作用。

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(責任編輯盧福莊)

Study of leptin-dependent signaling JAK/STAT in hypothalamus after treated by SIF on obese rats

CHEN Xiao-lin1，LUO Qi-hui1，2，TANG Xiu-ying1，LIU Yun1，LI Li-ke1，CHEN Zheng-li1，2，*

(1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China;2.Experimental Animal Engineering Center，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

Soy isoflavone (SIF) had effect on decreasing blood lipids.The present research focused on whether it could lose body weight by regulating leptin level.The experiment was designed to investigate the effects of SIF on leptin-dependent signaling in hypothalamus of obese rats.Food-induced obese rats model was established by feeding with high oil diet，then the obese rats were randomly divided into four groups (GroupⅠ-Ⅳ) fed with SIF 0 (control group)，50 (low dose group)，150 (medium dose group) and 450 (high dose group) mg·kg-1body weight，respectively.In addition，the control group (Group V,basis group) rats were fed with low oil basal diet.The experiment lasted for 4 weeks.At the end of the experiment，all experimental rats were euthanized with pentobarbital sodium and sections of their hypothalamus were prepared and stained with HE.The expressions and positive rates of the main proteins of leptin-JAK/STAT signaling,i.e.OB-Rb，JAK2，p-STAT3，SOCS3，NPY were detected by immunohistochemical SABC，respectively.The results showed that the expressions and positive rates of OB-Rb，JAK2，p-STAT3 in high dose SIF group and basis group were both significantly higher than those in other groups (P<0.05)，and their expression levels were raising with the increased dose of SIF.On the contrary，the levels and positive rates of SOCS3 and NPY in high and basis group were the least compared with other groups，and the difference was significant (P<0.05)，but the expression of NPY was rising in dorsomedial nucleus and paraventricular nucleus following the increased dose of SIF.Above all，SIF had affect on leptin-dependent signaling road.In conclusion，the five proteins were closely related to body energy regulation.SIF could lose body weight by interfering the leptin-JAK/STAT signaling of hypothalamus in obese rat in a dose dependent manner.

soy isoflavones;immunohistochemical SABC;OB-Rb;JAK2;p-STAT3;SOCS3;NPY

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):420-427http://www.zjnyxb.cn

陳曉林，羅啟慧，唐秀瑩，等.SIF干預肥胖大鼠下丘腦瘦素介導JAK/STAT信號通路的研究[J].浙江農業學報，2016，28(3):420-427.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.10

2015-08-28

國家科技支撐計劃項目(2014BAI03B01)；國家重大科學儀器設備開發專項(2013YQ49085906)；四川省青年科技創新研究團隊項目(2013TD0015)

陳曉林(1989—)，女，四川瀘州人，碩士研究生，從事實驗動物疾病模型研究。E-mail：814510829@qq.com

，陳正禮，E-mail：chzhli75@163.com

S816.75

A

1004-1524(2016)03-0420-08