基于表面解吸常壓化學電離質譜法快速評價咖啡種子活力

殷勤 羅火林 劉星星 黃學勇 羅麗萍

（南昌大學生命科學學院，南昌 330031）

基于表面解吸常壓化學電離質譜法快速評價咖啡種子活力

殷勤 羅火林 劉星星 黃學勇 羅麗萍*

（南昌大學生命科學學院，南昌 330031）

為快速、無損地區分不同活力的咖啡種子，采用自行研制的表面解吸常壓化學電離質譜（DAPCIMS），在無需樣品預處理的前提下，獲得咖啡種子表面的化學指紋圖譜，并分別進行了主成分分析（PCA）、聚類分析（CA）和判別分析（DA），獲得不同活力的咖啡種子樣品的質譜信息特征。結果表明，在正離子模式下，DAPCI-MS結合多變量分析方法能有效區分不同活力的咖啡種子。PCA提取了3個主成分，累計貢獻率達到92.2%；CA可以將相同活力的咖啡種子聚在一起，準確率為100%；DA對訓練樣本的回判正確率為100%，交叉驗證分析成功率為100%，對外部驗證樣本進行DA，正確率95.7%。本方法具有無需樣品預處理，分析速度快，靈敏度高，對種子無損傷等優點，能為其它種子活力測定提供參考。

表面解吸常壓化學電離質譜；咖啡；種子活力；多變量分析

1 引言

種子活力（Seed vigor）是指在廣泛田間條件下，決定種子迅速整齊出苗和長成正常幼苗的潛在能力的種子特性，是衡量種子質量高低的一項重要指標。傳統的種子活力測定方法存在檢測速度慢、具有破壞性、預處理過程復雜等問題，因此快速、準確和無損傷測定成為當前種子活力測定方法的一個重要發展趨勢。表面解吸常壓化學電離質譜（Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry，DAPCI-MS）可在常溫、常壓和未經樣品預處理的前提下對樣品表面進行直接分析［1～3］。Chen等［4］采用DAPCI-MS對茶葉樣品直接進行檢測，成功區分了40種茶葉樣品。Wu等［5］采用DAPCI-MS對干海參樣品進行檢測，成功區分了不同生境下的干海參樣品。羅麗萍等［6］采用DAPCI-MS結合化學計量學方法，實現了新鮮和陳年蓮子的快速鑒別。

咖啡（Coffee arabica L.）屬于茜草科（Rubiaceae）咖啡（Coffee）屬植物，有103種［7］。咖啡種子在常溫下最多能儲存2～6個月，之后活力會迅速喪失，嚴重影響咖啡的生產效益和種質資源保存［8］。目前，咖啡種子研究主要集中于其收獲后加工方法對咖啡風味的影響、咖啡中的化學成分及其結構、不同基因型咖啡的鑒別等方面，而對咖啡種子活力測定方法的研究較少。

本研究采用DAPCI-MS對不同活力的咖啡種子表面直接進行檢測，獲得其DAPCI-MS指紋圖譜，結合多變量分析，對不同活力的咖啡種子進行分析，建立了咖啡種子快速、無損、靈敏的活力檢測方法，為咖啡種子的貯藏及種質資源的保存和定時更新繁殖提供參考依據。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

DAPCI離子源（東華理工大學研制）；線性離子阱質譜儀（Finnigan LTQ XL），配有LTQ Xcalibur 2.0軟件處理系統（美國Finnigan公司）；LH-150S型種子老化試驗箱（浙江托普儀器有限公司）；GXZ-380B智能光照培養箱（寧波東南儀器有限公司）。

甲醇（色譜純，美國Dikmapure公司）。實驗室用水為自制二次蒸餾水，其它試劑均為分析純。

小粒咖啡（C.arabica L.）種子，2014年11月收獲，由熱帶作物研究所提供。種子含水量為26.15%，千粒重為182.34 g。

2.2 實驗方法

2.2.1 人工加速老化 參照國際種子檢驗協會（International Seed Testing Association，ISTA）［9］的人工加速老化方法，老化箱溫度為40℃，箱內相對濕度100%。老化時間分別為0，1，2，3，4，5和6 d，老化處理后的種子置于室溫放置3～4 d，確認種子含水量降至原狀態，再進行發芽實驗和質譜檢測。

2.2.2 標準發芽實驗 參照《國際種子檢驗規程》中的發芽條件進行發芽實驗［10］。培養皿內墊3層濾紙作為發芽床，每個培養皿放25粒咖啡種子，3個重復；將培養皿置于25℃光照培養箱中暗培養，每隔24 h統計一次發芽的種子數，直至無萌發時結束實驗。以胚根長度為種子長度的1/2時為發芽標準，統計各處理種子的發芽勢（GP）、發芽率（GR）、幼苗單株鮮重，并計算發芽指數（GI）和活力指數VI。

其中，EGN和TGN分別為發芽初期的發芽數和發芽終期的發芽數；SSN為供試種子數；Gt為第t天發芽數，Dt為相應發芽天數；GI為發芽指數；S為幼苗單株鮮重（g）。

2.2.3 DAPCI-MS分析條件 如圖1所示，采用液體輔助DAPCI，LTQ-MS為正離子檢測模式，質譜檢測掃描范圍為m/z 50～500；離子源電壓為3.5 kV；毛細管溫度為100℃；輔助解吸氣（N2）氣壓為0.8 MPa；解吸劑為甲醇/水溶液（4∶1，V/V），流速為3 μL/min。質譜入口與離子源距離為10 mm；離子源與樣品表面的距離為5 mm；噴霧針與樣品表面的角度為50°；樣品表面與質譜儀入口毛細管的角度為15°～30°。其它參數采由LTQ-MS系統自動優化。

2.3 數據分析

采用SPSS19.0軟件（IBM SPSS statistics）進行方差分析、聚類分析（Cluster analysis，CA）和判別分析（Discriminant analysis，DA）。利用 Matlab軟件（7.0版，美國 Mathworks公司）進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

圖1 DAPCI-MS檢測咖啡種子結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of coffee seeds detection by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry（DAPCI-MS）

3 結果與討論

3.1 老化時間對咖啡種子發芽指標和種子活力的影響

咖啡種子老化不同天數后，發芽指標和種子活力指數變化如表1所示，未老化咖啡種子的發芽指標和活力指數與老化后的咖啡種子之間的差異極顯著，隨老化時間的延長，咖啡種子的發芽指標和活力指數均呈下降趨勢，老化至第6 d時，咖啡種子的發芽指標和活力指數均為0。說明在人工老化過程中，咖啡種子活力隨著老化時間的延長而降低，直至完全喪失。老化處理的咖啡種子活力指標與老化時間的相關關系如表2所示，咖啡種子的活力指標與老化時間都呈負相關，且都達到極顯著水平。說明不同的人工老化時間使咖啡種子形成不同的活力水平。

表1 人工老化過程中咖啡種子發芽情況和活力指數Table 1 Germination and vigor indexes of coffee seeds by artificial aging

表2 咖啡種子人工老化過程中活力指標與老化時間之間的相關分析Table 2 Correlation analysis between vigor indexes and artificial aging time

Rendón等［11］研究發現，咖啡種子在儲存過程中會發生脂質氧化反應，同時也觀察到細胞結構損傷，種子活力下降和感官變化，與谷物在存儲過程中發生的氧化過程一致。因此，采用本方法獲取咖啡種子表面的物質信息，鑒別咖啡種子活力是可行的。Dussert等［12］研究富含油脂的咖啡種子的貯存時發現，脂肪酶在調節中性脂質的水解過程中表現出促進游離脂肪酸生成的特性。因此，咖啡種子在人工老化過程中活力迅速下降，可能是由于在高溫高濕的條件下脂質氧化反應增強，隨著人工老化時間延長，種子劣變程度不斷加劇，人工老化處理顯著抑制了種子萌發，導致種子活力下降，直到完全喪失。

3.2 不同老化時間咖啡種子的DAPCI-MS分析

DAPCI-MS可以得到不同活力咖啡種子的指紋特征。如圖2所示，不同活力的咖啡種子的DAPCIMS譜圖既有相同之處，也有明顯的差異。在所有譜圖中，m/z 100～400之間產生的質譜峰都很多，因為咖啡的化學組成復雜，就咖啡香氣而言就有近千種揮發性化合物［13］，因此在咖啡種子表面積累了很多物質。在m/z＞400處，質譜峰較少，可能是因為本實驗以甲醇-水（4∶1，V/V）溶液為解吸劑，一些大分子物質很難從樣品表面有效地解吸出來。

所有咖啡種子樣品的指紋圖譜中均存在信號峰 m/z 55，274，302，318，400，473和489，且m/z 274和318均是最強的，m/z 473在老化0和1 d的樣品中信號強度相差不大，在老化2和3 d的樣品中信號強度明顯增強，但在老化4、5和6 d的樣品中信號強度又明顯下降。因為揮發性香氣成分是種子的次級代謝產物，多由異戊二烯、類苯基丙烷、氨基酸和脂肪酸產生［14］。在人工老化過程中，一些揮發性化合物很快就揮發了，另一些則保持不變，隨著老化時間延長，易揮發的物質逐漸減少，所以利用DAPCI-MS技術得到不同活力咖啡種子的指紋圖譜中，有很多信號峰存在于所有圖譜中，一些信號峰的豐度保持不變，而另一些信號峰則在老化過程中先增強，后下降。

3.3 主成分分析

以m/z值為自變量，信號強度為因變量，利用Matlab軟件對質譜實驗得到的數據（每種樣品選擇50個，共350個）進行PCA，計算特征值、特征向量及累計貢獻率。圖3A是在正離子模式下的PCA得分圖，PC1、PC2和PC3分別代表了變量總方差的77.8%、11.1%和3.3%，累積92.2%，這3個主要成分包含了被分析樣本的絕大部分信息。圖3B是相應的載荷圖，對 PC1貢獻最大的質譜信號是m/z 302，318，346，362，400，473等，說明不同活力的咖啡種子樣品，其表面化學成分或含量發生了變化。所有咖啡種子有規律地聚集和分散，活力相同的種子聚在一定的區域內，活力不同的種子分散在不同的區域。結果表明，DAPCI-MS結合PCA可以有效區分不同活力的咖啡種子。

圖3 咖啡種子PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.3 Score plots（A）and corresponding loading plots（B）of coffee seeds by principal component analysis

3.4 聚類分析

采用SPSS軟件計算105個咖啡種子樣品（每種樣品選擇15個）之間的歐氏距離，結果如圖4所示，相同活力的咖啡種子都分別聚在一起，CA準確率為100%。當臨界值為10時，105個咖啡種子樣品分別聚為4類。第一類包含老化1，2和4 d的咖啡種子樣品，特別是老化1和2 d的樣品間的距離較小，表明它們之間的差異較小。第二類包含老化3 d的咖啡種子樣品，與其它3類的距離較大，表明它們之間的差異也較大。第三類包含老化5和6 d的咖啡種子樣品，因為它們的活力指數差異不顯著。第四類包含未老化（0 d）的咖啡種子樣品，因為它與其它3類咖啡種子的活力指數差異極顯著。結果表明，DAPCIMS結合CA可以有效區分不同活力的咖啡種子。

3.5 判別分析

按統計量Wilk's λ最小值原則選擇變量，進行逐步DA，建立判別方程。根據非標準化判別方程系數，得到的判別函數方程組的變量與系數見表3。計算各咖啡種子得分，以F1為橫坐標、F2為縱坐標，得到咖啡種子判別圖（圖5）。計算判別函數F1、F2的特征值分別為38.553和12.004，典型相關系數分別為0.987和0.961，方差分析證明其類間差異極顯著（p＜0.01），判別結果有效。對350個訓練樣本（每種樣品選擇50個）的回判，正確率為100%，交叉驗證分析成功率100%，說明得到的判別方程穩定性良好；對140個外部驗證樣本（每種樣品選擇20個）進行判別，有6個老化1 d的樣本錯判為老化2 d的樣本，正確率95.7%。

圖4 咖啡種子CA的樹形圖Fig.4 Dendrogram of coffee seeds by cluster analysis

表3 不同老化時間咖啡種子的判別函數變量及其系數Table 3Variable and coefficient of discriminant functions of different aging time for coffee seeds

從圖5可見，不同活力的咖啡種子樣本都能完全分開，老化0，1和2 d的咖啡種子樣本距離較近，但它們的活力指數之間差異極顯著，因此能完全分開。老化3 d的咖啡種子樣本與其它樣本距離較遠，可能是因為它們的活力指數之間差異極顯著。老化4，5和6 d的咖啡種子樣本，雖然分布仍能各自成群，但間距較小，部分樣本容易混淆，可能是因為老化5和6 d的咖啡種子的活力指數差異不顯著。結果表明，DAPCI-MS結合DA可以有效區分不同活力的咖啡種子。

4 結論

在無需樣品預處理的前提下，采用DAPCI-MS直接對咖啡種子表面進行檢測，獲得其正離子模式下的指紋圖譜。PCA提取了3個主成分，累計貢獻率達到92.2%。CA可將相同活力的咖啡種子聚在一起，準確率為100%。DA對訓練樣本的回判正確率為100%，交叉驗證分析成功率為100%，對外部驗證樣本進行DA，正確率為95.7%。DAPCI-MS結合多變量分析可以有效區分不同活力的咖啡種子。本研究為建立快速、無損、靈敏的種子活力檢測新方法提供了參考。

圖5 咖啡種子訓練樣本和驗證樣本的DA（F1、F2為判別函數）Fig.5 Discriminant classification of training samples and verification samples of coffee seeds（F1and F2are discriminant functions）

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This work was supported by the Key Projects in the National Science&Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period （No.2012BDA29B01）and the National Natural Science Foundation of China（No.31370384 ）

Rapid Evaluation of SeedVigor of Coffee by Surface Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry

YIN Qin，LUO Huo-Lin，LIU Xing-Xing，HUANG Xue-Yong，LUO Li-Ping*
（School of Life Sciences，Nanchang University，Nanchang 330031，China）

To determine the seed vigor of coffee quickly and non-destructively，surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry（DAPCI-MS）was used to obtain chemical fingerprints directly from the surface of the coffee seed，without any sample pretreatment.The mass spectral raw data were analyzed by multivariate analysis，including principal component analysis（PCA），cluster analysis（CA）and discriminant analysis（DA），to differentiate efficaciously the coffee seeds with different vigor.The experimental results demonstrated that in the positive ion mode，DAPCI-MS combined with multivariate analysis could effectively distinguish different seed vigor for coffee seed.Three principal components were extracted by PCA，and their cumulative contribution rate was 92.2%.Coffee seeds with the same vigor was packed closely together in CA analysis，and its accuracy was 100%.In DA analysis，the return discriminant ratio for the training muster was as high as 100%，while the cross validation analysis success rate was 100%. Thus，it was concluded that the coffee seeds with different vigor could be differentiated by DAPCI-MS，and the results provided a basis for establishing a fast，non-destructive and sensitive detection method of seed vigor.

Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry；Coffee；Seed vigor；Multivariate analysis

4 July 2015；accepted 27 October 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150535

2015-07-04收稿；2015-10-27接受

本文系“十二五”國家科技支撐計劃（No.2012BDA29B01）、國家自然科學基金（No.31370384）、江西省科技廳項目（No.20123BCB22004）和江西省教育廳項目（No.KJLD12051）資助

* E-mail:lluo2@126.com