體外仿生法研究牡蠣和蛤仔體內(nèi)微量金屬元素的生物可給性

王增煥王許諾 林 欽 陳成桐 陳瑛娜

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

體外仿生法研究牡蠣和蛤仔體內(nèi)微量金屬元素的生物可給性

王增煥*王許諾 林 欽 陳成桐 陳瑛娜

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

采用體外全仿生消解方法，模擬人體的消化道環(huán)境，對(duì)牡蠣和蛤仔樣品進(jìn)行仿生消解，分析牡蠣和蛤仔體內(nèi)微量元素的生物可給性。以原子吸收光譜法測定胃、腸仿生提取液中微量元素的含量。結(jié)果表明，牡蠣胃提取液中Fe，Cu，Zn，Cd的含量明顯高于腸提取液中的含量，蛤仔胃提取液中Fe，Cu的含量與腸提取液中的含量沒有明顯差異，而Zn，Cd的含量遠(yuǎn)高于其在腸提取液中的含量。經(jīng)全仿生消解后，牡蠣體Fe，Cu，Zn，Cd的可給性分別為60.2%，83.6%，83.1%，76.8%；蛤仔Fe，Cu，Zn，Cd的可給性分別為46.3%，86.3%，85.3%，87.7%。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究牡蠣和蛤仔對(duì)金屬元素的累積和遷移、生物可利用性，Cd等有害元素對(duì)食用者的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

體外仿生消解；生物可給性；原子光譜法；微量元素；牡蠣和蛤仔

1 引言

牡蠣和蛤仔是常見的兩種貝類，營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，易被人體消化吸收，深受消費(fèi)者的青睞［1～3］。牡蠣和蛤仔的Fe，Zn，Cu等多種生命必需元素含量高［4，5］，具有較高的食用價(jià)值與保健作用。另一方面，牡蠣和蛤仔生活在沉積物表面，受養(yǎng)殖環(huán)境影響，一些有害元素如Cd等的含量也比較高［6，7］，對(duì)食用安全有潛在的危害［8，9］。

金屬元素在生理和病理中有重要作用［10，11］。氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)可以在人體內(nèi)合成，但微量元素必須從飲食中獲取［12］，并且隨著能量的消耗而流失。但是，所有通過膳食途徑進(jìn)入人體的物質(zhì)，包括營養(yǎng)物質(zhì)和有害物質(zhì)，首先要在消化液作用下從食物基體上釋放出來，才有可能被機(jī)體組織利用，成為潛在的生物可利用部分，即生物可給性［1，13～15］。許多關(guān)于牡蠣和蛤仔體內(nèi)微量元素的研究，主要以元素的總量為基礎(chǔ)，分析必需元素的功能作用，討論有害元素對(duì)食用者的危害［6，9］。本實(shí)驗(yàn)采用體外全仿生消化法，應(yīng)用仿生消化液對(duì)牡蠣和蛤仔樣品進(jìn)行消解，以原子吸收光譜法測定胃、腸仿生提取液以及剩余殘?jiān)蠪e，Cu，Zn和Cd的含量，分析牡蠣和蛤仔中微量金屬的生物可給性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

HITCH Z-2000型原子吸收分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；Ethos 1型微波消解系統(tǒng)（意大利Milestone公司）；ALPHA 1型真空冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）；ZHWY-200D型氣浴恒溫振蕩器（中國智誠公司），Anke DL-6000B型低溫離心機(jī)（中國安亭公司）。

HNO3、H2O2（優(yōu)級(jí)純，廣州試劑廠）；牛血清白蛋白（分析純，廣州威佳科技有限公司）；黏液素（分析純，廣州鼎國生物技術(shù)有限公司）；胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶、膽汁、α-淀粉酶、氨基葡萄糖鹽酸鹽、葡萄糖醛酸、葡萄糖、尿素、尿酸等試劑（分析純，上海晶純生化科技股份有限公司）；多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/L，上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院）。

2.2 樣品制備

牡蠣和蛤仔采集于廣東沿海主要養(yǎng)殖區(qū)，現(xiàn)場用海水沖洗干凈外殼后，取出軟組織，-20℃保存，

帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室再用真空冷凍干燥機(jī)凍干后，用瑪瑙研缽研磨成均勻粉末，待用。

2.3 仿生消化液制備

參照文獻(xiàn)［18，19］制備仿生消化液，由一定的生物酶和適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽與有機(jī)物制成如下：

仿生唾液燒杯中加入10 mL KCl溶液（89.6 g/L）、10 mL硫氰化鉀（KSCN）溶液（20 g/L）、10 mL NaH2PO4溶液（88.8 g/L）、10 mL Na3PO4溶液（57 g/L）、1.7 mL NaCl溶液（175.3 g/L）、1.8 mL NaOH溶液（40 g/L），再加入8 mL尿素溶液（25 g/L）和145 mg α-淀粉酶、15 mg尿酸、50 mg粘液素，用HCl 或NaHCO3溶液調(diào)pH至6.5±0.2，用超純水定容至500 mL，在4℃保存。

仿生胃液燒杯中加入15.7 mL NaCl溶液（175.3 g/L）、3.0 mL NaH2PO4溶液（88.8 g/L）、9.2 mL KCl溶液（89.6 g/L）、18 mL CaCl2溶液（22.2 g/L）、8.3 mL HCl溶液（37%），加入10 mL葡萄糖溶液（65 g/L）、10mL葡萄糖醛酸溶液（2 g/L）、3.4 mL尿素溶液（25 g/L）、10 mL氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液（33 g/L），再加入1 g牛血清蛋白、1 g胃蛋白酶、3 g粘液素，調(diào)節(jié)至pH 1.07±0.07，稀釋至500 mL，4℃保存待用。

仿生十二指腸液燒杯中加入40 mL NaCl溶液（175.3 g/L）、40 mL NaHCO3溶液（84.7 g/L）、10 mL KH2PO4溶液（8 g/L）、6.3 mL KCl溶液（89.6 g/L）、10 mL MgCl2溶液（5 g/L）、9 mL CaCl2溶液（22.2 g/L）、0.18 mL HCl溶液（37%）和4 mL尿素溶液（25 g/L），再加入1 g牛血清蛋白、3 g胰酶、0.5 g脂肪酶，調(diào)節(jié)至pH 7.8±0.2，稀釋至500 mL，4℃保存待用。

仿生膽汁燒杯中加入30 mL NaCl溶液（175.3 g/L）、68.3 mL NaHCO3溶液（4.7 g/L）、4.2 mL KCl溶液（89.6 g/L）、0.2 mL HCl溶液（37%）、10 mL CaCl2溶液（22.2 g/L），再加入1 g牛血清蛋白、6 g膽汁，調(diào)節(jié)至pH 8.0±0.2，稀釋至500 mL，4℃保存待用。

2.4 牡蠣和蛤仔仿生提取液制備

稱取牡蠣和蛤仔樣品1 g（準(zhǔn)確至0.001 g），加入10 mL唾液，恒溫（37℃）振蕩5 min；加入150 mL胃液，繼續(xù)恒溫（37℃）振蕩2 h，取100 mL仿生消化食糜，于4℃以8000 r/min離心10 min，上層清液為胃仿生提取液；余下胃仿生消化食糜加入200 mL十二指腸液和80 mL膽汁，繼續(xù)恒溫（37℃）振蕩8 h后，取100 mL于4℃以8000 r/min離心10 min，取上層清液為腸仿生提取液，下層沉淀為仿生消解后的殘?jiān)７律崛∫河?℃保存待測。

2.5 牡蠣和蛤仔元素測定

稱取適量牡蠣和蛤仔樣品（準(zhǔn)確至0.001 g），加入8 mL濃HNO3、1 mL H2O2，微波消解。樣品仿生提取液和殘?jiān)鼌⒄者M(jìn)行，同時(shí)做試劑空白。原子吸收測定Fe、Cu，Zn，Cd的含量。

準(zhǔn)確量取Fe，Cu，Zn，Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/L）適量，用2%HNO3（V/V）稀釋成濃度分別為0.2，0.4，0.8，1.6和3.2 μg/mL的Fe，Cu，Zn，Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液，火焰原子吸收光譜法測定各元素的吸光度，繪制工作曲線。儀器的工作條件為：Fe，Cu，Zn，Cd波長分別為248.3，324.8，213.9和228.8 nm，狹縫為0.2，1.3，1.3和1.3 nm，乙炔流量均為2.0 L/min，空氣流量均為15 L/min，燃燒器高度均為7.5 mm。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法的準(zhǔn)確度

分別隨機(jī)選擇牡蠣和蛤仔樣品各2個(gè)，按仿生消解方法重復(fù)進(jìn)行3次，測定胃、腸提取液和殘?jiān)蠪e，Cu，Zn，Cd的含量，計(jì)算測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。以牡蠣和蛤仔為樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（表2）。Fe，Cu，Zn，Cd的最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，回收率在93%～103%之間，表明Fe，Cu，Zn，Cd測定的準(zhǔn)確度好，結(jié)果可靠。

表1 牡蠣和蛤仔樣品中Fe，Cu，Zn，Cd測定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）Table 1 Relative standard deviation of trace metal measurements for oyster and clam samples（%）

表2 牡蠣和蛤仔樣品中Fe，Cu，Zn，Cd的含量及其回收率Table 2 Trace metal contents and their recovery in oyster and clam samples

3.2 牡蠣和蛤仔中元素含量

如圖1所示，牡蠣和蛤仔樣品中Fe，Cu，Zn，Cd的總量呈現(xiàn)相同的分布趨勢，含量從高到低的順序?yàn)镕e＞Zn＞Cu＞Cd。牡蠣樣品中元素Fe，Cu，Zn和Cd的含量分別為1.69 mg/g，0.305 mg/g，0.957 mg/g和7.99 μg/g，蛤仔樣品中的Fe，Cu，Zn和Cd的含量分別為1.23 mg/g，0.028 mg/g，0.106 mg/g和1.75 μg/g。

3.3 胃、腸提取液中元素的含量

牡蠣樣品經(jīng)仿生消解后，提取液中微量元素的含量變化如圖2所示。微量元素在胃提取液中的含量明顯高于其在腸提取液中的含量，在殘?jiān)械暮縿t變化較大。牡蠣胃提取液中Fe，Cu，Zn和Cd的含量分別為0.674 mg/g，0.198 mg/g，0.620 mg/g和6.00 μg/g，是腸提取液的1.97，2.27，2.33和3.53倍。殘?jiān)蠪e的含量為0.675 mg/g，與胃提取液中Fe含量相同，而殘?jiān)蠧u，Zn和Cd的含量分別為0.020 mg/g，0.071 mg/g和0.29 μg/g，遠(yuǎn)低于其在胃和腸提取液中的含量。

圖1 牡蠣和蛤仔體元素含量Fig.1 Contents of elements in oyster and clam samples

圖2 牡蠣樣品仿生提取液中元素的含量Fig.2 Contents of elements in in vitro digestion of oyster samples

蛤仔樣品的胃、腸提取液和殘?jiān)形⒘吭氐暮孔兓鐖D3所示。胃、腸提取液中Fe的含量分別為0.292和0.268 mg/g，明顯低于殘?jiān)蠪e的含量。胃提取液中 Cu，Zn和 Cd的含量分別為0.0115 mg/g，0.0663 mg/g和1.39 μg/g，明顯高于殘?jiān)械暮俊?/p>

3.4 生物可給性

本研究中，以胃或腸提取液中微量元素的量占用于仿生消解的牡蠣或蛤仔樣品中微量元素總量的百分?jǐn)?shù)表示生物可給性。表3列出了牡蠣和蛤仔樣品中微量元素的生物可給性結(jié)果。牡蠣和蛤仔經(jīng)胃仿生液消解后，F(xiàn)e的可給性最低（39.9%，22.6%），Cu，Zn和Cd的可給性在59.5%～65.1%之間。牡蠣樣品經(jīng)腸仿生液消解后，F(xiàn)e，Cu，Zn和Cd的可給性在20.3%～24.1%之間。蛤仔樣品經(jīng)腸仿生液消解后，Cu的可給性最高（36.4%）、Cd的可給性最低（18.2%），而Fe，Zn的可給性基本相同（表3）。牡蠣和蛤仔樣品中分別有40.7%和44.7%的Fe留在消解的殘?jiān)校鳦u，Zn和 Cd在殘?jiān)械牧績H占總量的12.3%～16.9%。

圖3 蛤仔樣品仿生提取液中元素的含量Fig.3 Contents of elements in in vitro digestion of clam samples

表3 牡蠣和蛤仔樣品中元素的生物可給性（%）Table 3 Bioaccessibility of 4 trace elements in oyster and clam samples（%）

文獻(xiàn)［18］報(bào)道，以單層脂質(zhì)體為細(xì)胞生物膜模型，研究海帶和紫菜水煎液中微量金屬的形態(tài)，經(jīng)仿生消解后，F(xiàn)e，Zn等以不同的形態(tài)存在。紫菜中Cd的形態(tài)分析［19］發(fā)現(xiàn)，紫菜經(jīng)全仿生消解后，Cd以谷胱甘肽-Cd、植物螯合肽-Cd等形態(tài)存在。牡蠣和蛤仔樣品經(jīng)全仿生消解后，超過50%的Fe和超過80%的Cu，Zn，Cd從基體上釋放出來，可以推斷，這些元素也存在不同的形態(tài)。消化酶可以通過影響微量金屬配合物的配體組成，從而對(duì)海帶和紫菜中的微量元素的形態(tài)分布和生物可給性產(chǎn)生影響［18］。在消化酶的作用下，牡蠣和蛤仔樣品產(chǎn)生許多小分子有機(jī)物，與金屬元素形成配位競爭反應(yīng)，金屬的配位能力也不相同，因此影響微量元素的形態(tài)和生物可利用性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與僅測定元素的總量相比，測定仿生提取液中微量元素的含量，能更準(zhǔn)確地反映通過膳食途徑，牡蠣和蛤仔樣品中必需元素Fe，Cu，Zn對(duì)人體可用量，以及有害元素Cd對(duì)食用者的健康危害。

4 結(jié)論

牡蠣樣品胃提取液中Fe，Cu，Zn，Cd的含量明顯高于其在腸提取液中的含量。殘?jiān)蠧u，Zn，Cd的含量很低，F(xiàn)e的含量較高，與胃提取液中的含量相同。蛤仔樣品胃、腸提取液和殘?jiān)蠪e，Cu，Zn，Cd的含量差異較大。Fe在殘?jiān)械暮孔罡撸珻u，Zn，Cd在胃提取液中的含量最高、在腸提取液和殘?jiān)械暮枯^低。牡蠣和蛤仔樣品經(jīng)仿生消解后，微量元素胃仿生的生物可給性高于腸仿生的生物可給性。經(jīng)全仿生消解后，F(xiàn)e的可給性低，為46%～60%，而Cu，Zn，Cd的可給性比較高，在83%～88%之間。

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This work was supported by the Key Projects in the National Science&Technology Pillar Program（No.2009BADB7B02）

Bioaccessibility of Microamount Metal Elements in Oyster and Cam Samples Using in vitro Digestion

WANG Zeng-Huan*，WANG Xu-Nuo，LIN Qin，CHEN Cheng-Tong，CHEN Ying-Na
（Key Lab.of Fishery Ecology Environment，Guangdong Province；South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences；Key Lab.of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China）

A bionic method，in vitro digestion，was used for the pretreatment of oyster and clam samples.The oyster and clam samples were digested at 37℃ under the action of bionic digestive juice including saliva，gastric juice and intestinal juice.The contents of trace metals in in vitro digestion extracts（gastric juice extracts and intestinal juice extracts）were determined by atomic absorption spectrometry.The bioaccessibility of trace metals was assessed using the contents of trace metals in bionic extracts.The results showed that the contents of Fe，Cu，Zn and Cd in gastric juice extracts of in vitro digestion on oysters were higher than those in intestinal juice extracts.The contents of Fe and Cu in gastric juice extracts of in vitro digestion on clam were not obviously different with that of in intestinal juice extracts.Otherwise，the contents of Zn and Cd in gastric juice extracts were much higher than those of in intestinal juice extracts.The bioaccessibility of Fe，Cu，Zn and Cd in oysters using in vitro digestion was 60.2%，83.6%，83.1%and 76.8%，respectively. The bioaccessibility of Fe，Cu，Zn and Cd in clams was 46.3%，86.3%，85.3%and 87.7%，respectively. The results will provide a scientific basis for further researches such as bioaccumulation and bioavailability of trace metal in oysters and clams，evaluation of the health risk of Cd from oyster and clam consumption.

In vitro digestion；Bioaccessibility；Atomic spectrometry；Microamount metal；oyster and clam

18 August 2015；accepted 16 October 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150655

2015-08-18收稿；2015-10-16接受

本文系國家科技支撐計(jì)劃課題（No.2009BADB7B02）、農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（No.NYJG201306）、中央級(jí)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（Nos.2013YD08，2015TS16）資助

*E-mail：zh-wang1211@163.com