彈性假黃色瘤一例ABCC6基因突變分析

李敏 周乃慧 宋琳毅 楊子良 王淼淼 余秀琴

215006蘇州大學附屬第一醫院皮膚科

彈性假黃色瘤一例ABCC6基因突變分析

李敏 周乃慧 宋琳毅 楊子良 王淼淼 余秀琴

215006蘇州大學附屬第一醫院皮膚科

目的報告1例彈性假黃色瘤，并檢測ABCC6基因突變情況。方法分析1例彈性假黃色瘤先證者的臨床資料，并收集其父母、兒子及100例無親緣關系的健康對照的外周血，提取基因組DNA，PCR擴增ABCC6基因編碼區31個外顯子，并進行DNA直接測序與ABCC6編碼蛋白質功能預測。結果先證者父母及兒子表型均正常。基因突變分析顯示，先證者存在ABCC6基因c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）的復合雜合突變，先證者母親為c.3703C＞T（p.R1235W）雜合突變攜帶者，先證者父親和兒子為c.373G＞A（p.E125K）雜合突變攜帶者，而100例無親緣關系的健康對照均未檢測到該兩種突變。物種間序列比對分析發現，ABCC6編碼蛋白質第125位谷氨酸和第1235位精氨酸為進化高度保守的序列，SIFT和Polyphen?2軟件預測c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）突變為有害變異位點。結論ABCC6基因c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）的復合雜合突變可能是該例彈性假黃色瘤患者發病的原因。

彈性假黃瘤；DNA突變分析；皮膚表現；雜合子；基因，ABCC6

彈性假黃色瘤（pseudoxanthoma elasticum，PXE）是一種主要累及彈性纖維、并可侵犯人體多種器官和系統的少見遺傳性疾病，主要表現為皮膚、眼和心血管系統損害［1?2］，發病率1∶50 000 ～ 1∶70 000，女性多于男性［3］。已經證實，PXE的致病基因為ABCC6［4］。現報告1例PXE，并分析其ABCC6基因突變情況。

對象與方法

一、對象

先證者女，47歲，已婚，蘇州人。因左眼視力下降9月余，加重2個月于2014年12月至蘇州大學附屬理想眼科醫院就診。既往近視20年，戴鏡矯正。在3歲時家人即發現其頸部、腋下、下腹、腹股溝處膚色及略呈黃色的鵝卵石樣丘疹，隨年齡增長皮疹稍有增多，無明顯自覺癥狀，未引起重視。否認系統性疾病史，父母體健，非近親結婚；育有1子，家族中無類似疾病及遺傳病史。體檢：先證者各系統檢查未見異常。皮膚科檢查：頸部、腋下、下腹及腹股溝處膚色或略呈黃色的丘疹，沿皮紋分布，外觀似鵝卵石樣（圖1）。頸部皮損組織病理：表皮大致正常，真皮中部見較多斷裂、腫脹、呈集簇藍染的嗜堿性碎片狀或顆粒狀物（圖2）。彈性纖維染色（間苯二酚法）：真皮中部深藍黑色彈性纖維腫脹、斷裂，呈破毛線團狀，而正常皮膚組織真皮中部深藍黑色彈性纖維較長，呈波浪狀，走向與表皮平行。鈣染色（von Kossa法）：真皮中部可見棕褐色顆粒狀和碎片狀鈣沉積。視力檢查：右眼0.05，矯正-2.5DS/-3.0DC*85=0.5+；左眼 0.04，矯正-1.75DS/*85=0.04。眼底檢查：雙眼視盤周圍呈一環形條紋，由此向各個方向放射狀發出數條不規則細條紋，右眼細條紋未侵及黃斑，左眼一細條紋侵及黃斑區。眼底熒光造影：雙眼眼底血管樣條紋，以左眼受累明顯，其中左眼血管樣條紋侵及黃斑區。實驗室檢查：血尿常規、生化全套、胸部X線片、心臟彩超、雙下肢血管超聲及頸部血管超聲未見明顯異常。

圖1 先證者皮損表現 頸部（1A）及腹股溝處（1B）可見膚色或略呈黃色的鵝卵石樣排列的丘疹

圖2 先證者頸部皮損組織病理 表皮大致正常，真皮中部見較多斷裂、腫脹、呈集簇藍染的嗜堿性碎片狀或顆粒狀物（2A：HE×100；2B：HE×400）

先證者父母及兒子各系統檢查、皮膚科檢查、眼底檢查、心臟彩超、雙下肢血管超聲及頸部血管超聲均未見異常。

在征得先證者及其家屬同意后，采集先證者、先證者父母及兒子外周血各5 ml，并采集100例無親緣關系的健康人外周血5 ml作為對照。

二、DNA測序

1.DNA提取：用DNA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取基因組DNA。

2.Touch?down PCR擴增及DNA測序：通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov檢索ABCC6基因mRNA序列，序列對比得到ABCC6基因的全基因組序列，應用DNAMAN軟件分別設計覆蓋ABCC6基因31個外顯子的29對引物（表1）。PCR反應體系（50 μl）：模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶2.5 U，dNTP（10 mmol/L）1 μl，Taq緩沖液5 μl，MgCl2（25 mmol/L）5 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min，94℃變性30 s，退火30 s，退火溫度63～58℃，前10個循環每個循環降低0.5℃，降至58℃以后每循環維持退火58℃，72℃延伸40～50 s，擴增35個循環，最后72℃修復延伸5～8 min。PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，純化回收，ABI3730XL測序儀測序。

3.ABCC6編碼蛋白質序列保守性分析及蛋白功能預測：對人、小鼠、大鼠、牛、狗、家兔、大熊貓、猩猩、家貓和鴨嘴獸10種物種的ABCC6編碼蛋白質序列進行比對，分析蛋白序列的保守性。應用SIFT和Polyphen?2軟件預測p.E125K和p.R1235W兩個突變點是否為有害突變。

結 果

一、表型分析

根據PXE的診斷標準［5］，先證者診斷為PXE，除皮膚及眼受累外，未見心血管系統及胃腸道受累。先證者父母及兒子表型均正常（圖3）。

表1 ABCC6基因外顯子PCR擴增引物及產物長度

圖3 彈性假黃色瘤家系圖

二、DNA直接測序

將DNA直接測序結果與NCBI數據庫公布的ABCC6基因序列進行比對，發現先證者ABCC6基因第4號外顯子第373位堿基由G突變成A，造成125位氨基酸由谷氨酸變成賴氨酸［c.373G＞A（p.E125K）］；同時第26號外顯子第3703位堿基由C變成T，造成1235位氨基酸由精氨酸變成色氨酸［c.3703C＞T（p.R1235W）］。該先證者存在ABCC6基因c.373G ＞ A（p.E125K）和c.3703C ＞ T（p.R1235W）的復合雜合突變，先證者母親為c.3703C＞T（p.R1235W）雜合突變攜帶者，先證者父親和兒子為c.373G＞A（p.E125K）雜合突變攜帶者（圖4），而100例健康對照中均未檢測到該兩種突變（基因序列版本：GRCh37/hg19）。

三、ABCC6編碼蛋白質功能預測

物種間序列比對分析發現，ABCC6編碼蛋白質第125位谷氨酸和第1235位精氨酸序列為進化高度保守的序列。SIFT軟件對p.E125K突變和p.R1235W突變的功能預測結果為Affect Protein Function，其 score分別為0.01和 0.00。Polyphen?2軟件的預測結果為可能有害，p.E125K突變和p.R1235W突變的score分別為0.918和1.00。SIFT和 Polyphen?2軟件預測p.E125K突變和p.R1235W突變均為有害變異位點，可能影響蛋白質功能。

討 論

PXE是一種少見的常染色體隱性遺傳性疾病，主要累及彈性組織，可侵犯人體多個器官和系統，臨床上主要表現為皮膚、眼和心血管系統的損害［1?3］。PXE尚可合并胃腸道損害，其中以消化道出血最為嚴重。本研究中，先證者為1例散發病例，結合其皮損表現、皮損組織病理學特點及眼底血管樣條紋可明確診斷，但未見明顯心血管系統和消化系統損害。

已證實PXE發病與ABCC6基因突變有關［4］。ABCC6基因定位于染色體16p13.1，屬于跨膜轉運蛋白ATP結合基因家族，包含31個外顯子，其mRNA編碼由1 503個氨基酸組成的跨膜轉運蛋白即多藥抗藥性相關蛋白（multidrug?resistance associated protein 6，MRP6）［6］。ABCC6 編碼蛋白質在人肝臟和腎臟中表達最高，皮膚、血管壁和視網膜等組織中僅低水平表達。ABCC6基因突變可引起常染色體隱性遺傳性PXE，推測PXE屬于代謝性疾病，ABCC6基因編碼蛋白質MRP6能夠將肝臟的代謝物轉運至血循環和外周組織，ABCC6基因突變后，具有正常功能的MRP6蛋白減少甚至缺失，引起與彈性纖維有高親和力的物質在組織內蓄積，使彈性纖維發生異常鈣化、變性、腫脹或斷裂等，從而導致PXE患者出現皮膚、眼和心血管等多器官、多系統的損害。但目前ABCC6基因突變后導致PXE發病的確切機制尚不完全明確［7?10］。迄今已報道ABCC6致病性突變位點300余個，其中高加索患者以c.3421C ＞ T（p.R1141X）突變和del23?29（23?29號外顯子之間的大片段缺失）突變最為常見，占所有突變的30%以上［11］。而中國PXE患者ABCC6基因突變的研究較少。2008年，楊梅等［12］報道1例散發PXE患者ABCC6基因第28號外顯子c.3940C＞T（p.R1314W）突變。2015年，Jin等［13］對22例中國PXE患者ABCC6基因突變分析后發現包括錯義突變、插入突變和缺失突變在內的17種致病性突變，但該兩項研究均未發現中國PXE患者存在ABCC6基因c.3421C＞T（p.R1141X）突變和del23?29突變，提示PXE患者ABCC6基因突變可能存在一定的種族差異。

本研究對1例典型的PXE散發患者的ABCC6基因的31對外顯子進行測序，發現先證者存在第4號外顯子c.373G＞A（p.E125K）和第26號外顯子c.3703C＞T（p.R1235W）的復合雜合突變，分別來自其父母，其兒子僅存在c.373G＞A（p.E125K）雜合突變，其父母及兒子均為單個雜合突變攜帶者，仍有一個拷貝正常，故未發病，表型均正常；本例先證者符合常染色體隱性遺傳模式。查閱文獻，患者存在的c.373G＞A（p.E125K）突變和c.3703C＞T（p.R1235W）突變先后分別以純合和復合雜合的形式在PXE患者中有相關報道［13］，但未檢索到PXE患者同時存在c.373G ＞A（p.E125K）和c.3703C ＞T（p.R1235W）復合雜合突變的報道。ABCC6編碼蛋白質的第125位谷氨酸為極性帶負電荷的氨基酸（酸性氨基酸），p.E125K突變后賴氨酸是極性帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸）；第1235位精氨酸為極性帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸），p.R1235W突變后色氨酸是非極性氨基酸（疏水氨基酸）。另外，物種間序列比對發現，ABCC6編碼蛋白質的第125位谷氨酸和第1235位精氨酸這兩個氨基酸位點屬于進化高度保守的序列，SIFT和Polyphen?2軟件預測p.E125K和p.R1235W均為有害變異位點。本文結果提示，c.373G ＞A（p.E125K）和c.3703C ＞T（p.R1235W）的復合雜合突變很可能影響了ABCC6編碼蛋白質的結構與功能，從而導致PXE，但具體機制尚不明確，有待進一步的功能學研究證實。這些結果進一步豐富了PXE致病基因ABCC6的突變譜，為今后對PXE患者進行遺傳咨詢和產前診斷奠定了一定的基礎。

志謝中國醫學科學院皮膚病醫院病理科曾學思教授、蘇州大學附屬第一醫院眼科蔡琴華主任醫師、李龍標主任醫師、蘇州市立醫院東區皮膚科馮雨苗副主任醫師

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Mutation analysis of the ABCC6 gene in a patient with pseudoxanthoma elasticum

LiMin,Zhou Naihui,Song Linyi,Yang Ziliang,Wang Miaomiao,Yu Xiuqin
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China Corresponding author:Zhou Naihui,Email:zhounaihui@163.com

ObjectiveTo report a case of pseudoxanthoma elasticum,and to analyze mutations of the ABCC6 gene in the family with pseudoxanthoma elasticum.MethodsClinical data were obtained from a female patient with pseudoxanthoma elasticum and analyzed.Blood samples were collected from the proband,her parents and son,as well as 100 unrelated healthy human controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 31 exons of the ABCC6 gene followed by direct DNA sequencing.The function of the protein encoded by the ABCC6 gene was predicted.ResultsThe phenotypes of the patient′s parents and son were all normal.Mutation analysis of the ABCC6 gene revealed compound heterozygous mutations c.373G＞A（p.E125K）and c.3703C＞T（p.R1235W）in the proband,a heterozygous mutation c.3703C ＞ T（p.R1235W）in the proband′s mother,and a heterozygous mutation c.373G ＞ A（p.E125K）in the proband′s father and son.However,neither of the above mutations was found in the 100 unrelated healthy controls.Interspecific sequence alignment showed that glutamic acid at position 125 and arginine at position 1235 of the protein encoded by the ABCC6 gene were highly evolutionarily conserved.As SIFT and Polyphen?2 softwares showed,the mutations c.373G ＞ A（p.E125K）and c.3703C ＞ T（p.R1235W）were both predicted to be detrimental variations.ConclusionThe compound heterozygous mutations c.373G＞A（p.E125K）and c.3703C ＞ T（p.R1235W） in the ABCC6 gene may be responsible for the occurrence of pseudoxanthoma elasticum in this patient.

Pseudoxanthoma elasticum;DNA mutational analysis;Skin manifestations;Heterozygote;Genes,ABCC6

周乃慧，Email：zhounaihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.002

江蘇省自然科學基金（BK20140294、BK20130267）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140294,BK20130267）

2016?05?23）

（本文編輯：吳曉初）