沙利度胺對人真皮成纖維細胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

李玉平 張曉光 郭兵申 白艷芝 張麗華 武辰楠 李素月

050000石家莊，河北醫科大學第二醫院皮膚科（第六作者現在首都兒科研究所附屬兒童醫院皮膚科）

沙利度胺對人真皮成纖維細胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

李玉平 張曉光 郭兵申 白艷芝 張麗華 武辰楠 李素月

050000石家莊，河北醫科大學第二醫院皮膚科（第六作者現在首都兒科研究所附屬兒童醫院皮膚科）

目的研究沙利度胺對健康人真皮成纖維細胞增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白α1 mRNA和Ⅰ型膠原蛋白α1表達的影響，初步探討沙利度胺抗真皮纖維化的潛在作用。方法原代培養人正常真皮成纖維細胞，選用第4代成纖維細胞用于后續試驗。細胞分為3組，分別用10?3、10?4、10?5mol/L沙利度胺處理，同時設空白對照組（僅用DMEM培養基處理）。24 h后，采用CCK?8法檢測細胞增殖活性，熒光定量PCR法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白α1 mRNA表達，Western印跡法測定Ⅰ型膠原蛋白α1表達。結果10?3、10?4mol/L沙利度胺組細胞存活率為77.40%±4.25%、88.56%±6.43%，均顯著低于空白對照組（100.00%±6.74%，均P＜0.05），但10?5mol/L沙利度胺組（96.66% ± 1.098%）與空白對照組之間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。10?3、10?4、10?5mol/L沙利度胺組Ⅰ型膠原蛋白α1 mRNA相對表達水平分別為0.279±0.025、0.427±0.040、0.658±0.032，均顯著低于空白對照組（1.016±0.003，均P＜0.05），Ⅰ型膠原蛋白α1表達水平亦顯著低于空白對照組（均P＜0.05）。Ⅲ型膠原蛋白α1 mRNA表達水平在10?3、10?4、10?5mol/L沙利度胺組分別為0.551 ± 0.039、0.756 ± 0.025、0.826 ± 0.018，與空白對照組（0.988±0.012）比較顯著降低（均P＜0.05）。結論沙利度胺在一定濃度范圍內可抑制健康人真皮成纖維細胞增殖，并抑制Ⅰ型膠原蛋白α1 mRNA和蛋白表達及Ⅲ型膠原蛋白α1 mRNA表達。

沙立度胺；成纖維細胞；細胞增殖；膠原Ⅰ型；膠原Ⅲ型

以往研究發現，沙利度胺具有抗血管生成、抗炎、免疫調節等多種生物學作用，在皮膚科中已用于皮膚型紅斑狼瘡、結節性癢疹等疾病的治療［1?3］。據報道，沙利度胺可通過抑制肺成纖維細胞增殖［4?5］、抑制轉化生長因子（TGF）?β1［6］和膠原蛋白的表達而抑制肝纖維化、肺纖維化等［7?8］。而且，沙利度胺能抑制TGF?β1刺激后正常真皮及瘢痕疙瘩成纖維細胞纖連蛋白的表達及分泌［5］。病理性瘢痕及皮膚纖維化性疾病主要是由成纖維細胞過度生長和膠原蛋白合成、過度沉積造成，抑制成纖維細胞增殖及膠原合成，是防治該類疾病的關鍵。我們通過研究沙利度胺在不同濃度下對健康人真皮成纖維細胞增殖活性、Ⅰ型膠原蛋白α1（COLⅠA1）和Ⅲ型膠原蛋白α1（COLⅢA1）mRNA及COLⅠA1表達水平的影響，初步探討沙利度胺抗真皮纖維化的潛在作用，為術后瘢痕形成的預防及病理性瘢痕的臨床治療和預后評估提供新思路。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

沙利度胺（常州制藥廠有限公司，原料純度100%），DMEM培養基（美國Gibco公司），Ⅰ型膠原酶（美國Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），熒光定量試劑盒Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits（SYBR Green I）（加拿大 Bio Basic Inc公司），CCK?8試劑盒（日本同仁化學試劑公司），兔抗人COLⅠA1單克隆抗體［百奇生物科技（蘇州）有限公司］，山羊抗兔二抗（美國CST公司），SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑（北京中衫生物科技有限公司），DU800型分光光度計（美國Beckman Coulter公司），IX71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），680型酶標儀（美國Bio?Rad公司），化學發光成像系統（上海勤翔科學有限公司）。

二、人真皮成纖維細胞的分離和培養

取健康青年包皮，修剪去除皮下組織，用胰蛋白酶分離真皮和表皮。用0.2%膠原酶在37℃孵箱中消化真皮4～6 h，加PBS平衡鹽溶液稀釋消化酶，取上清液離心，棄上清液，加入含10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM培養基，接種至T?25培養瓶中，置37℃、5%CO2孵箱中培養，取4～5代對數生長期細胞進行實驗。本研究已通過河北醫科大學第二醫院醫學倫理委員會批準，受試者簽署知情同意書。

三、沙利度胺工作液配制以及二甲基亞砜（DMSO）對成纖維細胞增殖的影響

1.工作液配制：用DMSO配制0.2 mol/L的沙利度胺儲存液，-20℃保存備用。10 ml離心管中加入950 μl含5%胎牛血清的DMEM，常溫放置，取50 μl沙利度胺儲存液緩慢注入上述DMEM中，吹打混勻至離心管內無絮狀物析出，得到濃度為10?3mol/L的沙利度胺工作液，依次稀釋10倍得到10?4、10?5mol/L沙利度胺工作液［5，9?11］。避光-20 ℃保存。

2.DMSO對成纖維細胞增殖的影響：本實驗中，10?3、10?4、10?5mol/L 沙利度胺工作液里所含 DMSO濃度分別為5 × 10?3、5 × 10?4、5 × 10?5mol/L。將人真皮成纖維細胞分為3組，分別用5 × 10?3、5 × 10?4、5 ×10?5mol/L DMSO處理24 h，同時設空白對照組（不含DMSO），用噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖活性，結果示5 × 10?3、5 × 10?4、5 × 10?5mol/L DMSO組與空白對照組細胞增殖活性分別為96.59%±11.37%、99.64% ±9.48%、100.61% ±10.97%、100.00% ±6.74%，各DMSO組與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

四、CCK?8法檢測沙利度胺對健康人真皮成纖維細胞增殖活性的影響

取成纖維細胞單細胞懸液，每孔200 μl（3×104/ml）接種于96孔板，顯微鏡下觀察，在其生長面積達50% ～ 60%時，棄上清液，分別加入含10?3、10?4、10?5mol/L沙利度胺的培養液培養，并設立空白對照，其內為等量DMEM培養液。每組設5個復孔。培養24 h后加入CCK?8 試劑20 μl繼續孵育3 h，用酶標儀于560 nm波長處讀取吸光度值（A值）。獨立重復試驗3次。細胞存活率=（實驗組A值-調零孔A值）/（空白對照組A值-調零孔A值）×100%。

五、熒光定量PCR法檢測COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA表達

制備4.5×104/ml的單細胞懸液，定量接種，分組同上，每組設3個重復樣本。24 h后，各組細胞內分別加入Trizol試劑1 ml提取各組細胞總RNA，12 g/L凝膠電泳檢測其完整性。引物序列應用DNAMAN軟件設計，由北京賽百盛生物有限公司合成，COLⅠA1引物：正向 5′?TGTGCGATGACGTGAT CTGTA?3′，反向5′?GTGGTTTCTTGGTCGGTGGGT?3′。COLⅢA1 引物：正向 5′?AGCCTCCAACTGCTC CTA?3′，反向 5′?GTCCTCCTACTGCTACTCCA?3′。按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以此為模板進行聚合酶鏈反應，置于AB 7300 PCR儀，95℃變性5 min、95℃變性30 s、55℃退火15 s、72℃延伸30 s，40個循環；產物在72℃延伸5 min。在60～95℃進行熔解曲線分析。采用2?△△Ct法計算各樣品目的基因相對表達水平。

六、Western印跡法檢測COLⅠA1表達

制備106/ml的單細胞懸液，定量接種，實驗分為空白對照組、10-3mol/L沙利度胺組、10-4mol/L沙利度胺組、10-5mol/L沙利度胺組。作用24 h后，將處理后的細胞吸盡培養基，冷PBS漂洗2次，加入含1 ml蛋白酶+4 μl蛋白酶抑制劑的細胞裂解液冰上裂解15 min，4℃ 15 000×g，離心 20 min，取上清液溶解蛋白質，BCA（bicinchonininc acid）法測定蛋白濃度。加入5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，煮沸變性，總蛋白60 μg上樣到12 g/L SDS?聚丙烯酰胺濃縮膠凝膠電泳。將蛋白質轉印至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉1 h，漂洗后將膜分別放入含COLⅠA1（1∶500稀釋）及3磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）一抗溶液中4℃孵育過夜，洗膜后再放入羊抗兔二抗溶液室溫孵育60 min。化學發光儀中發光成像，并經ImageJ對蛋白條帶進行灰度分析，計算COLⅠA1相對表達水平，即目的蛋白與GADPH灰度的比值。

七、數據統計分析

結 果

一、沙利度胺對健康人真皮成纖維細胞增殖活性的影響

10?5mol/L沙利度胺組與空白對照組比較，細胞存活率差異無統計學意義（P＞0.05），但10?3、10?4mol/L組和空白對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

二、沙利度胺對健康人真皮成纖維細胞COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA及COLⅠA1蛋白表達的影響

與空白對照組比較，10?3、10?4、10?5mol/L沙利度胺組COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA及COLⅠA1蛋白表達水平均顯著降低（均P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 Western印跡法檢測人真皮成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白α1鏈（COLⅠA1）蛋白相對表達水平 1：10?3mol/L沙利度胺組；2：10?4mol/L沙利度胺組；3：10?5mol/L沙利度胺組；4：空白對照組。GAPDH：3磷酸甘油醛脫氫酶

表1 沙利度胺對健康人真皮成纖維細胞增殖活性、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白（COLⅠ、Ⅲ）mRNA（2?△△Ct）以及Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）a相對表達水平的影響（±s）

表1 沙利度胺對健康人真皮成纖維細胞增殖活性、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白（COLⅠ、Ⅲ）mRNA（2?△△Ct）以及Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）a相對表達水平的影響（±s）

注：細胞存活率測定：n=5；mRNA表達及蛋白相對表達量測定：n=3。a：用目的蛋白與3磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）蛋白灰度比值表示；b：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組10?3mol/L沙利度胺組10?4mol/L沙利度胺組10?5mol/L 沙利度胺組F值P值細胞存活率（%）100.00±6.74 77.40±4.25b 88.56±6.43b 96.66±10.98 20.701 0.000 COLⅠA1mRNA 1.016±0.003 0.279±0.025 0.427±0.040b 0.658±0.032b 387.642 0.000 COLⅢA1mRNA 0.988±0.012 0.551±0.039b 0.756±0.025b 0.826±0.018b 148.730 0.000 COLⅠA1蛋白1.773±0.059 0.279±0.020b 0.926±0.048b 1.523±0.027b 72.479 0.000

討 論

成纖維細胞是皮膚真皮組織中的主要細胞成分，能合成以膠原蛋白為主的細胞外基質，其增殖及合成細胞外基質的特性對于正常真皮結締組織構成、皮膚創傷修復時肉芽組織形成和真皮纖維化性疾病的發生均具有極其重要的意義。COLⅠA1、COLⅢA1作為真皮組織的主要框架結構，在維持組織的完整性及瘢痕形成過程中發揮重要作用［12?13］。我們研究發現，10?3、10?4mol/L沙利度胺能顯著抑制成纖維細胞增殖，而10?5mol/L沙利度胺對正常成纖維細胞增殖活性無影響。這與國外研究沙利度胺可在一定濃度范圍內抑制肺成纖維細胞增殖［9］及胚胎成纖維細胞［14］的結論相符。而且，上述3種濃度的沙利度胺均可顯著抑制健康人真皮成纖維細胞COLⅠA1、COLⅢA1 mRNA的表達，而病理性瘢痕中主要以Ⅰ型膠原增多為主，因此，我們通過Western印跡法對COLⅠA1的表達進行測定，發現沙利度胺可抑制COLⅠA1表達。而沙利度胺在10?3mol/L濃度時，對細胞增殖活性的抑制作用可達22%，這也應是該組COLⅠA1基因和蛋白水平降低的原因之一。沙利度胺是否通過影響膠原合成及代謝因子而影響膠原蛋白表達有待進一步研究。

綜上所述，沙利度胺在一定濃度范圍內對健康人真皮成纖維細胞增殖活性及COLⅠA1、COLⅢA1具有抑制作用，且10?5mol/L沙利度胺可在對細胞增殖沒有影響的情況下顯著抑制COLⅠA1的表達。

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Effects of thalidomide on proliferative activity of and expressions of collagenⅠandⅢin human dermal fibroblasts

Li Yuping,Zhang Xiaoguang,Guo Bingshen,Bai Yanzhi,Zhang Lihua,Wu Chennan,Li Suyue
Department of Dermatology,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China（the current affiliation of the sixth author was Department of Dermatology,Children′s Hospital Affiliated to Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100020,China）
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Li Yuping,Email:lyuping@medmail.com.cn

Li Yuping,Email:lyuping@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate effects of thalidomide on proliferative activity of as well as expressions of collagenⅠα1 and Ⅲα1 mRNAs and collagenⅠα1 protien in human dermal fibroblasts（HDFs）,and to preliminarily explore the potential role of thalidomide in the fight against dermal fibrosis.MethodsHDFs were isolated from the foreskin of a healthy young man,and subjected to primary culture.The fourth?passage HDFs were used in the following experiment.Some HDFs were divided into 3 groups to be treated with 10?3,10?4and 10?5mol/L thalidomide respectively,and other HDFs treated with DMEM alone served as the blank control group.After 24?hour culture,cell counting kit?8（CCK?8）assay was performed to evaluate the proliferative activity of HDFs,fluorescence?based quantitative PCR to measure the mRNA expressions of collagen Ⅰα1 andⅢα1,and Western?blot analysis to determine the protein expression of collagen Ⅰα1.ResultsCompared with the blank control group,the 10?3?and 10?4?mol/L thalidomide groups both showed significantly decreased cell survival rates（77.40% ±4.25%and 88.56% ±6.43%vs.100.00% ±6.74%,bothP＜ 0.05）,but the 10?5?mol/L thalidomide group showed no significant difference（96.66% ± 1.098%,P＞0.05）.Compared with the blank control group,the 10?3?,10?4?and 10?5?mol/L thalidomide groups all showed significantly lower mRNA and protein expressions of collagenⅠα1（mRNA:0.279±0.025,0.427±0.040 and 0.658±0.032vs.1.016±0.003;protein:0.279±0.020,0.926±0.048 and 1.523±0.027vs.1.773±0.059;allP＜0.05）.In addition,the mRNA expressions of collagen Ⅲα1 were also significantly weaker in the 10?3?,10?4?and 10?5?mol/L thalidomide groups compared with the blank control group（0.551±0.039,0.756±0.025 and 0.826±0.018vs.0.988±0.012,allP＜ 0.05）.ConclusionThalidomide within a certain range of concentrations can inhibit the proliferation of HDFs,as well as expressions of collagenⅠα1 mRNA and protein and collagenⅢα1 mRNA.

Thalidomide;Fibroblasts;Cell proliferation;Collagen type I;Collagen typeⅢ

李玉平，Email：lyuping@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.006

河北省2013年醫學科學研究重點課題計劃（2013019）

Fund program:Key Project of Medical Scientific Research Program in Hebei Province in 2013（2013019）

2016?04?29）

（本文編輯：尚淑賢）